2.1  电离辐射引发髓核细胞衰老  未辐射髓核细胞呈多边形、梭形、带有短突触；而电离辐射后细胞呈圆形，突触为细长丝状，细胞质减少呈透亮，细胞核内出现空泡，出现明显老化。SA-β-gal染色显示，与正常髓核细胞[(3.27±0.23)%]相比，辐射组细胞中SA-β-gal染色阳性率[(72.27±8.69)%]升高(P < 0.05)，见图1。

2.2  circPVT1、let-7在衰老髓核细胞中的表达  与正常髓核细胞相比，辐射组细胞中circPVT1 mRNA表达明显降低(1.05±0.04，0.38±0.07)，而let-7 mRNA表达明显升高(1.09±0.06，1.59±0.38)，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3  共转染后各组髓核细胞circPVT1、let-7的表达  与空白组、si-NC+anti-NC组相比，si-circPVT1+anti-NC组circPVT1 mRNA表达降低，let-7 mRNA表达升高，si-NC+anti-let-7组circPVT1 mRNA表达升高，let-7 mRNA表达降低(P < 0.05)。si-circPVT1+anti-let-7组circPVT1 mRNA表达高于si-circPVT1+anti-NC组，低于si-NC+anti-let-7组；let-7 mRNA表达低于si-circPVT1+anti-NC组，高于si-NC+anti- let-7组(P < 0.05)，见表1。

2.4  共转染后各组髓核细胞增殖抑制情况  随着细胞培养时间延长，髓核细胞增殖抑制率逐渐升高；在同一时间点，与空白组、si-NC+anti-NC组相比，si-circPVT1+anti-NC组细胞增殖抑制率升高，si-NC+anti-let-7组细胞增殖抑制率降低(P < 0.05)。si-circPVT1+anti-let-7组细胞增殖抑制率高于si-NC+anti-let-7组，低于si-circPVT1+anti-NC组(P < 0.05)，见表2。

2.5  共转染后各组髓核细胞克隆形成能力  与空白组、si-NC+anti-NC组相比，si-circPVT1+anti-NC组细胞克隆形成数量降低，si-NC+anti-let-7组细胞克隆形成数量升高(P < 0.05)。si-circPVT1+anti-let-7组细胞克隆形成数量高于si-circPVT1+anti-NC组，低于si-NC+anti-let-7组(P < 0.05)，见图2和表3。

2.6  共转染后对髓核细胞衰老活性的影响  SA-β-gal染色显示，与空白组、si-NC+anti-NC组相比，si-circPVT1+ anti-NC组SA-β-gal染色阳性率升高，si-NC+anti-let-7组SA-β-gal染色阳性率降低(P < 0.05)。si-circPVT1+anti-let-7组SA-β-gal染色阳性率低于si-circPVT1+anti-NC组，高于si-NC+anti-let-7组(P < 0.05)，见表4。

2.7  共转染后对髓核细胞衰老相关蛋白表达的影响  与空白组、si-NC+anti-NC组相比，si-circPVT1+anti-NC组p21、p27蛋白表达显著升高，si-NC+anti-let-7组p21、p27蛋白表达显著降低(P < 0.05)。si-circPVT1+anti-let-7组p21、p27蛋白表达低于si-circPVT1+anti-NC组，高于si-NC+anti-let-7组(P < 0.05)，见图3和表5。

2.8  共转染后对髓核细胞let-7靶标的影响  与空白组、si-NC+anti-NC组相比，si-circPVT1+anti-NC组HMGA2、KRAS蛋白表达显著降低，si-NC+anti-let-7组HMGA2、KRAS蛋白表达显著升高(P < 0.05)。si-circPVT1+anti-let-7组HMGA2、KRAS蛋白表达低于si-NC+anti-let-7组，高于si-circPVT1+anti-NC组(P < 0.05)，见图4和表6。

2.9  双荧光酶素活性实验验证let-7对HMGA2、KRAS靶向作用  TargetScan预测显示在HMGA2、KRAS mRNA的3’-UTR中存在let-7靶位点。双荧光酶素活性检测显示，与NC+HMGA2 3’UTR-Wt组、NC+KRAS 3’UTR-Wt组(1.03±0.02，1.06±0.04)相比，let-7-mimic+HMGA2 3’UTR-Wt组、let-7-mimic+KRAS 3’UTR-Wt组荧光素酶活性明显降低(0.42±0.07，0.38±0.05)，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

椎间盘疾病在脊柱外科较常见，研究发现椎间盘细胞数量及活性降低是造成椎间盘退行性变的重要原因^[1-3]。髓核组织是椎间盘的重要构成之一，椎间盘退行性变伴随着髓核细胞的衰老^[4]，然而其机制目前尚不明确。闭合状内源RNA-环状RNA(circ RNA)广泛存在于哺乳动物中，近期发现circ RNA与细胞衰老密切相关^[5-6]。circPVT1长度为410 nt，是浆细胞瘤转化迁移基因1(plasmacytoma variant translocation 1，PVT1)非编码区易位转录产物，PANDA等^[7]研究发现在衰老的成纤维细胞中circPVT1水平逐渐降低，提示其可能为抗衰老基因，而且circPVT1可通过与let-7相互作用共同参与成纤维细胞衰老过程。circPVT1/let-7与髓核细胞衰老的关系，目前尚不清楚。该研究通过体外转染circPVT1 siRNA至髓核细胞，探究其对髓核细胞衰老的影响，试图揭示髓核细胞衰老的机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  细胞分子生物学体外实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年3至10月在西南医科大学附属中医医院中心实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验细胞  人髓核细胞购于美国Sciencell公司，货号4800，用含体积分数为12%胎牛血清的DMEM-F12培养基在37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内进行培养。

1.3.2  实验试剂、仪器  胎牛血清、DMEM-F12培养基(美国Gibco公司)；circPVT1siRNA及NC序列、anti-let-7序列及NC序列(美国System Biosciences公司)；Lipfectamine^TM 2000 转染试剂盒(11668019)(美国ThermoFisher公司)；反转录试剂盒(18064022)、qRT-PCR检测试剂盒(4364346)(美国Invitrogen公司)；CCK8试剂盒(JK-021a) (上海经科化学科技有限公司公司)；p21(8493)、p27(3686)抗体、HRP标记IgG二抗(7072)(美国CST公司)；高迁移率族蛋白A2(ab97276)、KRAS(ab129080)、β-actin (ab179467)(美国Abcam公司)；Trizol试剂(R0016)、BCA测定试剂盒(P0012S)、蛋白裂解液(P0013C)(碧云天生物技术公司)；PRIMUS型直线加速器(Simens公司)；ND2000分光光度仪器(美国Thermo公司)；CFX96 TouchPCR仪(美国Bio-Rad公司)；倒置显微镜(日本Nikon公司)；凝胶成像仪(美国UVP公司)；GloMax荧光读数器(美国Promega公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  电离辐射诱导髓核细胞衰老  取对数期髓核细胞于常温下采用6 MV X射线由上向下垂直照射，剂量为5 Gy，光源距离细胞约100 cm，不间断照射6 d，倒置显微镜下观察髓核细胞形态学变化。

1.4.2  SA-β-gal染色检测细胞衰老  收集髓核细胞，消化后调整细胞浓度为5×10⁷ L^-1接种于6孔板，每孔100 μL，继续培养24 h，吸弃孔内培养液，PBS清洗，加入固定液室温下固定20 min，PBS清洗，加入β-gal染色液，置于37 ℃培养箱内过夜，PBS清洗，加入封固液封固，倒置显微镜下观察染色细胞数量，利用Image-J软件定量分析染色阳性率，即染色细胞数/细胞总数×100%。

1.4.3  实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测circPVT1、let-7 mRNA表达  收集髓核细胞，采用Trizol试剂提取细胞总RNA，并反转录为cDNA，然后在PCR仪上进行扩增反应，扩增总体系为20 μL，包括cDNA模板2 μL，SYBR Green premix 10 µL，上下游引物各0.6 µL，补充ddH₂O 6.8 μL。PCR反应条件：95 ℃ 2 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。每个样本设定3个重复，实验重复3次，circPVT1以β-actin为内参基因，let-7以U6为内参基因，采用2^-∆∆Ct法分别定量分析circPVT1、let-7相对表达量。

1.4.4  细胞转染  收集对数期生长良好的髓核细胞，经胰酶消化后，调整细胞密度6×10⁶/孔接种于6孔板，参照Lipofectamine 2000转染试剂盒，将细胞分为5组：①空白组：未进行任何处理的髓核细胞；②si-NC+anti-NC组：将2个阴性对照序列转染至髓核细胞；③si-circPVT1+ anti-NC组：将si-circPVT1、anti-NC共转染至髓核细胞；④si-NC+anti-let-7组：将si-NC、anti-let-7共转染至髓核细胞；⑤si-circPVT1+anti-let-7组：将si-circPVT1、anti-let-7共转染至髓核细胞。转染后继续培养48 h，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.4.5  CCK-8法检测细胞增殖情况  收集各组对数期髓核细胞接种于96孔板，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，在培养24，48，72，96 h每个孔中添加10 mL CCK-8工作液，每个时间点设定6个重复，37 ℃孵育2 h，用酶标仪测量450 nm处的吸光度值，实验重复3次。细胞增殖抑制率=(1-实验组吸光度值/空白组吸光度值)×100%。

1.4.6  平板细胞克隆形成实验检测菌落形成  取各组对数期髓核细胞，胰酶消化后制备单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁷ L^-1接种培养皿内，置于细胞培养箱中培养7-14 d，待培养皿中出现肉眼可见的克隆时停止培养，吸弃细胞培养液，PBS清洗，甲醇固定20 min，结晶紫溶液染色30 min，PBS清洗，室温干燥，肉眼计数细胞克隆数量并拍照保存。

1.4.7  免疫印迹法检测细胞p21、p27、HMGA2、KRAS蛋白表达  采用细胞裂解液提取各组髓核细胞总蛋白，取20 μg蛋白，煮沸、离心后，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白后转移至PVDF膜，加入鼠抗人p21、p27、HMGA2、KRAS(1∶500)抗体4 ℃孵育过夜，加入二抗(1∶5 000) 37 ℃孵育1 h，ECL发光显影后采用凝胶成像仪采集图像，Image-J软件对条带定量分析。

1.4.8  荧光素酶报告基因测定  构建含有野生型(wt)HMGA2、突变型(mut)HMGA2 3’UTR序列及wt-KRAS、mut-KRAS 3’UTR序列的荧光素酶报告基因表达载体：pCHECK2-HMGA2-3'UTR-Wt和pCHECK2-HMGA2- 3'UTR-Mut、pCHECK2-KRAS-3'UTR-Wt、pCHECK2- KRAS-3'UTR-Mut，将NC和let-7 mimic质粒与HMGA2-wt/ HMGA2-mut(KRAS-wt/KRAS-mut)表达载体共转染髓核细胞，48 h后离心收集细胞，根据荧光读数器对各组荧光素酶活性进行测定。

1.5  主要观察指标  ①衰老髓核细胞中circPVT1、let-7 表达；②转染circPVT1/let-7细胞增殖能力、平板细胞克隆形成能力、细胞衰老活性；③细胞衰老蛋白p21、p27、HMGA2、KRAS表达；④荧光素酶报告基因验证let-7与HMGA2、KRAS靶向关系。

1.6  统计学分析  采用SPSS 21.0软件进行统计，计量资料以x(_)±s表示，多组间对比采用多因素方差分析，进一步两两比较采用snk-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

circRNA属于环形非编码RNA分子，能够被siRNA干扰，降低其功能，也可作为miRNA调控靶基因的表达^[8-10]。近期研究发现circRNAs参与细胞衰老，与多种老化疾病有关，如神经老化、肌肉老化、生殖老化、皮肤老化^[11-13]。ZHANG等^[14]在衰老大鼠脑组织中发现有235个异常表达的circRNAs。CHEN等^[15]经高通量RNA测序发现26个circRNA在肌肉老化过程中表达水平存在差异。CHENG等^[16]在女性颗粒细胞中发现，circRNA_103827、circRNA_104816 高表达与卵巢储备能力下降密切相关。这些研究均说明circRNAs参与衰老的发生，因此探究circRNA在衰老髓核细胞的表达及其作用机制具有重要的意义。

PVT1定位在人染色体8q24，近期CHEN等^[17]在胃癌细胞中发现circPVT1，证实circPVT1通过吸附miRNA let-7上调c-Myc表达进而促进胃癌细胞的增殖，同时临床研究证实其是胃癌患者预后标志物。PANDA等^[7]发现辐射后衰老的成纤维细胞中circPVT1的表达明显降低，而在增生的成纤维细胞中高度表达，提示circPVT1可能为抗衰老基因。该研究采用电离辐射诱导髓核细胞衰老，与正常髓核细胞相比，衰老细胞中circPVT1表达显著降低，提示circPVT1可能参与髓核细胞的衰老进程。为进一步验证这一结果，通过体外转染circPVT1 siRNA干扰序列，发现抑制circPVT1表达后能够明显抑制髓核细胞增殖，降低细胞克隆形成量，SA-β-gal染色发现髓核细胞衰老活性增强，表明抑制circPVT1表达后能够加速髓核细胞的衰老，其可能作为衰老相关因子参与髓核细胞的衰老进程。p21、p27蛋白作为衰老标志物参与细胞衰老过程，抑制p21、p27表达可促进细胞DNA复制，达到延缓衰老的目的^[18-20]。该研究发现体外转染circPVT1 siRNA后，p21、p27蛋白表达显著升高，推测circPVT1抑制后可通过上调p21、p27参与髓核细胞衰老。

let-7可通过作用于p-53、c-myc等靶基因，调控细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭，且let-7参与眼部、咽部多种衰老疾病的发生^[21-22]。WANG等^[23]研究发现let-7通过抑制下游Hbl-1表达，进而释放LIN-28控制昆虫发育，而过表达let-7则会造成昆虫早熟。XU等^[24]报道抑制let-7表达能够延迟衰老。该研究发现体外转染anti-let-7后，髓核细胞增殖抑制率降低，细胞克隆形成量升高，髓核细胞衰老活性减弱，p21、p27蛋白表达显著降低，提示抑制let-7后可延缓髓核细胞衰老。CHENG等^[16]筛选出可结合circPVTA1的miRNA分子let-7，荧光素酶报告基因结果显示let-7活性变化最显著，circPVTA1可竞争结合let-7以调控胃癌细胞的增殖。为证实circPVTA1与let-7在髓核细胞衰老中的作用，该研究将circPVT1 siRNA、anti-let-7共转染入髓核细胞，结果发现共转染组circPVT1表达、克隆形成数量高于si-circPVT1单转染组；细胞抑制率、SA-β-gal染色阳性率低于si-circPVT1单转染组，推测circPVT1抑制后对髓核细胞衰老的促进作用可以通过anti-let-7得到部分抑制。

HMGA2、KRAS通过与DNA、转录因子相互作用，影响细胞增殖、分化、衰老等生理过程。研究发现上调HMGA2表达后能够抑制细胞衰老活性^[25-26]。TAN等^[27]在成纤维细胞中发现SAG缺失后可诱导细胞衰老，造成KRAS表达降低，提示KRAS下调与成纤维细胞衰老有关。近期研究发现let-7可靶向HMGA2、KRAS参与衰老、癌变过程^[28-30]。该研究发现抑制let-7表达后能够升高HMGA2、KRAS蛋白表达，且共转染si-circPVT1后，HMGA2、KRAS蛋白表达有所降低，推测circPVT1通过竞争性结合let-7进而靶向HMGA2、KRAS，参与髓核细胞衰老过程。

综上所述，circPVT1在衰老髓核细胞中表达降低，体外转染si-circPVT1后能够加速髓核细胞衰老，其机制可能与circPVT1竞争性结合let-7后介导的HMGA2、KRAS调控作用有关，然而关于髓核细胞衰老机制较复杂，还有待后续深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

环状RNA浆细胞瘤转化迁移基因1：为环形非编码RNA分子之一，是PV T1基因座内的长链非编码RNA区浆细胞瘤变体易位转录物，长约410 nt，其表达降低会促进细胞衰老。

let-7：属于miRNA分子，与细胞的发育、分化密切有关，在传递细胞生长分化信号中发挥重要作用，let-7表达的降低或缺失会影响靶基因HMGA2、RAS、pha-4等的表达，导致细胞分化异常、肿瘤发生、细胞衰老。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

circPVT1在衰老髓核细胞中表达降低，体外转染si-circPVT1后能够加速髓核细胞衰老，其机制可能与circPVT1竞争性结合let-7后介导HMGA2、KRAS调控作用有关，然而关于髓核细胞衰老机制较复杂，还有待后续深入研究。

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