骨髓间充质干细胞移植干预衰老猕猴胸腺结构和功能的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2157

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (1): 13-19.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2157

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骨髓间充质干细胞移植干预衰老猕猴胸腺结构和功能的变化

王严影 1，2，杨育坤 2 ，朱向情 2 ，李晔 2 ，何洁 2 ，田川 1，2，何志旭 3 ，潘兴华 2

1 贵州医科大学，贵州省贵阳市 550025；2 解放军联勤保障部队第 920 医院细胞生物治疗中心，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省昆明市 650032；3 遵义医科大学附属医院儿科学教研室，贵州省遵义市 563100

收稿日期:2020-02-10 修回日期:2020-02-18 接受日期:2020-03-30 出版日期:2021-01-08 发布日期:2020-09-19
通讯作者: 潘兴华，博士，主任医师，解放军联勤保障部队第920医院细胞生物治疗中心，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省昆明市 650032
作者简介:王严影，女，1993年生，河北省廊坊市人，贵州医科大学在读硕士，主要从事骨髓间充质干细胞应用研究。
基金资助:
云南省科技计划项目重大科技专项(2018ZF007)；云南省科技计划项目面上项目(2017FB042)

Effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on thymus structure and function in the aging macaques

Wang Yanying1, 2, Yang Yukun2 , Zhu Xiangqing2 , Li Ye2 , He Jie2 , Tian Chuan1, 2, He Zhixu3 , Pan Xinghua2

Received:2020-02-10 Revised:2020-02-18 Accepted:2020-03-30 Online:2021-01-08 Published:2020-09-19
Contact: Pan Xinghua, MD, Chief physician, Cell Biological Therapy Center of 920th Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, The Transfer Medicine Key Laboratory of Cell Therapy Technology of Yunan Province, The Integrated Engineering Laboratory of Cell Biological Medicine of State and Regions, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Wang Yanying, Master candidate, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China; Cell Biological Therapy Center of 920th Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, The Transfer Medicine Key Laboratory of Cell Therapy Technology of Yunan Province, The Integrated Engineering Laboratory of Cell Biological Medicine of State and Regions, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the Major Science and Technology Project of Yunnan Science and Technology Plan Project, No. 2018ZF007; the Surface Project of Yunnan Science and Technology Plan Project, No. 2017FB042

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
调节性T细胞：又名CD4+CD25+Foxp3+T细胞或Treg细胞，是T细胞亚群中重要的一群，作为免疫系统中的抑制细胞，能够维持机体免疫耐受和控制体内自身免疫反应。近年来，调节性T细胞的作用被强调为一种重要的抑制机制，有助于维持敏感T细胞反应的免疫稳态。在T细胞辅助活动中，调节性T细胞负责恢复体内平衡和调节效应T细胞的反应，以防止炎症对机体造成不必要的损害。
Masson染色：是胶原纤维染色权威而经典的染色方法。胶原纤维被苯胺蓝所染呈蓝色，肌纤维和红细胞被酸性品红和丽春红所染呈红色，这与阴离子染料分子的大小和组织的渗透性有关。不同的组织和细胞组分的孔隙大小决定了组织的渗透性。结构疏松、渗透性高的组织多选择大分子染料，而结构致密、渗透性低的组织多选择小分子染料。
背景：胸腺是人体重要的中枢免疫器官，是T细胞生长、发育和成熟的场所，同时也是人体内最先衰老的器官，随年龄的增加，在青春期后逐渐萎缩和退化，随之免疫功能也逐渐衰退。
目的：探讨骨髓间充质干细胞对衰老猕猴胸腺结构和功能的影响。
方法：通过骨髓穿刺采集平均年龄3岁雌性猕猴骨髓，差速贴壁法获得骨髓间充质干细胞。取5只平均年龄3岁猕猴为幼年组，10只平均年龄25岁衰老猕猴，随机分为老年组4只和老年治疗组6只。老年治疗组猕猴经股静脉输注骨髓间充质干细胞(1×107/kg)，隔天输注，连续3次；幼年组猕猴和老年组猕猴在同一时间输注等体积的生理盐水。分析输注后老年治疗组猕猴胸腺细胞亚群输出水平、分泌水平以及各组猕猴胸腺指数、胸腺组织结构和胸腺组织胶原纤维沉积变化。
结果与结论：通过骨髓间充质干细胞移植，衰老猕猴胸腺指数提高；T细胞输出水平增加，调节性T细胞减少；胸腺分泌功能改善，胸腺素α和胸腺生成素Ⅱ分泌水平增加；胸腺实质面积增大，出现皮、髓质交界，部分胸腺组织再生，向正常结构转变；胸腺组织纤维化程度降低，胶原纤维沉积减少。上述结果表明移植骨髓间充质干细胞对老年猕猴胸腺的结构和功能有改善作用。

ORCID:0000-0003-1134-5947(王严影)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 猕猴, 胸腺, 衰老, T细胞, 免疫, 实验

Abstract: BACKGROUND: Thymus is an important central immune organ of human body, which is the place where T cells grow, develop and mature. Thymus is the first organ of senescence in human body, gradually atrophy and degeneration after puberty, followed by the gradual decline of immune function.
OBJECTIVE: To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells on the structure and function of thymus in the aging macaques.
METHODS: Bone marrow was collected from female macaques with an average age of 3 years by bone marrow aspiration. Bone marrow mesenchymal stem cells were obtained by differential adherent culture. Five young macaques with an average age of 3 years were used as the young group. Ten aging macaques with an average age of 25 years were randomly divided into elderly group (n=4) and elderly treatment group (n=6). The macaques in the elderly treatment group were infused with bone marrow mesenchymal stem cells (1 × 107 cells/kg) through the femoral vein, and were infused every other day for three consecutive times. Macaques of the young group and the elderly group were infused with the same volume of saline at the same time. The changes of output and secretion levels of the subgroup of thymocytes in the elderly treatment group after infusion, thymic index, thymic tissue structure and collagen fiber deposition in each group were analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation increased thymus index, T cell output level and reduced regulatory T cells, improved thymus secretion function, increased thymosin alpha and thymosin II secretion. The thymus parenchyma area increased; the skin and medulla junction appeared; part of the thymus tissue was regenerated and transformed to normal structure; the degree of thymus tissue fibrosis was reduced; and collagen fiber deposition was reduced. These results indicate that bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can improve the structure and function of thymus in aging macaques.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, macaques, thymus, aging, T cells, immunity, experiment

中图分类号:

王严影, 杨育坤, 朱向情, 李晔, 何洁, 田川, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞移植干预衰老猕猴胸腺结构和功能的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 13-19.

Wang Yanying, Yang Yukun, Zhu Xiangqing, Li Ye, He Jie, Tian Chuan, He Zhixu, Pan Xinghua. Effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on thymus structure and function in the aging macaques[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(1): 13-19.

图/表（结果） 8

2.1 骨髓间充质干细胞的形态学观察采用差速贴壁法对骨髓间充质干细胞进行分离培养，在培养三四天开始出现细胞生长，原代骨髓间充质干细胞呈集落生长，当细胞融合率达80%-90%时进行传代。随着传代培养，细胞形态均一，呈长梭形、成纤维细胞样，漩涡状生长，见图1。

2.2 实验动物数量分析 15只猕猴经过1周正常喂养后无异样变化，随机进行分组，即幼年组5只(n=5)、老年组4只(n=4)和老年治疗组6只(n=6)，动物结果分析共计15只，中途15只猕猴无异样变化。 2.3 外周血T细胞和调节性T细胞输出水平变化通过流式细胞术对老年治疗组猕猴外周血T细胞检测，CD3+T细胞在外周血中的百分比呈先升高后降低的趋势，治疗30 d和60 d
较治疗前显著增加(P < 0.05)，治疗90 d较治疗前降低，但差异无显著性意义(P > 0.05)；CD3+CD4+T细胞在外周血中的百分比呈缓慢增长趋势，治疗前与治疗30，60，90 d比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；CD3+CD8+T细胞在外周血中的百分比呈先升高后降低再升高的趋势，治疗前与治疗30，60，90 d比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。
调节性T细胞在外周血中的百分比呈下降趋势，其中治疗30，60，90 d与治疗前比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图2和表1。

2.4 猕猴外周血胸腺素α和猴胸腺生成素Ⅱ分泌水平变化通过酶联免疫吸附实验对老年治疗组猕猴外周血中猴胸腺素α和猴胸腺生成素Ⅱ分泌水平进行检测，胸腺素α分泌水平在骨髓间充质干细胞输注后呈先升高后降低的趋势，其中治疗30 d较治疗前明显增加(P < 0.01)；治疗60 d和治疗90 d较治疗前增加，但差异无显著性意义(P > 0.05)。
猴胸腺生成素Ⅱ分泌水平呈先升高后降低的趋势，治疗后30，60 d较治疗前呈增长趋势，治疗90 d呈下降趋势，但差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图3和表2。

2.5 各组猕猴胸腺指数变化老年组胸腺指数明显低于幼年组(P < 0.01)；经过骨髓间充质干细胞输注后，老年治疗组猕猴胸腺指数较老年组升高(P < 0.05)，差异有显著性意义；老年治疗组与幼年组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，但老年治疗组胸腺指数整体是上升趋势，见图4。

2.6 骨髓间充质干细胞治疗后胸腺组织结构变化苏木精-伊红染色可见，幼年组胸腺组织被膜较为完整，皮、髓质交界清晰，皮质内胸腺细胞较为密集且着色较深，髓质内含有大量胸腺上皮细胞且着色较浅，胸腺实质面积大且饱满。随着猕猴年龄的增长，胸腺开始萎缩和退化，皮、髓质交界模糊，胸腺实质面积变小，胸腺细胞减少，皮质区被脂肪组织填充。经过骨髓间充质干细胞移植治疗，老年治疗组比老年组胸腺实质面积增大，皮、髓质结构改善且开始出现界限，胸腺细胞增多，脂肪组织减少，见图5。通过以上组织学观察，骨髓间充质干细胞移植治疗后胸腺结构改善，胸腺部分结构再生且不断向正常结构发展。

2.7 骨髓间充质干细胞治疗后胸腺组织胶原纤维沉积变化 Masson染色可见，幼年组胸腺纤维排列整齐且密集，胶原纤维呈蓝色，胶原沉积面积较小，纤维化程度低；随着猕猴年龄的增长，老年组胸腺胶原纤维大量增生，排列紊乱，胶原沉积增加，纤维化明显；老年治疗组胶原纤维改善，胶原增生程度低于老年组，胸腺纤维化程度明显减轻，见图6。通过以上分析，骨髓间充质干细胞输注后利于胸腺组织胶原纤维沉积的改善，减轻胸腺组织的纤维化程度。

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引言

世界正在经历逐步老龄化的趋势，人口老龄化所带来的衰老相关疾病是中国社会发展面临的巨大挑战。衰老是生物界中普遍存在的现象，主要表现在分子、细胞、组织以及器官水平上一系列功能的退化或丧失[1]。免疫功能衰退是机体衰老的重要机制之一，而胸腺是人体重要的中枢免疫器官，在免疫系统中的作用是不可或缺的。
胸腺是T细胞分化、发育和成熟的场所，决定着T细胞免疫应答的有效性。胸腺在胎儿时期发育，在出生后早期达到最大输出；在青年时期和整个成年过程中，随着年龄的增长，胸腺的大小和输出都会表现出下降的趋势[2]。胸腺的萎缩和退化将导致机体免疫力下降，增加老年人患感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤的风险，主要表现为胸腺体积变小、细胞结构破坏、脂肪组织填充和初始T淋巴细胞的输出减少[3]。免疫衰老与胸腺退化密切相关，并以胸腺微环境的增龄性改变为标志[4]。
近年来研究发现，改善胸腺功能有许多治疗方法，如细胞因子治疗[5]、基因疗法[6]、基因敲除技术和生物工程等方法能有效促进胸腺功能的改善与T细胞再生[7-8]。然而，这些方法也存在一定的风险和挑战，如基因疗法改善胸腺功能后产生新的T细胞，可能携带一些与患者不兼容的受体，从而导致患者的免疫系统对新的T细胞产生排斥反应[9]；另外相关的基因敲除技术特异性不高且效率较低，敲除后需进行相关的实验验证，其技术繁杂、造价昂贵[10]；生物工程在短时间内难以实现规模化。以上改善胸腺功能方法的机制尚不明确，而且存在不同程度的缺陷，具体机制有待进一步研究。
近年研究表明，干细胞在再生医学和免疫治疗中的潜力受到广泛关注，其中间充质干细胞是一种来源广泛的具有多向分化潜能的细胞，骨髓来源间充质干细胞是最具特征性的间充质干细胞之一[11]，具有多向分化潜能和自我更新能力。该实验以猕猴为研究对象，探讨骨髓间充质干细胞移植对衰老猕猴胸腺结构和功能的影响。目前国内外已对干细胞改善小鼠胸腺功能进行了一定的探索，但对于骨髓间充质干细胞移植对衰老猕猴胸腺功能改善的机制尚不明确，其治疗效果值得进一步进行探究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计动物体内实验和随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2018年9月至2019年12月在中国科学院昆明动物研究所和中国人民解放军联勤保障部队第920医院细胞生物治疗中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物由中国科学院昆明动物研究所提供健康幼年雌猴5只，平均年龄3岁，体质量2.0-3.0 kg；健康老年雌猴10只，平均年龄25岁，体质量4.0-5.0 kg。所有猕猴均饲养于中国人民解放军联勤保障部队第920医院动物室内，体型正常，饲养期间环境清洁卫生，动物笼具清洁干燥。所有动物研究经依托单位实验动物伦理委员会批准，批件号为伦审2019-032(科)-01，动物许可证号SYXK(军)2012-0039。
1.3.2 实验主要试剂恒河猴骨髓间充质干细胞完全培养基(广州Cyagen公司)；间充质干细胞成脂、成骨和成软骨诱导分化培养基(广州Cyagen公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；抗体CD3、CD4、CD8、CD25、FoxP3、IgG1和Cell staining buffer(美国Biolegend公司)；猴胸腺素α和猴胸腺生成素ⅡELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司)。
1.3.3 实验仪器 SW-CL-2F型百万层级层流超净工作台(苏州佳宝净化工程设备公司)；离心机(湖南湘仪公司)；CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；FACScabilur流式细胞仪(美国BD公司)；酶标仪(美国Rayto公司)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 猕猴骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定幼年猕猴骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养、细胞免疫表型鉴定及多向分化能力鉴定，可参考课题组既往发表的文献[12-13]。倒置相差显微镜下观察细胞的形态和生长状况，待第3代骨髓间充质干细胞融合达培养瓶底部80%-90%以上时，分别进行骨髓间充质干细胞的免疫表型鉴定和成脂、成骨及成软骨诱导分化能力检测。

1.4.2 动物分组及细胞移植 15只猕猴经1周正常喂养后无异样变化，随机进行分组，即幼年组5只(n=5)、老年组4只(n=4)和老年治疗组6只(n=6)。将骨髓间充质干细胞复苏后，用含0.25%EDTA的胰酶进行消化，加入15 mL含体积分数为10%胎牛血清的培养基终止消化，1 900 r/min离心5 min，
弃上清，生理盐水重悬，调整细胞浓度为1×1010 L-1，转移至50 mL注射器中备用。老年治疗组猕猴按照1×107/kg的剂量经股静脉移植骨髓间充质干细胞，隔天1次，连续3次输注；幼年组和老年组猕猴同一时间输注等体积生理盐水。
1.4.3 流式细胞术检测猕猴外周血中T细胞和调节性T细胞输出水平老年治疗组猕猴在治疗前和治疗30，60，90 d进行股静脉采血5 mL，进行单细胞分离后，用Cell Staining Buffer
重悬细胞浓度为1×1010 L-1，每管10 μL，按照设置分别加入相应的表面标记抗体，轻柔混匀，室温避光孵育30 min，每管加入2 mL Cell Staining Buffer，2 000 r/min离心5 min，弃上清，加入0.1 mL Cell Staining Buffer重悬细胞，30 min后在流式细胞仪上进行检测。
1.4.4 酶联免疫分析猕猴外周血中猴胸腺素α和猴胸腺生成素Ⅱ水平老年治疗组猕猴在治疗前和治疗30，60，90 d
进行股静脉采血5 mL，加入肝素管中，2 000 r/min离心
10 min，将所得血清转移至微量离心管中。准备试剂、样品和标准品，将标准品按照比例稀释，分别设空白孔、标准孔和待测样品孔。用封板膜封板后置37 ℃温育30 min，洗板5次，加入酶标试剂，37 ℃反应30 min，洗板5次，加入显色液A和B，在37℃条件下显色10 min，加入100 μL终止液，在15 min内读取吸光度值。以标准物的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘出标准曲线，根据样品吸光度值查找相应浓度，乘以稀释倍数，即为样品实际浓度。
1.4.5 猕猴胸腺指数测定末次移植6个月后进行实验取材。各组猕猴禁食24 h，称取猕猴体质量(kg)，使用过量3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉后处死，暴露腹腔，沿两侧肋软骨向上剪开至胸廓上缘，在心脏下方暴露胸腺组织，小心剥离胸腺，拭干血迹，电子天平称取质量(g)，计算各组猕猴的胸腺指数。胸腺指数=胸腺质量(g)/猕猴体质量(kg)。
1.4.6 胸腺苏木精-伊红染色取出胸腺组织后，40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h，然后进行脱水，石蜡包埋切片，切片厚度4 μm。将石蜡切片脱蜡至水，苏木精染细胞核5 min，自来水冲洗，使用0.6%氨水返蓝，再将切片放入伊红染液中染色3 min，将切片脱水透明，晾干，中性树胶封固。将切片置于显微镜下观察，镜检合格后进行图像采集分析，观察猕猴胸腺结构变化。
1.4.7 胸腺Masson染色猕猴胸腺组织石蜡包埋切片，切片厚度约4 μm。将石蜡切片脱蜡至水，苏木精染细胞核约
5 min，自来水冲洗，使用氨水返蓝；丽春红酸性品红液染10 min，蒸馏水快速漂洗；磷钼酸水溶液处理3-5 min，苯胺蓝液复染5 min；1%冰醋酸处理1 min；将切片脱水透明，晾干后中性树胶封固。将切片置于显微镜下观察，镜检合格后进行图像采集分析，观察猕猴胸腺纤维化情况。
1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞的形态；②老年治疗组猕猴胸腺细胞亚群输出变化和分泌功能变化；③各组猕猴胸腺指数、胸腺结构变化和胸腺纤维化情况。
1.6 统计学分析所有数据通过SPSS 21.0统计分析软件进行分析。统计结果以x±s表示，组间差异的统计学比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

由骨髓分离的间充质基质干细胞是当今再生医学研究中发展较为活跃的研究对象，作为一类具有再生能力的成体干细胞，以多向分化潜能、自我更新及体外易扩增等特点[14]，对组织和器官的退行性病变具有再生潜力，在临床上治疗脑血管疾病、心血管疾病及视网膜病变等方面展现了良好的应用前景[15-17]。猕猴属于非人灵长类动物，其基因组测序与人类基因组相似性高达93%[18]，研究结果比其他动物更具参考价值，与人类的遗传物质具有高度同源性，其组织结构、神经系统、生理功能和代谢功能等生物学特征同人类相似，在发病机制、疾病防治和安全性评价等方面具有独特优势。该实验观察骨髓间充质干细胞对老年猕猴胸腺结构和功能的影响。
胸腺是一个血管化的器官，在T淋巴细胞发育中起着关键作用，它在整个生命周期内之所以能够产生强大持久的获得性免疫反应，可能归因于它在损伤、感染或手术切除后再生的能力。衰老与免疫功能障碍有关，免疫衰老是与年龄相关的免疫系统的调节失调，而T细胞是免疫系统的重要组成部分，尤其是T细胞减少和缺陷，导致对各种疾病的易感性增加[19]。T细胞是一类来源于造血干细胞、成熟于胸腺中的一类极其活跃的细胞群，占外周血淋巴细胞的60%左右。该实验结果显示，经过骨髓间充质干细胞输注治疗后CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞较治疗前都有不同的增加，说明骨髓间充质干细胞能改善胸腺的输出功能[20]，增加了胸腺T细胞的输出量。前期课题组利用小鼠脐带间充质干细胞对衰老小鼠进行输注，对胸腺具有修复功能，且CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞比例是上升的。胸腺是T细胞发育、分化及成熟的场所，当正常胸腺老化时，胸腺细胞总量也会降低。经过输注骨髓间充质干细胞后，猜想可能由于促进了胸腺基质的增生，修复了T细胞的生长环境，使得T细胞的输出增加，胸腺的功能改善，功能细胞增多，而胸腺是T细胞发育的场所，也利于组织的重建。因此，输注骨髓间充质干细胞可以重建衰老猕猴胸腺结构并改善其胸腺功能，从而可以恢复免疫微环境并保持其外周平衡。研究发现，骨髓间充质干细胞衍生的细胞外囊泡培养CD3/CD28刺激的人外周血单核细胞，CD3+T细胞的活化被抑制[21]。该实验观察到治疗后90 d时CD3+T细胞比例呈下降趋势，猜想可能与细胞外囊泡的调控有关，且与治疗前相比差异无显著性意义，证明细胞发挥作用具有时效性，不是一劳永逸的，对未来临床细胞治疗有参考作用。
实验结果显示，骨髓间充质干细胞输注后T细胞总体水平升高，调节性T细胞减少。从结果可以看出调节性T细胞在治疗后第30天和第60天呈下降趋势，在第60天的时候达到最低点，而在第90天的时候出现拐点，呈上升趋势。作者推测这与输注细胞的数量和时间有着直接关系。研究表明，间充质干细胞与免疫细胞体外共培养时，当间充质干细胞数量超过一定量时，调节性T细胞的数量被抑制，当间充质干细胞数量低于一定数量时，能够促进调节性T细胞增殖。而该实验结果之所以在第90天出现拐点，可能是因为随着输注时间的增加，输注细胞数量逐渐减少，因此在90 d之前呈抑制作用，在90 d之后开始呈上升趋势，说明调节性T细胞开始增殖。总体来说，整体T细胞的水平呈上升趋势，也就意味着经骨髓间充质干细胞输注后免疫系统得以恢复，进而证明免疫器官如胸腺功能也得到改善。
调节性T细胞是一类具有免疫负性调节功能的调节细胞，作为免疫系统中的抑制细胞，具有抗炎和防止过强免疫反应的功能，调节性T细胞在自我耐受和免疫平衡中起着重要作用，占外周血CD3+CD4+T细胞比例的5%-10%[22]。免疫衰老可能是由免疫抑制细胞活性增加引起，而不是由细胞衰老引起[23]。衰老是一个免疫功能逐渐失衡的过程，而骨髓间充质干细胞本身具有自分泌功能，可以分泌多种因子促进内源性细胞增殖生长或发挥免疫调节作用[24]，使之产生的因子集中作用在炎症部位，下调炎症因子水平，抑制调节性T细胞增殖，使其对机体免疫应答的抑制也随之下降[25]。此外，促进和抑制是一直共存于人体免疫过程中的两个因素，因此免疫系统才能维持稳态和平衡[26]。在改善衰老过程中，只加强机体免疫应答水平并不能根本上解决免疫功能的失衡，间充质干细胞能够抑制炎症发生和产生抑炎因子，间充质干细胞改善了衰老胸腺的结构，改善免疫功能，起到免疫调节作用，其调节性T细胞比例减少，猜想可能与重新构建细胞因子的平衡和调节性T细胞中Foxp3的表达有关[27-28]。
研究发现，间充质干细胞因其具有在体内再生和促血管生成的潜力，参与血管生成活跃阶段，从而促进了胸腺的再生，通过间充质干细胞的输注，产生了许多其他类型的胸腺细胞，如胸腺上皮细胞[29]。此外，林喜娟等[30]通过在人胚胎干细胞中过表达转录因子Foxn1，成功地将其定向分化为胸腺上皮细胞，说明间充质干细胞能够促进胸腺上皮细胞的增加。然而，胸腺激素由胸腺上皮细胞分泌，影响着T细胞在胸腺中的发育，能诱导胸腺细胞发育为成熟的T细胞。胸腺上皮细胞及其分泌的胸腺素和胸腺生成素是构成胸腺微环境的主要成分, 允许胸腺细胞发生迁移和细胞相互作用，帮助胸腺细胞发育以及成熟，且胸腺素和胸腺生成素均能促进胸腺细胞的分化[31]。然而伴随着衰老，胸腺上皮细胞分泌的细胞因子和激素介导的信号传导在衰老过程中呈不断下降的趋势。输注骨髓间充质干细胞后，衰老猕猴胸腺分泌胸腺素α和胸腺生成素Ⅱ水平增多，证明骨髓间充质干细胞能改善胸腺分泌功能[32]，增强免疫功能[33-34]，对维持胸腺微环境稳态有重要作用。
胸腺随着年龄的增加而日益萎缩和退化，而衰老与免疫功能的退化是密不可分的。骨髓间充质干细胞输注后猕猴胸腺指数较老年组显著提高，证明骨髓间充质干细胞在一定程度上增强了衰老猕猴的免疫功能。王志红等[35]利用骨髓间充质干细胞对衰老大鼠进行治疗，发现大鼠胸腺指数提高，增强衰老大鼠自身免疫活力，改善衰老状态。Zhan等[36]利用人脂肪间充质干细胞对化疗损伤胸腺进行治疗，发现人脂肪间充质干细胞扩大了化疗损伤的胸腺面积并促进了胸腺的恢复。该实验给予骨髓间充质干细胞治疗后，衰老猕猴胸腺体积增大，皮、髓质结构改善且开始出现界限，胸腺细胞增多，脂肪组织减少，且利于胸腺组织的胶原纤维沉积的改善，减轻胸腺组织的纤维化程度。WANG等[37]探讨骨髓间充质干细胞移植对D-半乳糖诱导衰老大鼠抗氧化能力和免疫活性的影响，发现骨髓间充质干细胞能保护胸腺细胞和组织丰富完整，增强免疫功能，这与该实验结果是一致的。通过此次研究，作者推断骨髓间充质干细胞对胸腺的影响主要是通过向胸腺细胞分化的作用以及骨髓间充质干细胞旁分泌作用和免疫调节作用等[38]，可能与骨髓间充质干细胞分泌的具有免疫调节的细胞因子有关，如转化生长因子β、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等[39]，从而在胸腺中发挥免疫调节作用，促进胸腺组织的改善。
综上所述，骨髓间充质干细胞能够改善胸腺结构和功能，但在改善胸腺结构和功能的过程中，是否有相关基因和信号通路参与调控，还有待开展更多的实验进行探究。深入了解骨髓间充质干细胞改善衰老引发的免疫功能退化问题，对当今日益严重老龄化研究有重要意义，同时为临床改善与免疫系统衰老相关的胸腺退化疾病提供实验理论基础和新的视角。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓间充质干细胞移植干预衰老猕猴胸腺结构和功能的变化

Effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on thymus structure and function in the aging macaques

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