活化T细胞核因子5对人胃癌MGC803细胞迁移、侵袭及细胞周期的影响

doi:10.12307/2022.543

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (17): 2732-2737.doi: 10.12307/2022.543

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活化T细胞核因子5对人胃癌MGC803细胞迁移、侵袭及细胞周期的影响

郭隽馥，高霞，常家榕，高诗琪，苗兰英

辽宁中医药大学教学实验中心，辽宁省沈阳市 110847

收稿日期:2021-03-25 修回日期:2021-03-31 接受日期:2021-05-26 出版日期:2022-06-18 发布日期:2021-12-27
通讯作者: 苗兰英，教授，研究员级高级实验师，辽宁中医药大学教学实验中心，辽宁省沈阳市 110847
作者简介:郭隽馥，女，辽宁省沈阳市人，2015年中国医科大学毕业，博士，高级实验师，硕士生导师，主要从事中西医结合肿瘤分子遗传学方面的基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年项目(81803855)，项目负责人：郭隽馥；辽宁省博士启动项目(2019-BS-166)，项目负责人：郭隽馥；沈阳市中青年科技创新人才支持计划项目(RC190078)，项目负责人：郭隽馥

Effects of nuclear factor of activated T cells 5 on migration, invasion and cell cycle of human gastric cancer MGC803 cells

Guo Junfu, Gao Xia, Chang Jiarong, Gao Shiqi, Miao Lanying

Teaching and Experiment Center, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, Liaoning Province, China

Received:2021-03-25 Revised:2021-03-31 Accepted:2021-05-26 Online:2022-06-18 Published:2021-12-27
Contact: Miao Lanying, Professor, Teaching and Experiment Center, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, Liaoning Province, China
About author:Guo Junfu, MD, Senior experimentalist, Master’s supervisor, Teaching and Experiment Center, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (Youth Program), No. 81803855 (to GJF); Liaoning Provincial Doctoral Start-up Project, No. 2019-BS-166 (to GJF); Shenyang Young and Middle-Aged Science and Technology Innovation Talent Support Program, No. RC190078 (to GJF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
细胞迁移力：细胞迁移是肿瘤转移的关键步骤之一。肿瘤细胞能够通过变形虫样运动和追逐等方式，完成近乎直线的迁移过程。常用的实验检测手段有划痕实验(检测水平迁移力)和Transwell实验(检测垂直迁移力)，研究肿瘤细胞迁移的动力能够为转移的阻断提供新策略、新方向。
细胞侵袭力：肿瘤细胞通过细胞外基质从一个区域迁移到另一个区域之前，能够产生基质金属蛋白酶(基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13等)，并以此水解突破细胞外基质完成侵袭过程。研究肿瘤细胞侵袭的动力能够为转移的阻断提供新策略、新方向。

背景：近年研究发现，活化T细胞核因子5(nuclear factor 5 of activated T cells，NFAT5)高表达与多种肿瘤的发生进展关系密切。前期研究发现，NFAT5能够促进人胃癌MGC803细胞增殖并抑制其凋亡。
目的：探讨NFAT5对人胃癌MGC803细胞迁移力、侵袭力及细胞周期的影响。
方法：实验分为siRNA阴性对照组与NFAT5-siRNA组。有效转染人胃癌MGC803细胞沉默NFAT5基因表达后，采用划痕实验、Transwell实验和流式细胞术分别检测各组细胞迁移力、侵袭力及细胞周期分布的改变。
结果与结论：①siRNA阴性对照组划痕的愈合能力明显高于NFAT5-siRNA组；②NFAT5-siRNA组穿过小室的细胞数目明显少于siRNA阴性对照组[(134.63±25.62)个vs.(195.00±60.41)个，P < 0.05]；③与siRNA阴性对照组相比，NFAT5-siRNA组细胞中G1期细胞比例显著升高[(60.03±0.55)% vs.(62.46±0.73)%，P < 0.05]，而S期细胞比例显著降低[(28.24±1.16)% vs.(25.44±1.15)%，P < 0.05]；④提示沉默人胃癌MGC803细胞中NFAT5基因表达能够有效减弱细胞的迁移力和侵袭力，改变细胞周期分布，进而减少细胞增殖，NFAT5有望成为胃癌诊治的新靶点。
缩略语：活化T细胞核因子：nuclear factor of activated T cells，NFAT；小干扰RNA：small interfering RNA，siRNA

https://orcid.org/0000-0001-5034-2824 (郭隽馥)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: NFAT5, 胃癌, 细胞侵袭, 细胞迁移, 细胞周期

Abstract: BACKGROUND: Recent studies have shown that high expression of nuclear factor 5 of activated T cells (NFAT5) is closely related to the occurrence and progression of a variety of tumors. Previous studies have found that NFAT5 can promote the proliferation and inhibit the apoptosis of human gastric cancer MGC803 cells.
OBJECTIVE: To investigate the effects of NFAT5 on migration, invasion and cell cycle of human gastric cancer MGC803 cells.
METHODS: There were two groups: NC-siRNA and NFAT5-siRNA. The siRNAs were transfected to silence NFAT5 gene expression in MGC803 cells. Cell scratch assay, Transwell assay and flow cytometry were performed to test migration ability, invasion ability, and cell cycle distribution, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The wound healing capacity of NC-siRNA group was significantly higher than that in the NFAT5-siRNA group. The number of cells passed through the ventricle in the NFAT5-siRNA group was obviously less than that in the NC-siRNA group [(134.63±25.62) vs. (195.00±60.41), P < 0.05]. Compared with the NC-siRNA group, the proportion of G1-phase cells was significantly increased [(60.03±0.55)% vs. (62.46±0.73)%, P < 0.05] and the proportion of S-phase cells was significantly decreased [(28.24±1.16)% vs. (25.44±1.15)%, P < 0.05]. Therefore, NFAT5 silencing in human gastric cancer MGC803 cells can inhibit cell migration and invasion abilities in vitro and change the cell cycle distribution, thereby reducing cell proliferation ability. NFAT5 is expected to be a new diagnostic and therapeutic target for gastric cancer.

Key words: NFAT5, gastric cancer, cell, migration, invasion, cell cycle

中图分类号:

郭隽馥, 高霞, 常家榕, 高诗琪, 苗兰英. 活化T细胞核因子5对人胃癌MGC803细胞迁移、侵袭及细胞周期的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(17): 2732-2737.

Guo Junfu, Gao Xia, Chang Jiarong, Gao Shiqi, Miao Lanying. Effects of nuclear factor of activated T cells 5 on migration, invasion and cell cycle of human gastric cancer MGC803 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(17): 2732-2737.

图/表（结果） 5

2.1 转染NFAT5-siRNA能够有效下调MGC803细胞中NFAT5基因表达转染48 h后，应用倒置荧光显微镜观察MGC803细胞内的荧光情况，发现绝大部分细胞内都可以看到绿色荧光，见图1A，提示细胞转染成功。
实时定量PCR检测结果显示，转染48 h后，与siRNA阴性对照组相比，NFAT5-siRNA组细胞中NFAT5 mRNA表达显著下调(P < 0.01)，见图1B。提示转染NFAT5-siRNA能够有效下调MGC803细胞中NFAT5 mRNA的表达。

2.2 NFAT5沉默对MGC803细胞迁移能力的影响采用划痕实验检测NFAT5沉默对MGC803细胞体外迁移能力的影响，见图2。

结果显示，在0 h和4 h，两组细胞划痕宽度基本一致；24 h时，与NFAT5-siRNA组相比，siRNA阴性对照组细胞向划痕区域爬行明显(P < 0.05)；30 h时，个别细胞已至划痕中间区域，且NFAT5-siRNA组划痕宽度明显大于siRNA阴性对照组(P < 0.01)。提示培养液中NFAT5-siRNA组细胞的迁移速度明显低于siRNA阴性对照组，NFAT5沉默可有效抑制MGC803细胞的体外迁移能力。
2.3 NFAT5沉默对MGC803细胞侵袭能力的影响采用Transwell实验检测NFAT5沉默对MGC803细胞侵袭能力的影响，见图3。

结果显示，NFAT5-siRNA组穿过小室的细胞数目明显少于siRNA阴性对照组[(134.63±25.62)个vs.(195.00±60.41)个， P < 0.05]。提示NFAT5沉默可抑制MGC803细胞的体外侵袭能力。
2.4 NFAT5沉默对MGC803细胞的细胞周期分布的影响采用流式细胞术检测NFAT5沉默对MGC803细胞的细胞周期分布的影响，见图4。

结果显示，与siRNA阴性对照组相比，NFAT5-siRNA组中G1期细胞比例显著升高[(60.03±0.55)% vs.(62.46±0.73)%，P < 0.05]，而S期细胞比例显著降低[(28.24±1.16)% vs.(25.44± 1.15)%，P < 0.05]。提示NFAT5沉默能够影响MGC803细胞的细胞周期分布，抑制细胞的增殖力。

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引言

胃癌是全球高发恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率数年来始终处于世界前3位[1]。中国是胃癌的高发国家，然而目前胃癌的早期诊断率还很低，治疗以切除为主，术后预后差，复发转移率高，患者5年内生存率仍不足50%[2-4]。因此，寻找抗胃癌复发转移的药物并探究其潜在的作用机制，将有望发现胃癌治疗的新方向、新策略，具有重要的科学意义和广泛的经济学效应。
NFAT5是活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)家族的5个成员之一，在肾脏、脑、肝脏以及骨骼肌组织中均呈高表达[5-8]。作为具有多向调节功能的转录因子，NFAT5主要受渗透性应激和整合素的调控[9-10]。研究表明，整合素能够通过增强细胞的运动和侵袭能力进而直接或间接地促进肿瘤细胞发生上皮-间质转化从而令细胞向新的病灶转移[11-12]。因此，深入研究其在肿瘤复发转移中的作用及其分子机制具有重要意义。近年研究发现，NFAT5高表达与多种肿瘤的发生进展关系密切[13-16]，其已逐渐成为肿瘤研究中的热点分子。REMO等[17]利用组织芯片分析了炎性乳腺癌患者乳腺组织中NFAT5的表达情况，发现其中69.2%的炎性乳腺癌组织中都存在NFAT5的高表达，而其在非炎性乳腺癌中的表达率只有19.5%，提示NFAT5可作为炎性乳腺癌一个新的、可靠的生物标志物。研究人员还发现，NFAT5在非小细胞肺癌患者的病理分期中是一个独立的危险因素[18]。体外实验证实，NFAT5对人口腔鳞癌SCC-4和SCC-9细胞的增殖和迁移力有明显的促进作用，而对其凋亡则发挥抑制作用[19]。GUO等[20]研究显示，NFAT5能够通过上调水通道蛋白AQP5的表达水平进而促进肺癌细胞的迁移和增殖。
课题组前期研究发现，NFAT5能够促进人胃癌MGC803细胞增殖并抑制其凋亡[21]。为更加全面地探究NFAT5对胃癌细胞生物学功能的影响及其潜在的作用机制。此次研究以NFAT5基因为靶标，化学合成靶向NFAT5基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)以沉默NFAT5基因表达；同时观察NFAT5表达下调对人胃癌MGC803细胞迁移力、侵袭力及细胞周期分布的影响，以期为NFAT5成为胃癌治疗的新靶点提供更多、更可靠的实验和理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计基因水平的细胞转染实验，两组样本比较采用独立样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2019年3-12月在辽宁中医药大学生物化学与分子生物学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞系人胃癌MGC803细胞株购于北京北纳创联生物技术研究院。
1.3.2 主要试剂 DMEM培养基、PBS、胰酶、青链霉素和胎牛血清购于Hyclone公司；jetPRIME转染试剂购于Polyplus公司。TRIzol试剂购于TaKaRa公司；Real-time PCR试剂盒美国Bimake公司；Matrigel基质胶和Transwell小室均购于美国Corning公司；细胞周期试剂盒购于美国BD公司；siRNA由上海吉玛制药有限公司设计合成。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养人胃癌MGC803细胞株培养于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和链霉素的DMEM培养液中，37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养，常规消化传代。取对数生长期细胞进行后续实验。
1.4.2 细胞转染
实验分组：细胞分为siRNA阴性对照组和NFAT5-siRNA组。取生长状态良好处于指数生长期的细胞，常规胰酶消化，接种于6孔板中，(4.0-5.0)×105个/孔，12-24 h后汇合度达50%-70%。铺板24 h后，首先将细胞培养液更换为无抗DMEM培养液；然后制备siRNA转染液：准备2个1.5 mL EP管，分别加入200 μL jetPRIME缓冲液、5 μL siRNA阴性对照/NFAT5-siRNA(具体序列见表1)及5 μL jetPRIME转染试剂，涡旋10-15 s，室温孵育10 min；最后，将siRNA转染液加入已换成无抗DMEM培养基的6孔板中，4-6 h后更换为新的无抗DMEM培养基培养。24 h后更换为含体积分数10%胎牛血清的完全DMEM培养液继续培养。

1.4.3 实时定量PCR检测NFAT5 mRNA表达水平的改变转染48 h后收集细胞，采用TRizol法提取各样本的总RNA。取2 μg RNA采用反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行实时定量PCR扩增。反应条件为95 ℃ 5 min预变性，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环，以GAPDH为内参。采用2-ΔΔct法计算相对表达量，实验重复3次。引物序列见表2。

1.4.4 划痕实验检测细胞迁移力实验分为siRNA阴性对照组和NFAT5-siRNA组，每组设3个复孔。转染24 h后，用灭菌枪头在6孔板底部单层细胞的中央进行划痕，PBS冲洗3次，洗去死细胞后，加入DMEM培养液继续培养，然后分别在0，4，24和30 h显微镜下拍照，实验重复3次。
1.4.5 Transwell实验检测细胞侵袭力实验分为siRNA阴性对照组和NFAT5-siRNA组，每组设3个复孔。将Matrigel胶从-20 ℃移至4 ℃冰上解冻后，用PBS进行10倍稀释。取50 μL稀释后的Matrigel胶均匀涂抹于Transwell小室上表面后，将小室轻轻放入24孔板孔内，置于37 ℃培养箱1 h至基质胶凝固，备用。细胞转染24 h后，常规胰酶消化6孔板内细胞，1 200 r/min离心5 min弃上清，PBS洗涤1次，无血清培养液重悬，调整细胞浓度为(3-5)×108 L-1，取 100 μL加入Transwell小室，另取600 μL含体积分数10%胎牛血清和双抗的DMEM完全培养基加入下室。37 ℃孵育 24 h后，取出Transwell小室，用棉签擦拭残留在聚碳酯膜上表面的细胞及凝胶，PBS洗涤2次，体积分数70%的甲醇固定30 min，经苏木精染色60 s后，切下小室的聚碳酯膜，用树脂胶封固，自然晾干。20倍显微镜下随机取上、下、左、右、中 5 个视野计数穿膜细胞数，求出每个视野平均穿膜细胞数。实验重复 3 次。
1.4.6 流式细胞术检测细胞周期影响实验分为siRNA阴性对照组和NFAT5-siRNA组。细胞转染48 h后，常规胰酶消化细胞，收集细胞。预冷PBS洗涤1次，制成单细胞悬液，再逐滴加入预冷体积分数70%的乙醇，4 ℃避光过夜。1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS重悬细胞。加入PI染液，室温避光染色15 min。过300目筛网，上流式细胞仪，激发波长488 nm检测细胞周期。实验重复3次。
1.5 主要观察指标观察转染NFAT5-siRNA 48 h 后细胞迁移力、侵袭力及细胞周期分布的改变。
1.6 统计学分析采用SPSS 25.0统计学软件处理数据，计量数据用x±s表示，组间比较采用独立样本t检验，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

NFAT家族分子是一群具有多向调节功能的转录因子，参与T细胞的活化过程，在细胞的增殖、分化、侵袭、转移、胚胎发育、血管形成、器官发生、免疫反应及炎症反应和肿瘤微环境的调节中均发挥重要作用，与多种临床疾病的发生密切相关[22-24]。NFAT5作为NFAT家族的重要成员之一，是高渗透压激活的哺乳动物转录因子，在胰腺癌、肺癌、肾上腺皮质癌等多种肿瘤中异常表达[25-27]。体外实验证实，采用短发夹RNA干扰NFAT5基因表达后，人黑色素瘤 B16BL6细胞的增殖和迁移能力均明显降低[28]；在高糖诱导的人非小细胞肺癌细胞中，NFAT5对细胞的增殖、迁移和侵袭能力均有明显的促进作用[29]。李剑锋等[30]同样采用靶向NFAT5的siRNA转染宫颈癌Hela细胞后，细胞的增殖和转移能力均明显下降，细胞中TLR4和MyD88蛋白的表达水平也显著降低，提示NFAT5可能通过降低TLR4/MyD88信号通路活性进而抑制宫颈癌细胞的增殖和转移能力。于珊等[31]采用四君子汤含药血清处理人胃癌MGC803细胞后细胞的增殖力显著降低，而凋亡率则明显升高，且NFAT5表达水平明显降低。上述实验结果提示NFAT5可能介导四君子汤对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。
课题组前期研究证实，NFAT5沉默能够明显减弱人胃癌MGC803细胞的增殖力并提高其凋亡率[21]。在此次研究中，作者尝试进一步探究NFAT5对胃癌细胞生物学功能的影响。划痕实验结果显示，尽管在划痕初期(0 h和4 h)各组细胞的划痕宽度基本一致，但随着时间的推移，与NFAT5-siRNA组相比，siRNA阴性对照组细胞向划痕区域爬行越来越明显，NFAT5-siRNA组划痕的愈合能力明显低于siRNA阴性对照组；Transwell实验结果显示，抑制NFAT5基因表达后，穿过小室的胃癌细胞数目明显减少，细胞侵袭力明显下降，提示NFAT5能够有效增强胃癌细胞的迁移和侵袭能力。王建等[32]研究发现，NFAT5高表达可导致乳腺癌细胞的迁移和侵袭潜能增强。LEE等[33]证实，在类风湿性关节炎的研究中，NFAT5通过调节组织因子和趋化因子2的表达进而促进滑膜细胞的迁移和侵袭力。最近的研究结果显示，CircRNA 0001944通过吸附miR-142-5p以及上调NFAT5，促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和糖酵解[34]。此外，此次研究的流式细胞术实验结果还显示NFAT5-siRNA转染能够影响胃癌细胞的细胞周期分布，较多细胞被阻滞在G0/G1期，而S期细胞比例则显著降低，提示抑制NFAT5基因表达后细胞的增殖力也随之降低，这也与作者前期的研究结果相一致[21]。TIAN等[35]研究发现，沉默血管平滑肌细胞中的NFAT5表达能够抑制细胞的增殖、迁移，促进细胞的凋亡，提高了G1期和G2期细胞百分比，减少了S期细胞百分比，并伴有相关蛋白的表达变化。
与此次研究相类似，YOSHIMOTO等[36]证实，NFAT5能够通过诱导表皮生长因子受体从内质网向质膜的转移，进而在促进口腔癌细胞增殖中发挥重要的作用。研究发现，NFAT5对非小细胞肺癌A549和H1299细胞的增殖、迁移和侵袭力也有明显的促进作用[37]。在人肾细胞癌CaKi-1细胞中，NFAT5能够通过诱导S100A4表达进而增强细胞的增殖和侵袭能力[38]。
课题组前期研究发现，在人胃癌MGC803细胞中抑制NFAT5表达后S100A4表达水平也显著降低[21]。作为钙离子结合蛋白 S100家族的重要成员之一，S100A4在多种肿瘤组织中异常高表达，其过度表达与癌症进展密切相关[39]。近年研究发现，S100A4基因敲除可显著抑制咽鳞状细胞癌FaDu细胞的迁移和侵袭，增加G0/G1期细胞的比例[40]。LI等[41]利用组织芯片检测了不同来源胃癌及其癌旁组织中S100A4和MYH9的表达情况，发现与邻近正常组织相比，上述2个蛋白在腹膜转移灶和原发灶中持续高表达。S100A4的低表达导致细胞迁移力和侵袭力增强、上皮标志物增加以及间充质生成物减少，而S100A4的过度表达则导致相反的影响。CHEN等[42]通过ChIP实验证实，在结肠癌细胞中NFAT5与S100A4基因启动子区域存在体内结合，NFAT5能够在转录水平上正向调控S100A4基因表达从而促进细胞的增殖。课题组前期研究并报道了，S100A4能够影响胃癌细胞的干样特性并提高胃癌细胞的增殖和迁移能力[43-44]。高立红等[45]研究也证实，在胃癌细胞中干扰S100A4基因表达后，细胞的侵袭力明显下降，而凋亡率显著增加。提示在胃癌MGC803细胞中，S100A4基因启动子区域也可能受NFAT5蛋白调控激活，从而介导NFAT5对胃癌细胞多种生物学功能的影响。
综上所述，此次研究证实在人胃癌MGC803细胞中沉默NFAT5基因表达能够有效降低细胞的迁移力、侵袭力并改变细胞周期的分布抑制增殖力，上述细胞生物学过程在某种程度上可能是由S100A4介导实现的。NFAT5有望成为胃癌诊治的新靶点、新方向。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

活化T细胞核因子5对人胃癌MGC803细胞迁移、侵袭及细胞周期的影响

Effects of nuclear factor of activated T cells 5 on migration, invasion and cell cycle of human gastric cancer MGC803 cells

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