2.1   ADBM-EPO水凝胶中的EPO因子可缓慢释放   如前所述，利用脱细胞技术处理猪松质骨组织[30]，并在ADBM中加入EPO因子，可成功构建ADBM-EPO水凝胶，见图1A所示，溶解于DMEM培养基的ADBM-EPO水凝胶在37 ℃条件下呈水凝胶凝结状态。通过ELISA检测对EPO因子的释放特性进行表征，结果显示ADBM-EPO水凝胶中的EPO因子可以随时间缓慢释放，时间长达3周，第24天时EPO释放量达总量的95.48%，表明该水凝胶具有良好的缓释性能，见图1B。



2.2   ADBM-EPO水凝胶促进细胞的跨膜迁移   对培养板底部的跨膜细胞数量进行计数，发现ADBM水凝胶可以促进人骨髓间充质干细胞及人脐静脉内皮细胞的跨膜迁移，并且在复合EPO因子后(ADBM-EPO组)，人骨髓间充质干细胞及人脐静脉内皮细胞的跨膜迁移能力会进一步显著增强，见图2。



2.3   ADBM-EPO水凝胶促进细胞的划痕迁移   如图3所示，与对照组及ADBM组相比，12 h后ADBM-EPO组人骨髓间充质干细胞及人脐静脉内皮细胞的划痕距离明显缩小(P < 0.05，P < 0.01)，表明ADBM-EPO水凝胶可以有效促进人骨髓间充质干细胞及人脐静脉内皮细胞的迁移能力。



2.4   ADBM-EPO水凝胶促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化   培养4 d后，与对照组及ADBM组相比，ADBM-EPO组的人骨髓间充质干细胞的早期碱性磷酸酶活性水平明显增高(P < 0.05)，在图像中表现出更明显的染色；培养21 d后茜素红染色结果显示，ADBM-EPO组的人骨髓间充质干细胞表现出更明显的矿化结节，见图4。表明ADBM-EPO水凝胶可促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化。

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严重骨折创伤、骨科手术等造成的骨组织缺损，引发患者运动系统功能严重缺失、生活质量急剧下降甚至威胁生命。据统计，在国内每年行骨科手术患者高达600万，而需要骨移植物则高达300万之多[1]。近年来，随着生活水平的不断提高和老龄化趋势的进一步加重，当前对骨组织修复的需求越来越大，这些对骨科临床应用和骨组织重建修复研究领域都带来巨大挑战。
目前临床治疗骨缺损的方法主要有自体骨移植、同种异体骨移植及人工合成的生物材料替代物移植治疗等[2-3]。虽然自体骨移植物具有优良的成骨效果[4-5]，但自体骨移植物需要从自身骨组织获取，数量往往有限；此外，二次手术也增大了患者的痛苦和感染的风险[6]。同种异体骨移植物尽管来源丰富[7]，但存在免疫排斥和疾病传播的潜在风险[8]。近年来，基于人工合成生物材料制备的骨移植替代物已逐步应用到临床骨缺损修复治疗中[9-10]，但是这类材料的骨传导能力欠佳，并且随着材料在体内的降解会产生多种不良反应[11-12]。因此，设计和研究新的骨修复材料已经成为骨再生领域的重要研究方向之一。
近年来，以脱细胞脱钙骨基质(acellular decalcified bonematrix，ADBM)为代表的天然骨移植材料，由于与人体组织结构相似、生物相容性高等成为当前骨移植材料研究领域的一大热点[13-14]。ADBM是通过利用物理、化学或者酶解等方法将骨组织中含抗原性的细胞成分去除，由此得到的几乎没有免疫原性或较低免疫原性的骨移植生物材料[15-16]。大量研究表明，ADBM能够较好地保留骨组织中胶原等生物活性大分子及多种骨诱导生长因子，并且与骨组织有着更为相似的微结构特征，具有良好的生物相容性、生物力学性能及可降解特性等特点，而且可以和种子细胞及生长因子复合，是一种理想的骨修复材料，因此在骨缺损修复研究中有着巨大潜力和应用前景[13, 17]。
ADBM在骨缺损修复中的主要作用是促进骨再生，但骨修复过程中骨再生和血管生成是偶联在一起的，研究表明，血管再生在骨修复中具有关键作用[18]。促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)也叫红细胞刺激因子，是肾脏产生的由165个氨基酸组成的糖蛋白激素，其分子质量约为30.4 kD，能够与EPO 特异性受体相互作用，在造血系统、中枢神经系统等多种部位发挥多种效应。据报道，EPO参与了炎症性血管形成[19]、伤口愈合过程中血管新生及肿瘤新生血管形成等[19-21]。特别是近年来大量的研究证实，EPO不仅可以激活造血干细胞JAK/STAT信号通路，诱导骨形态发生蛋白2的产生进而促进骨形成[22-24]，而且EPO在体外也可以直接激活骨髓间充质干细胞形成成骨细胞，这一过程由mTOR及ephrinB2/EphB4等信号通路介导[25-26]。近年来有学者研究表明，EPO可以通过上调骨髓间充质干细胞中的肝细胞生长因子从而诱导骨髓间充质干细胞的迁移[27]。
基于以上的研究背景，实验认为通过制备负载EPO的ADBM(ADBM-EPO)水凝胶来发挥ADBM成骨和EPO成血管的双向作用，可能具有增强骨组织修复的作用。因此课题通过制备ADBM-EPO水凝胶，并验证其缓释性能、促细胞迁移和成骨性能，初步探索ADBM-EPO水凝胶在骨损伤修复中的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1    设计   体外对比观察实验。
1.2   时间及地点   实验于2019年6月至2020年9月在首都医科大学附属北京同仁医院骨科实验室完成。
1.3   材料   市售新鲜猪股骨；人骨髓间充质干细胞及人脐静脉内皮细胞购于苏州赛业生物科技公司；EPO购自苏州赛业生物科技公司；Human Erythropoietin ELISA Kit 试剂盒购自英国Abcam公司；三氯乙胺、甲醇、乙二胺四乙酸(EDTA)、甲基磺酰氟(PMSF)、CaCl2、LiCl、Tris-HCl缓冲液、TritonX-100、DNase I、RNase I、NaOH、多聚甲醛、结晶紫染液、乙醇、十六烷基吡啶溶液购自北京化学试剂公司；α-MEM培养基、M199培养基、胎牛血清、内皮细胞生长因子、青霉素/链霉素双抗溶液、肝素、维生素C、碱性磷酸酶试剂盒购于美国赛默飞公司；Transwell小皿购于美国康宁公司；基质胶(Matrigel)购于美国BD公司。
1.4   实验方法   
1.4.1   ADBM-EPO水凝胶的制备   取市售新鲜家猪股骨近端和远端松质骨，切成5 mm薄骨片，冲洗骨髓。将松质骨颗粒与三氯乙胺、甲醇脱脂液(质量体积比=30∶1)混合，4 ℃300 r/min搅拌72 h，脱脂；将松质骨颗粒放入0.6 mol/L的HCl中，搅拌条件不变，脱钙。加入2 mmol/L CaCl2溶液搅拌1 h，加入0.5 mmol/L EDTA搅拌1 h，8 mmol/L的LiCl处理1 h后，蒸馏水冲洗晾干，得到松质骨颗粒。
将获得的松质骨颗粒加入含1 mmol/L苯甲基磺酰氟的Tris-HCl 缓冲液，再混合1% TritonX-100搅拌处理12 h，使用去离子水反复冲洗干净；之后将产物与50 U/mL的DNase I和1 U/mL的RNase I 消化液混合搅拌处理12 h，去离子水冲洗干净，冷冻干燥制成脱钙骨基质冻干海绵。
称取1 g脱钙骨基质冻干海绵，溶于 20 mL的HCl溶液(0.01 mol/L )，加入胃蛋白酶100 mg，4 ℃300 r/min搅拌96 h，用0.1 mol/L NaOH调整 pH值至中性，利用DMEM溶液将产物质量浓度至2.5 g/L。向获得的产物中按照10 U/mL浓度添加EPO，搅拌混匀后，37 ℃条件下放置 20 min可制备成ADBM-EPO水凝胶[28-29]。同理制备ADBM水凝胶。
1.4.2   EPO因子的释放曲线   将ADBM-EPO水凝胶置于6孔板中，每孔加入3 mL的PBS模拟体液，分别在第0，4，8，12，16，20，24天用移液枪吸取200 μL释放液，并用PBS补齐。将获得的释放液利用Human Erythropoietin ELISA Kit 试剂盒检测EPO释放量占总载量的百分比，绘制EPO因子的释放曲线。
1.4.3   人骨髓间充质干细胞的培养   按照1×104/孔的密度将BMSCs接种于24孔板中，对照组的培养基配方为：α-MEM培养基中添加体积分数10%胎牛血清及1%青霉素/链霉素双抗溶液；ADBM组的细胞培养方式为将ADBM水凝胶置于孔板底部，再以对照组的培养基培养细胞；ADBM-EPO组的细胞培养方式为将ADBM-EPO水凝胶置于孔板底部，再以对照组的培养基培养细胞。每2 d更换新鲜培养基一次。
1.4.4   人脐静脉内皮细胞的培养   按照1×104/孔的密度将人脐静脉内皮细胞接种于24孔板中。对照组的培养基配方为：M199基础培养基中添加体积分数20%胎牛血清、20 µg/L内皮细胞生长因子、50 U/mL肝素、50 mg/L的维生素C、1%青霉素/链霉素双抗溶液；ADBM组的细胞培养方式为将ADBM水凝胶置于孔板底部，再以对照组的培养基培养细胞；ADBM-EPO组的细胞培养方式为将ADBM-EPO水凝胶置于孔板底部，再以对照组的培养基培养细胞。每2 d更换新鲜培养基一次。
1.4.5   ADBM-EPO水凝胶对细胞跨膜迁移的影响   将ADBM及ADBM-EPO水凝胶系统分别置于24孔板底部，每孔加入500 µL的DMEM无血清培养基；取8 μm孔径的Transwell小皿，每孔加入30 μL体积的基质胶，37 ℃条件下静置20 min使其成胶；将小皿放入24孔培养板中，每孔小室内种植100 μL含细胞数量为1×104个的细胞悬液(人骨髓间充质干细胞或人脐静脉内皮细胞)，利用含有0.1%牛血清白蛋白的无血清及因子的α-MEM和M199培养基分别培养人骨髓间充质干细胞或人脐静脉内皮细胞。
24 h后取出Transwell小室，PBS 清洗内部，棉签擦净内膜细胞。加入4 ℃预冷的40 g/L多聚甲醛固定液固定细胞20 min，利用PBS洗涤细胞3次，0.05%结晶紫染色液对细胞进行染色。在显微镜下进行观察拍照，每组至少重复三四个样品，用于细胞计数。
1.4.6   ADBM-EPO水凝胶对细胞划痕迁移的影响   将ADBM及ADBM-EPO水凝胶通过冷冻干燥分别固载在24孔板底部，将人骨髓间充质干细胞及人脐静脉内皮细胞悬液按照1×104/孔分别接种在孔板底部表面，贴壁形成单层细胞后，用无菌20 μL枪头均匀划4条横线，每条横线间隔约1 cm，用PBS洗细胞3次，以去除划下的细胞。将3组细胞放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱培养。在0及12 h的时间点下显微镜下拍照，测量划痕闭合宽度。使用Image J软件打开图片后，随机划取6-8条水平线，计算细胞间距离的均值，以时间为横轴、迁移面积百分比(%)为纵轴作图，并比较初始与实验结束时3组的照片。
1.4.7   ADBM-EPO水凝胶对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响   将3组细胞以1×105/每孔接种在6孔板中，每种细胞又分为普通培养组和成骨诱导培养组，在成骨诱导后第4，21天分别进行碱性磷酸酶及茜素红染色及定量实验。 
碱性磷酸酶染色及定量实验：成骨诱导后第4天，吸去原有培养基，PBS冲洗3次。体积分数95%乙醇室温下固定20 min，PBS洗涤3次。根据说明书配制显色工作液，混匀后加入培养板中。培养板避光放置5-30 min，直至显色有明显差异。去除显色工作液，用PBS洗涤2次终止显色反应，随后进行扫描留影。
成骨诱导后第4天，吸去原有培养基，使用PBS冲洗3次。每孔加入500 μL 1% TritonTM X-100裂解细胞。4 ℃条件下12 000×g离心30 min。收集上清，得到细胞蛋白裂解液。按照BCA定量检测试剂盒产品说明书进行蛋白定量。使用碱性磷酸酶试剂盒，根据产品说明书进行碱性磷酸酶活性定量与结果分析。其中待测样本即为前述所得的细胞蛋白裂解液，每份样本设置3个副孔，酶标仪520 nm下测量吸光度值，根据说明书计算每克蛋白所产生的碱性磷酸酶活性(U/mg)。
茜素红矿化结节染色及定量检测：成骨诱导后第21天，弃去培养基，PBS冲洗3次。体积分数95%乙醇室温下固定20 min，双蒸水冲洗2次。加入1%茜素红染液(1 g茜素红粉末溶解于100 mL双蒸水，氨水调pH=4.2)。室温下放置1 h，观察到着色有明显差异后双蒸水冲洗多次至没有浮色，进行拍照。
染色后的培养板进行后续定量检测试验。在孔板内加入100 nmol/L十六烷基吡啶溶液，完全溶解后分别取出100 μL于96孔板，酶标仪562 nm波长下测定吸光度值。
1.5   主要观察指标   ADBM-EPO水凝胶的缓释性能、对人骨髓间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞的跨膜侵袭的调控作用，以及对人骨髓间充质干细胞的促成骨作用。
1.6   统计学分析   使用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，所有数据表示为x±s。对于两组间数据，采用t检验方式；对于3组或3组以上数据比较，则采用单因素方差方法分析。P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

传统的骨组织工程包括种子细胞、生长因子和支架材料[31]，由于种子细胞来源有限、有一定免疫原性及存在伦理学等问题，临床获批较为困难[32]。近年来，不依靠种子细胞的体外培养扩增，直接依靠材料本身的生物活性诱导组织再生，为骨再生修复提供了新思路[33]。在骨缺损处，具有生物诱导活性的材料促进机体细胞如人骨髓间充质干细胞及人脐静脉内皮细胞向缺损局部迁移，诱导细胞成骨及成血管化，从而原位诱导骨缺损修复，这可作为骨组织工程骨缺损修复的一个良好选择。
利用脱细胞技术对骨组织进行脱细胞可获得ADBM[34-35]，常用的脱细胞技术包括利用冻融等方式的物理法[36]、利用除垢剂等的化学法[37]、利用酶解法等的生物制剂法及细胞凋亡诱导法等[38-39]。文献报道，非离子型除垢剂Triton X-100因不含电荷而对蛋白结构影响最小，较适合用于组织脱细胞[40]。所以实验选用化学脱细胞法，利用非离子型除垢剂Triton X-100对猪股骨进行脱细胞形成具有良好生物相容性的ADBM。
ADBM因其良好的生物相容性、可降解性和生物诱导能力已被广泛用于骨修复。ADBM用于植骨已有40多年的研究[41]，目前市场上有25种不同的ADBM产品[42]。经脱细胞后，ADBM仍具有与骨组织相似的微观结构，并含有胶原蛋白及转换生长因子、骨形态发生蛋白等生长因子。其中，Ⅰ型胶原可提供骨组织中矿物沉积的模板和形核位点，是骨矿化不可缺少的成分[43-44]。转换生长因子和骨形态发生蛋白等生长因子可原位募集间充质干细胞，促进细胞附着、迁移和分化，促进钙磷沉积，原位诱导羟基磷灰石自组装矿化，继而原位诱导骨再生[45]。在体外，ADBM可促进人骨髓间充质干细胞的增殖、增加碱性磷酸酶[46-47]；在体内，ADBM可促进骨缺损区的成骨[48-49]。此次实验发现，与对照组相比，ADBM组单位面积跨膜的人骨髓间充质干细胞及人脐静脉内皮细胞数量均明显增多，同时人骨髓间充质干细胞及人脐静脉内皮细胞的划痕距离缩小，表明ADBM可促进骨髓间充质干细胞及血管内皮细胞的细胞迁移。碱性磷酸酶及茜素红染色和定量结果表明，与对照组相比，ADBM可促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化，这与以往文献报道的一致，作者推测ADBM促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的机制是ADBM为人骨髓间充质干细胞提供了细胞生长的支架，并且ADBM中Ⅰ型胶原、转换生长因子和骨形态发生蛋白发挥了各自的重要作用[43-49]。
ADBM在骨缺损修复中的主要作用是促进骨再生，但骨修复过程中骨再生和血管生成是偶联在一起的，血管再生在骨修复中具有关键作用[50]，因此作者试图在可以促成骨的ADBM中负载一种可以促血管生成的因子，以便更好地发挥生物材料的促成骨效果。通过查阅文献发现，EPO除促进红系细胞的发育外，还参与了抗凋亡[51-52]、抗缺氧[53]、促进新生血管生成等[53-54]，且EPO促进血管生成是通过AMPK-KLF2及激活造血干细胞JAK/STAT等信号通路，诱导骨形态发生蛋白2的产生进而促进骨形成实现的[55]。并且有文献表明，EPO在体外也直接激活人骨髓间充质干细胞形成成骨细胞，这一过程受mTOR及ephrinB2/EphB4等信号通路的调控[25-26]。近年来也有研究表明，EPO可以通过上调人骨髓间充质干细胞中的肝细胞生长因子诱导人骨髓间充质干细胞的迁移[27]。因此实验将EPO负载于ADBM中构建负载了EPO的ADBM水凝胶，发现ADBM-EPO水凝胶中的EPO因子可缓慢释放，表明ADBM-EPO水凝胶具有良好的缓释效果。进一步的实验结果表明，与对照组及ADBM组相比，ADBM-EPO可显著促进人骨髓间充质干细胞及人脐静脉内皮细胞的细胞迁移，并且可以明显促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化。作者推测ADBM负载EPO后人骨髓间充质干细胞的成骨分化进一步得到促进的机制可能是EPO诱导了人骨髓间充质干细胞及人脐静脉内皮细胞的迁移[27]，并受到mTOR及ephrinB2/EphB4等信号通路的调控[25-26]。
综上所述，这种生物性能良好ADBM-EPO水凝胶具有ADBM促成骨和EPO促成血管的双向作用，具有增强骨组织修复的潜能。这为骨缺损修复研究提供了思路。但后期需要进行动物实验来确认该水凝胶在体内的成骨和成血管效果，同时负载EPO因子的ADBM水凝胶对人骨髓间充质干细胞及人脐静脉内皮细胞的促成骨及促成血管双向调控作用的机制还需进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

促红细胞生成素：一种人体内源性糖蛋白激素，可刺激红细胞生成，近期被证实参与了炎症性血管形成、伤口愈合过程中血管新生及肿瘤新生血管形成等过程。

脱细胞脱钙骨基质：通过脱细胞的方法来去除骨组织中抗原性强的各种细胞，而选择性地保留有生物活性物质的骨基质，具有良好的生物相容性和生物力学性能，而且可以和种子细胞及生长因子复合，是一种理想的骨修复材料，具有广阔的应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

骨再生是成骨和成血管相偶联的再生过程。为了同时促进成骨和成血管，实验制备了含有促红细胞生成素和脱细胞骨脱钙基质的水凝胶，该水凝胶具有优异的缓释效果；#br# 含有促红细胞生成素和脱细胞脱钙骨基质的水凝胶在缓释过程中能促进人脐静脉内皮细胞的迁移，表明该水凝胶具备募集血管内皮细胞形成血管的能力；#br# 该水凝胶在缓释过程中能促进骨髓间充质干细胞的迁移和成骨向分化，表明该水凝胶可以招募干细胞并促进其成骨向分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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