2.1   骨关节炎差异表达基因的获得   对骨关节炎基因芯片GSE55235进行差异表达分析，进行数据标准化，得到骨关节炎差异表达基因共990个；进行可重复性主成分分析(PCA)验证，选取前50个差异基因进行可视化热图处理，见图1。



2.2   骨关节炎坏死性凋亡基因的获得   在GeneCards数据库的检索窗口中以“necroptosis”为关键词，共筛选出690个坏死性凋亡相关基因，利用R语言软件“VennDiagram”包将获得的990个骨关节炎差异表达与690个坏死性凋亡相关基因作交集，共获得38个骨关节炎坏死性凋亡基因，见图2。



2.3   GO和KEGG富集分析    通过R语言Bioconductor包对38个骨关节炎坏死性凋亡基因进行GO和KEGG富集分析，结果发现骨关节炎坏死性凋亡基因主要在白细胞增殖、T细胞活化、白细胞介素17信号通路等方面显著富集，见图3，表2。







2.4   PPI网络构建及Hub基因筛选   采用String数据库建立共同疾病基因的PPI互作网络，该网络包含34个节点和70条边，见图4。通过网络拓扑分析，并利用5种不同计算方法分别筛选出排名前10位的基因，进行交集后得到5个Hub基因：CYBB、FADD、IL1B、MYC及EGFR，见表3及图5。











2.5   Hub基因的动物实验验证   
2.5.1   大体观察   造模48 h后，骨关节炎组大鼠左后肢出现肿胀、屈伸功能障碍，跳步、拖步、活动减少等症状。6周后，用1.5%戊巴比妥钠(150 mg/kg)腹腔过量注射麻醉至死，用咬骨钳将雄性SD大鼠左后肢膝关节离断，取膝关节组织(股骨髁及胫骨平台)对比，大体可见：正常对照组关节软骨色泽均匀，表面平滑；骨关节炎组关节软骨局部失去透明光泽，表面结节状膨隆不整，软骨表面磨损，可见小裂隙，小溃疡，残存有软骨纤维状，且以胫骨内侧平台软骨明显，符合膝骨关节炎中期病理改变[10]，见图6，证明膝骨关节炎中期模型造模成功。



2.5.2   大鼠软骨标本中Hub基因相对表达量   5个Hub基因相对表达量情况如表4及图7所示，与正常对照组比较，骨关节炎组中EGFR、IL1B基因高表达(P < 0.05)，CYBB、MYC基因低表达(P < 0.05)，FADD基因表达无明显变化(P > 0.05)。

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骨关节炎是一种好发于中老年人群的慢性、退行性关节疾病，常伴有关节疼痛、活动困难等症状，甚至会引起残疾而导致劳动力丧失。目前全世界范围内罹患骨关节炎的人数超过2.5亿[1]，在60岁以上人群中，约有10%的男性和18%的女性受其困扰[2]。虽然骨关节炎发病原因不明，但随着研究不断深入，骨关节炎被定义为一种慢性、低度炎症性疾病的观点逐渐为人们所接受。骨关节炎中的慢性、低度炎症参与关节软骨破坏，而被破坏的软骨则会进一步损伤关节中平滑的骨骼连接结构，导致软骨下骨硬化及骨赘形成等，加快骨关节炎进展[3-4]。因而，从炎症角度探索骨关节炎的发病机制就显得尤为重要。

坏死性凋亡是一种由死亡受体介导、具有广泛炎症特性并受RIPK1-RIPK3-MLKL复合物严格调控的新型细胞死亡途径，常引发疼痛、细胞外基质受损及软骨破坏等典型骨关节炎表现[5-6]。在骨关节炎软骨中，受肿瘤坏死因子ɑ等炎症因子刺激后，坏死性凋亡标志物RIPK1及RIPK3表达上调[7]，抑制坏死性凋亡可明显减轻关节软骨破坏，延缓骨关节炎进展[8]，有效证实了坏死性凋亡在骨关节炎发展进程中发挥重要作用。目前有关骨关节炎坏死性凋亡的报道少见，其作用机制尚不明确。因此，利用有效手段挖掘出坏死性凋亡在骨关节炎中的潜在作用靶点，有利于从坏死性凋亡角度进一步探讨骨关节炎的发病机制。

生物信息学作为当前生物医学领域利用现代化信息手段进行辅助研究的一种新兴技术，可从基因分子角度探讨疾病间的潜在作用规律。故而，此次研究基于生物信息学，挖掘出坏死性凋亡参与骨关节炎发生、发展的关键基因，并通过雄性SD大鼠造模加以验证，旨在为阐明骨关节炎发病机制提供新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   生信分析+实验验证的“干湿相结”型。
1.2   时间及地点   实验于2022-01-01/03-30在广西中医药大学及江西中洪博元生物技术有限公司完成。
1.3   材料
1.3.1   生信数据库及分析工具    GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、String在线分析网站(https://cn.string-db.org/)，Cytoscape软件(版本3.9.1)、SPSS 20.0统计学软件。
1.3.2   实验动物   6只雄性SD大鼠，六七周龄，体质量200-300 g，SPF级，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0008。饲养条件：普通饲料饲养，温度20-26 ℃，湿度40%-70%，模拟自然光照12 h/d。实验已获江西中洪博元生物技术有限公司动物实验伦理审查批准(编号：2022012001)。
1.3.3   实验试剂   液氮；MolPure Bone RNA Kit骨组织RNA提取试剂盒(HB210329，YEASEN)；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(R223-01，Vazyme)；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02，Vazyme)；50×TAE缓冲液(T1060，Solarbio)；6×DNA Lodding Buffer(GH101-01，TRANS)；50 bp DNA Ladder(MD108，TIANGEN)；Gsafe Red plus核酸染料(GK20002，GLPBIO)；琼脂糖粉(75510-019，Invitrogen)。
1.3.4   实验设备   -80 ℃冰箱(BDF-86V348，BIOBASE)；医用低温保存箱(DW-25L262，Haier)；移液枪(0.1-2.5 µL、0.5-10 µL、20-200 µL、100-1 000 µL各一把，eppendorf)；常温离心机(TD-4M，BIOBASE)；全自动样品快速研磨仪(Tiss-12，上海净信实业发展有限公司)；高速台式冷冻离心机(H1750R，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；微型离心机(D1008E，SCJLOGEX)；旋涡混合器(XH-C，常州越新仪器制造有限公司)；紫外分光光度仪(NP80，NanoPhotometer)；电泳仪(DYY-8C，北京六一生物科技有限公司)；普通PCR扩增仪(TC-EA，杭州博日科技有限公司)；荧光PCR仪(CFX Connect™实时，伯乐生命医学产品有限公司)；超高灵敏度化学发光成像系统仪(Chemi DocTM XRS+，伯乐生命医学产品有限公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   骨关节炎坏死性凋亡关键基因的生物信息学筛选

骨关节炎差异表达基因的筛选： GEO数据库是美国官方机构所开发并定期更新的信息共享网站，已囊括世界各科研场所上传的各种生理或病理状态相关基因数据，可供免费查阅与使用。在该网站搜索栏输入“osteoarthritis”作为检索词，获取骨关节炎基因芯片GSE55235。此芯片包含10例骨关节炎患者及10名健康人群的基因表达数据。通过数据分析及可视化软件R语言的“limma”包，并以P≤0.05和|logFC|≥1为输出条件，筛选骨关节炎的差异表达基因。

骨关节炎坏死性凋亡基因的筛选：GeneCards是一非盈利机构创建并维护的综合生物信息数据库，可提供简明基因组、蛋白质组及相关人类基因的查询服务。在此数据库中以“necroptosis”为关键词，筛选出坏死性凋亡相关基因；再使用R语言软件“VennDiagram”包将骨关节炎相关基因与先前已经筛选出的坏死性凋亡相关基因作交集，进而获得既在骨关节炎表达，又在坏死性凋亡中表达的骨关节炎坏死性凋亡基因。
GO批注和KEGG途径富集分析：基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)是生物信息学中常用的基因富集方式，可从细胞成分(CC)、分子功能(MF)、生物过程(BP)及信号通路角度揭示疾病分子层面的潜在机制。在R语言中下载“clusterProfiler”“DOSE”和“pathview”3个包后，对骨关节炎坏死性凋亡相关基因进行处理及注释，以便于后续分析。

骨关节炎坏死性凋亡基因PPI网络构建：String数据库是一个分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的在线资源平台。为揭示骨关节炎坏死性凋亡相关基因相互作用关系，使用String数据库以综合得分≥0.4为输出条件，构建蛋白互作网络(PPI网络)，便于骨关节炎坏死性凋亡关键基因的鉴定。

骨关节炎坏死性凋亡关键基因的筛选：Cytoscape是一款可视化导出数据结果的生物信息学统计工具，可对骨关节炎坏死性凋亡基因的PPI网络进行拓扑学分析。利用其“CytoHubba”插件中Degree(度中心性)、Closeness(接近中心性)、Betweenness(中介中心性)、Stress(压力中心性)及BottleNeck(瓶颈中心性)5种不同计算方法各自筛选出排名前10的基因，交集后得到Hub基因即骨关节炎坏死性凋亡关键基因。
1.4.2   Hub基因的动物实验验证

雄性SD大鼠骨关节炎造模：由于膝骨关节炎中期关节软骨中存在显著坏死性凋亡现象[8]，故采用改良Hulth法制造膝骨关节炎中期模型[9]。取6只雄性SD大鼠，按随机数字法分为正常对照组及骨关节炎组，每组3只。适应性饲养7 d后，骨关节炎组使用1.5%戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射麻醉后，剪除左后肢膝关节周围毛发，常规消毒，髌旁内侧打开膝关节，切断前交叉韧带，切除内侧半月板，采用“前抽屉实验”确认前交叉韧带完全断裂。正常对照组大鼠左后肢不做处理。6周后取左后肢膝关节软骨，用于后续RT-PCR检测。

RT-PCR法检测软骨标本Hub基因表达情况：用骨组织RNA提取试剂盒(HB210329，YEASEN)提取6只雄性SD大鼠(3只对照组、3只骨关节炎组)软骨组织中的总RNA，利用紫外可见分光光度计测定mRNA的浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA质量，通过mRNA反转录试剂盒合成cDNA，利用荧光PCR仪进行荧光定量PCR(荧光染料法)，以β-actin作为内参，操作体系及反应程序：2×miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 10 µL，cDNA 1 µL，上游引物0.4 µL，下游引物0.4 µL，RNase Free ddH2O 8.2 µL；预变性95 ℃ 10 min，循环1次；变性95 ℃10 s，退火58 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，循环40次。5个Hub基因(CYBB、FADD、IL1B、MYC、EGFR)相对表达量根据2-ΔΔCt法计算，基因及内参引物信息见表1。相对表达量是指目的基因在骨关节炎组中的表达相对于在正常对照组表达的倍数。在P < 0.05的情况下，如果2-ΔΔCt小于1，说明目的基因在骨关节炎组中低表达，大于1则说明高表达，否则表达无差异。

1.5   主要观察指标   坏死性凋亡参与骨关节炎发生、发展的关键基因。
1.6   统计学分析   应用SPSS 20.0软件进行统计分析。所有实验重复3次，定量结果采用x±s表示。两组之间定量数值比较采用独立样本T检验，P < 0.05则代表差异有显著性意义。统计学方法已由广西中医药大学第一附属医院郭锦荣审核。

骨关节炎是好发于中老年人群的常见骨科疾病，目前病因尚未明确。虽有研究表明，坏死性凋亡从炎症角度参与了骨关节炎进展，但作用机制不详[11]。因此，基于生物信息学及动物实验挖掘出骨关节炎坏死性凋亡的关键基因，对从坏死性凋亡角度进一步探讨骨关节炎发病机制具有重要意义。

通过GEO及GeneCards数据库分别筛选出骨关节炎相关基因与坏死性凋亡相关基因，交集后获得38个骨关节炎坏死性凋亡基因；进而通过GO及KEGG分析发现，骨关节炎坏死性凋亡基因主要在白细胞增殖、T细胞活化、白细胞介素17信号通路等方面显著富集。坏死性凋亡又称为炎性细胞死亡，已成为骨关节炎等多种炎症性疾病调控机制之一[12-13]。白细胞作为身体防御系统的重要组成部分，当炎症反应出现时会引起白细胞的有效募集[14]。关节炎症是骨关节炎的重要特征之一，在给予富含白细胞的血浆后，骨关节炎关节中软骨磨损的部分会覆盖重生的纤维软骨[15]，提示白细胞可能介导坏死性凋亡发挥炎症作用，进而调控软骨的重塑。部分学者认为，骨关节炎早期阶段关节中存在由活化T细胞诱导的炎症反应[16]，而T细胞的稳态又在一定程度上依赖于RIPK3介导的坏死性凋亡[17]。由此可以推断，坏死性凋亡可能调控T细胞稳态引起关节炎症，加速骨关节炎退变。此外，也有证据表明坏死性凋亡在炎症触发时会释放出丰富的炎症递质，放大Th17细胞的效应子功能分泌白细胞介素17[18]，进而通过白细胞介素1/白细胞介素17信号通路诱导软骨破坏加快，在骨关节炎发展中起关键作用[19]。

进一步通过网络拓扑分析，利用5种不同计算方法分别筛选出排名前10位的基因进行交集，结果获得5个Hub基因：CYBB、FADD、IL1B、MYC及EGFR；且RT-PCR检测结果提示，CYBB、IL1B、MYC及EGFR基因在SD大鼠骨关节炎软骨组织中存在显著差异性表达，其中EGFR、IL1B呈高表达，CYBB、MYC呈低表达，而FADD无显著差异。查阅相关文献，虽未发现以上4个差异表达基因(CYBB、IL1B、MYC及EGFR)从坏死性凋亡角度调控骨关节炎的研究报道，但却与骨关节炎及坏死性凋亡存在相关联系。

坏死性凋亡依赖于MLKL的激活，激活的MLKL则会引起活性生物体内由IL1B编码的白细胞介素1β的加工和释放[20]，而白细胞介素1β的释放又是骨关节炎患者关节软骨变性的重要因素[21]。坏死性肌纤维中释放的肌腱蛋白受到坏死性凋亡的严格控制，并能通过其N端组装域和EGF样域直接激活肌肉干细胞中的EGFR蛋白，进而促进包括骨骼肌肉在内的多种细胞类型的细胞增殖[22]；而在特定信号通中，EGFR可在上游miR-7的诱导后激活下游MEGF9促进关节软骨降解，加快骨关节炎进展[23]。MYC的消耗或缺失可促进RIPK1-RIPK3相互作用，从而稳定RIPK1和RIPK3的表达并促进坏死性凋亡[24]，而其家族成员C-MYC的表达却可以通过减少软骨细胞谷氨酰胺代谢水平，减轻骨关节炎[25]。CYBB又称NOX2，部分来源于炎症小体NLRP3刺激后过量积累的活性氧[26]，而由线粒体功能障碍引起的活性氧水平增加是衰老的标志之一，可破坏软骨中合成代谢和分解代谢活动平衡，促进基质破坏并伴有软骨细胞凋亡[27]；而坏死性凋亡标志物RIPK1又可部分控制线粒体活性氧的水平，导致坏死体激活和Caspase丢失，使细胞凋亡转变为坏死性凋亡[28]，但这却与雄性SD大鼠软骨组织中CYBB基因呈低表达现象相反，可能是实验操作误差所致，有待进一步考证。

综上所述，通过生物信息学及动物实验的综合分析，发现CYBB、IL1B、MYC及EGFR基因在雄性SD大鼠骨关节炎软骨中存在显著差异性表达，是骨关节炎坏死性凋亡的关键基因，这为今后骨关节炎防治提供一种新思路。但研究也存有不少局限之处，例如：使用GEO数据库获取骨关节炎差异基因时，上传数据的科研人员对骨关节炎分期诊断可能存在主观性认知，很难确保下载数据样本都具有相同的骨关节炎分期；此外，虽然进行了动物实验，但样本量偏少，难免出现分析偏差，以期同病理分期、大样本数据、多实验标本优化此研究方案。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
骨关节炎：是一种与慢性、低度炎症相关的退行性关节疾病，好发于中老年人群，常伴有关节疼痛、活动困难等症状，甚至会引起残疾而导致劳动力丧失。
坏死性凋亡：是一种由死亡受体介导、具有广泛炎症特性并受RIPK1-RIPK3-MLKL复合物严格调控的新型细胞死亡途径，可引发疼痛、细胞外基质受损及软骨破坏等典型骨关节炎表现。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨关节炎是中老年人群常见的慢性疾病，病因尚未明确，但慢性、低度炎症与其密切相关，可损伤关节中平滑的骨骼连接结构，导致软骨下骨硬化及骨赘形成，加快骨关节炎进展。坏死性凋亡是一种具有广泛炎症特性的新型细胞死亡途径，常引发疼痛、细胞外基质受损及软骨破坏等典型骨关节炎表现，目前尚未发现骨关节炎坏死性凋亡的相关靶点。此次实验基于生物信息学筛选出骨关节炎的关键基因，并用动物实验加以验证，具有一定创新性，这或可为阐明骨关节炎发病机制提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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