补骨脂-淫羊藿对类风湿关节炎抗炎机制的分子对接分析：动物实验验证

doi:10.12307/2023.874

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (2): 208-215.doi: 10.12307/2023.874

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补骨脂-淫羊藿对类风湿关节炎抗炎机制的分子对接分析：动物实验验证

冉磊1，2，韩海慧1，2，徐博1，2，王建业1，2，沈军2，肖涟波2，3，施杞3

1上海中医药大学光华临床医学院，上海市 201203；2上海中医药大学附属光华医院关节外科，上海市 200052；3上海市中医药研究院中西医结合关节炎研究所，上海市 200052

收稿日期:2022-12-05 接受日期:2023-01-29 出版日期:2024-01-18 发布日期:2023-06-30
通讯作者: 肖涟波，博士，主任医师，博士生导师，上海中医药大学附属光华医院关节外科，上海市 200052；上海市中医药研究院中西医结合关节炎研究所，上海市 200052
作者简介:冉磊，男，1993年生，陕西省西安市人，汉族，上海中医药大学在读博士，医师，主要从事骨与关节慢性筋骨病的中西医结合的研究。
基金资助:
上海市卫生健康委员会上海市临床重点专科建设项目(shslczdzk04801)，项目负责人：肖涟波；上海市自然基金面上项目(22ZR1453100)，项目负责人：肖涟波；上海市中医临床高地重点领域建设[ZY(2021-2023)-0201-06]，项目负责人：肖涟波；上海市自然基金面上项目(22ZR1453000)，项目负责人：沈军

Molecular docking analysis of the anti-inflammatory mechanism of Cibotium barometz and Epimedium for rheumatoid arthritis: animal experiment validation

Ran Lei1, 2, Han Haihui1, 2, Xu Bo1, 2, Wang Jianye1, 2, Shen Jun2, Xiao Lianbo2, 3, Shi Qi3

1Shanghai Guanghua School of Clinical Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 2Department of Joint Surgery, Guanghua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200052, China; 3Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Arthritis, Shanghai Institute of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200052, China

Received:2022-12-05 Accepted:2023-01-29 Online:2024-01-18 Published:2023-06-30
Contact: Xiao Lianbo, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Joint Surgery, Guanghua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200052, China; Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Arthritis, Shanghai Institute of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200052, China
About author:Ran Lei, MD candidate, Physician, Shanghai Guanghua School of Clinical Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; Department of Joint Surgery, Guanghua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200052, China
Supported by:
Shanghai Key Specialty Construction Project, No. shslczdzk04801 (to XLB); Shanghai Natural Foundation General Projects, Nos. 22ZR1453100 (to XLB) and 22ZR1453000 (to SJ); Construction of Key Areas in Shanghai's Clinical Highlands for Chinese Medicine, No. ZY(2021-2023)-0201-06 (to XLB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

类风湿关节炎：是一种慢性的自身免疫疾病，其特征是以小关节为主的关节炎症及周围组织的疼痛和肿胀，常与其他类风湿疾病，如系统性红斑狼疮和类风湿性心脏病等合并发生。随病情加重可逐步导致关节软骨破坏、关节畸形，严重影响患者的日常生活及生活质量。
分子对接技术：是一种用于确定药物分子与靶分子之间相互作用的方法。目前可研究中草药活性成分与生物靶点的相互作用，有助于揭示中草药的药理作用机制，如研究中药抗癌、抗炎和抗病毒活性的分子机制，并为中草药的药效预测、质量标准和药物设计提供依据。

背景：临床上补骨脂-淫羊藿治疗类风湿关节炎疗效明显，但两者所含有效成分复杂，在分子水平上治疗类风湿关节炎的作用机制仍不明确。

目的：基于网络药理学和分子对接技术建立胶原诱导型关节炎模型，验证补骨脂-淫羊藿治疗类风湿关节炎可能的作用靶点及通路，为以补骨脂-淫羊藿为主的临床方剂使用提供可靠的实验依据。
方法：借助中医药研究平台、中医百科全书和上海有机所的中药与化学成分数据库等检索并筛选有效成分，从PubChem平台获取3D分子式，通过PharmMapper和SwissTargetPrediction平台进行靶标预测；结合DrugBank、GeneCards、OMIM等基因数据库完成类风湿关节炎的疾病靶点获取，经Uniport数据库校准靶标，借助VENNY 2.1获取补骨脂-淫羊藿与疾病交集靶点并绘制韦恩图；采用STRING平台构建蛋白质互作网络图；使用Metascape平台进行基因本体论功能分析及京都基因与基因组百科全书分析，进行数据可视化，利用Cytoscape 3.9.0构建中药-成分-靶点-疾病-通路四重网络模型；运用AutoDock-Vina软件将主要有效成分与核心靶点进行分子对接验证，探索最佳结合靶点。建立Ⅱ型胶原+佐剂诱导型关节大鼠模型，用补骨脂-淫羊藿干预21 d后，观察其对相关通路靶点及炎性细胞因子的影响。

结果与结论：①筛选补骨脂与淫羊藿活性成分28个，与类风湿关节炎交集靶点共288个，主要成分有异补骨脂素、补骨脂定、淫羊藿苷等；交集靶点主要有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子A等；②基因本体论分析获得生物过程2 232条，主要与丝氨酸蛋白磷酸化、AKT正调控、活性氧代谢过程等功能有关；③京都基因与基因组百科全书富集分析结果202条，主要有PI3K/AKT信号通路和表皮生长因子受体信号通路等，可能通过调节滑膜细胞凋亡与增殖、抑制炎性因子等发挥治疗作用；④分子对接结果表明补骨脂-淫羊藿主要与AKT1及雌激素受体转录因子1结合活性最强，并形成稳定结构，与PI3K/AKT等凋亡增殖、炎性介导等调控信号通路密切相关；⑤补骨脂-淫羊藿可降低胶原诱导型关节炎大鼠模型血清中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α的表达；⑥补骨脂-淫羊藿可调低胶原诱导型关节炎大鼠模型关节滑膜中p-PI3K、p-AKT、p-FOXO1蛋白的表达；⑦结果证明，补骨脂-淫羊藿可能经PI3K/AKT/FOXO1信号通路抑制关节滑膜细胞增殖和抑制炎性因子表达等发挥治疗作用，这可能与类风湿关节炎关节炎症和骨破坏的发生密切相关，同时为临床的合理使用及新药开发提供了参考依据。

https://orcid.org/0009-0009-3381-1049(冉磊)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 网络药理学, 分子对接, 补骨脂, 淫羊藿, 类风湿关节炎, 凋亡, 增殖, 体内实验, 胶原诱导型关节炎, 动物模型

Abstract: BACKGROUND: In clinical practice, Cibotium barometz and Epimedium have shown significant efficacy in the treatment of rheumatoid arthritis, but the complex active ingredients contained in the two have an unclear mechanism of action at the molecular level for the treatment of rheumatoid arthritis.
OBJECTIVE: Based on network pharmacology and molecular docking technology, to establish a collagen-induced arthritis model and to verify the potential targets and pathways of Cibotium barometz and Epimedium in the treatment of rheumatoid arthritis, providing reliable experimental evidence for the use of clinical formulas with Cibotium barometz and Epimedium as the main components.
METHODS: Utilizing traditional Chinese medicine research platforms, traditional Chinese medicine encyclopedias, and databases of traditional Chinese medicine and chemical components from the Shanghai Institute of Organic, effective ingredients were retrieved and identified. 3D molecular formulas were obtained from the PubChem platform and target predictions were made using PharmMapper and SwissTargetPrediction. Disease targets for rheumatoid arthritis were obtained from gene databases such as DrugBank, GeneCards, and OMIM. The intersections of targets and Cibotium barometz and Epimedium were plotted using VENNY 2.1 after calibration with the Uniport database. A protein-protein interaction network graph was constructed using the STRING platform. Gene Ontology function analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis were performed using the Metascape platform for data visualization. A four-layered network model of traditional Chinese medicine, ingredients, targets, diseases, and pathways was constructed using Cytoscape 3.9.0. The main effective ingredients were docked with core targets using AutoDock-Vina software to explore the best binding targets. A type II collagen+adjuvant-induced arthritis rat model was established, and the effects of Cibotium barometz and Epimedium on relevant pathway targets and inflammatory cell factors were observed after 21 days of intervention.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 28 active ingredients from Cibotium barometz and Epimedium were selected, yielding 288 intersection targets for rheumatoid arthritis. The main ingredients included isobavachalcone, cibotium, and epimedium. The main targets included protein kinase 1 for serine/threonine (AKT1), tumor necrosis factor, and vascular endothelial growth factor A. Gene ontology analysis yielded 2 232 biological processes, mainly related to serine protein phosphorylation, positive regulation of serine/threonine protein kinase, and reactive oxygen metabolism. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis yielded 202 pathways, mainly involving the PI3K/AKT signaling pathway and epidermal growth factor receptor signaling pathway, which may exert therapeutic effects by regulating synovial cell apoptosis and proliferation and suppressing inflammatory factors. Molecular docking results showed the strongest binding activity and stable structure of Cibotium barometz and Epimedium with AKT1 and estrogen receptor transcription factor 1, which was closely related to apoptosis and proliferation and inflammatory signaling pathways such as PI3K/AKT. Cibotium barometz and Epimedium reduced the expression of interleukin-1β, interleukin-6, and tumor necrosis factor-α in the serum of collagen-induced arthritis rat models. Cibotium barometz and Epimedium reduced the expression of p-PI3K, p-AKT, and p-FOXO1 in the synovium of collagen-induced arthritis rat models. The results indicate that the combination of Cibotium barometz and Epimedium may exert therapeutic effects by inhibiting the proliferation of synovial cells and suppressing the expression of inflammatory factors via the PI3K/AKT/FOXO1 signaling pathway. This may be closely related to the occurrence of inflammation and bone destruction in rheumatoid arthritis, and provides a reference for the rational use and development of new drugs in clinical practice.

Key words: network pharmacology, molecular docking, Cibotium barometz, Epimedium, rheumatoid arthritis, apoptosis, proliferation, in vivo experiment, collagen-induced arthritis, animal model

中图分类号:

冉磊, 韩海慧, 徐博, 王建业, 沈军, 肖涟波, 施杞. 补骨脂-淫羊藿对类风湿关节炎抗炎机制的分子对接分析：动物实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 208-215.

Ran Lei, Han Haihui, Xu Bo, Wang Jianye, Shen Jun, Xiao Lianbo, Shi Qi. Molecular docking analysis of the anti-inflammatory mechanism of Cibotium barometz and Epimedium for rheumatoid arthritis: animal experiment validation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(2): 208-215.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析 32只SD大鼠按SPSS随机数法分为空白组、模型组、BH-1X组、BH-3X组。CIA模型相对稳定，实验期间无动物死亡，最终分析纳入分析32只。
2.2 补骨脂-淫羊藿药物成分和靶点筛选通过检索1.4.1中所述数据库以及最新文献筛选有效成分补骨脂(BGZ)12个、淫羊藿(YYH)16个，主要以香豆素类、黄酮类、单萜酚类化合物为主，结果见表1。采用 PubChem搜索分子结构图后，利用Swiss Target Prediction进行靶点预测，剔除重复靶点后共获靶点423个。

2.3 药物-疾病交集靶点和韦恩图通过DrugBank、GeneCards、OMIM数据库检索到RA相关靶点4 964个，将药物与疾病所获得靶点于Uniprot进行标准化后，利用Venny 2.1可获得补骨脂、淫羊藿与RA交集靶点288个，并绘制韦恩图；将交集靶点导入Cytoscape 3.9.0，绘制补骨脂、淫羊藿主要成分-核心靶点图，并按照Degree值大小进行排序；结果见图1，排名前6位靶点分别为AKT1、肿瘤坏死因子α、血管内皮生长因子A、原癌基因酪氨酸受体激酶、表皮生长因子受体。

2.4 蛋白相互作用网络构建将所获得交集靶点输入String数据库(https://string-db.org/)，选择多靶点交互及Homo Sapiens，选择高置信度(0.700)，最大两级交互数均设置为3，结果见图2。

2.5 基因本体论与 KEGG富集分析将2.3收集的交集靶点信息导入Metascape平台，以“H.Sapiens”提交，进行基因本体论和KEGG富集分析，获得生物过程2 232条，主要与丝氨酸蛋白磷酸化与修饰、丝氨酸/苏氨酸激酶正调控、活性氧代谢过程、MAP激酶活性正调节、脂多糖应答及类固醇的代谢过程等功能有关；细胞组成137条，主要与突触膜的成分和质膜形成等相关；分子功能获得273条，主要与丝氨酸激酶活性、丝氨酸/苏氨酸激酶活性、配体转录因子活性剂氧化还原酶活性相关，见图3。通过KEGG 通路富集分析获得202条相关信号通路，以P < 0.01、最小计数为3且富集因子> 1.5筛选，主要与前列腺癌、PI3K-AKT信号通路、表皮生长因子受体信号通路等有关。

2.6 中药-成分-靶点-疾病-通路四重网络模型构建依据富集分析结果，结合Cytoscape 3.9.0绘制补骨脂、淫羊藿主要成分-主要靶点-RA-通路，构建四重网络模型(中药2个，主要活性成分补骨脂12个、淫羊藿16个，排名前10通路，主要靶点288个，疾病1个)，结果见图4。

2.7 核心靶点分子对接依据2.5网络交集靶点的Degree值筛选前3核心成分Bavachin(补骨脂甲素)、Kaempferol(山柰酚)、Quercetin(槲皮素)以及2个核心靶点蛋白(AKT1、雌激素受体1)。对主要活性分及核心靶点蛋白进行分子对接，与AKT1结合能最高的靶点为补骨脂甲素，为-8.6 kJ/mol；与雌激素受体1结合能最高的靶点为山奈酚，为-8 kJ/mol。其中活性成分信息与蛋白之间结合能等信息见表2，详细对接过程、主要活性成分3D分子式及对应分子质谱分析图谱，见图5。

2.8 补骨脂-淫羊藿对CIA大鼠血清中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α的影响造模前后大鼠踝关节对比见图6A，B。
白细胞介素1β：与空白组比较，其余3组较其表达均明显增加(P < 0.001)；与模型组比较，BH-1X组表达降低(P < 0.01)，BH-3X组表达降低(P < 0.001)，见图6C。
白细胞介素6：与空白组比较，其余3组较其表达均明显增加(P < 0.001)；与模型组比较，BH-1X组表达降低(P < 0.001)，BH-3X组表达降低(P < 0.001)，见图6D。
肿瘤坏死因子α：与空白组比较，其余3组较其表达均明显增加(P < 0.001)；与模型组比较，BH-1X组表达降低(P < 0.001)，BH-3X组表达降低(P < 0.001)，见图6E。

2.9 补骨脂-淫羊藿对胶原诱导型关节炎大鼠滑膜中p-PI3K、p-AKT、p-FOXO1蛋白表达的影响见图7。与空白组比较，其余3组p-PI3K表达均明显增加(P < 0.001)；与模型组比较，BH-1X组表达无差异(P > 0.05)，BH-3X组表达降低(P < 0.001)，见图7A。
与空白组比较，模型组p-AKT表达明显增加(P < 0.001)，BH-1X组、BH-3X组表达均增加(P < 0.05)；与模型组比较，BH-1X组、BH-3X组表达均明显降低(P < 0.001)，见图7B。
与空白组比较，模型组p-FOXO1表达明显增加(P < 0.001)，BH-1X组、BH-3X组表达均增加(P < 0.05)；与模型组比较，BH-1X组、BH-3X组表达均明显降低(P < 0.001)，见图7C。

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引言

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种主要影响关节的自身免疫性疾病，在国内发病率约0.42%[1]。RA随着病情进展逐渐加重，在缺乏良好控制的情况下，症状会逐渐恶化，直到关节受到不可逆转的损害，疾病后期可引起全身多脏器的并发症[2]。研究表明，RA并发症可减少患者的预期寿命[3]，因此，RA的未病先防、既病有效的长期阶梯化治疗对其预后具有重要意义。目前RA的临床治疗主要以抗风湿病药物、糖皮质激素及生物制剂为主，如甲氨蝶呤、羟氯喹、甲泼尼龙、肿瘤坏死因子α抑制剂、白细胞介素抑制剂等[4-5]，但常伴有白细胞降低、肝肾损害等不良反应[6-7]。生物制剂疗效明显，但生物制剂靶点单一，且价格较高，限制了其适用范围[8-9]。
RA在中医属“痹症”范畴，又称“尫痹”，主要病机为因人体正气不足，卫外不固，感受风、寒、湿、热等外邪，致使经络痹阻，气血运行不畅，引起肌肉、筋骨、关节发生疼痛、重着、屈伸不利，甚至畸形[10]。国医大师施杞教授与肖涟波主任医师认为该病为六淫外邪与五邪内伤相互作用，久病致体质虚赢，论治大法则以补肝益肾为主，化湿疏风、强筋健骨为辅，常用补骨脂、淫羊藿等药物治疗相关疾病。已有多项研究发现补骨脂、淫羊藿在骨病中的有效作用[11-12]。研究表明补骨脂素可以降低大鼠的关节炎症，减轻RA的关节损伤[13]；部分学者已发现淫羊藿苷可通过miR-223-3p/NLRP3小体信号通路和磷脂酰肌醇激酶3(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinases，AKT)信号通路，减缓RA关节炎症，并发现淫羊藿苷的介入可调节核转录因子κB受体活化因子配体和骨保护素的平衡，改善RA骨破坏[14-16]。现代药理说明补骨脂、淫羊藿具有抗炎症、抗氧化、促进成骨等作用[17-18]，但对RA的治疗机制仍不清楚。作者所在课题组从2012年开始进行了临床及基础研究，虽已有部分发现，但具体作用机制仍在探索。国医大师施杞教授治疗RA的临床经验方蠲痹强骨方(补骨脂、淫羊藿、骨碎补、当归、青风藤)疗效确切[19]，其中补骨脂为君药，淫羊藿为臣药，两者相需为用，可能在RA治疗中发挥主要作用。
网络药理学与分子对接技术属于新兴学科，对于中药多靶点、多通路具有聚焦主要通路及靶点作用，提高了研究效率，但仍需准确的实验验证数据来支撑预测结果的正确性与可靠性。此次研究从网络药理学和分子对接技术出发，基于大数据平台数据筛选与分析，设计了胶原诱导型关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，验证其潜在的抗炎机制，为临床使用提供了可靠的依据并为进一步的基础研究指明方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计基于网络药理学及分子对接分析补骨脂-淫羊藿对类风湿关节炎的抗炎机制，采用动物实验进行体内实验验证。统计分析资料按照数据分类的不同，分别使用适合的统计学检验方法，主要结果以中药组与模型组比较为主。
1.2 时间及地点实验于2022年8-11月在上海中医药大学动物实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物采用SPF级雌性SD大鼠32只，体质量180-200 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证编号：SCXK(沪)2008-0016。实验过程通过上海中医药大学伦理委员会审查，伦理编号：PZSHUTCM220926005。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。构建Ⅱ型胶原+完全弗氏佐剂/不完全弗氏佐剂诱导的CIA大鼠模型，于温度20-24 ℃、湿度40%-70%环境饲养，适应性饲养7 d，自由饮水及进食。
1.3.2 实验主要设备及试剂异氟烷(瑞沃德，R510-22)；白细胞介素1β ELISA Kit(上海威奥，ER9074M)；白细胞介素6 ELISA Kit(上海威奥，ER9078M)；肿瘤坏死因子α ELISA Kit(上海威奥，ER9113M)；PBS(上海威奥，WH1166)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海威奥，WH0124)；p-PI3K P85α/β/P55γ抗体(Beyotime，AF5905)；p-AKT抗体(Beyotime，AF5734)；p-FOXO1抗体(Beyotime，AF5824)；β-actin(Beyotime，AF5003)；细胞超声破碎仪(宁波新艺超，JY88-II)；组织匀浆器(北京鼎昊源，TL-2010S)；台式高速冷冻离心机(ThermoFisher，Fresco21)；全波长酶标仪(ThermoFisher，MutiskanTM GO)；电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂，PYX-DHS)等。
1.4 实验方法
1.4.1 补骨脂-淫羊藿药物成分筛选和靶点预测以补骨脂和淫羊藿分别为关键词在中医药研究平台(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、中医百科全书(http://www.tcmip.cn/ETCM/)、上海有机所中药与化学成分数据库(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/main/tcm_introduce.asp)和文献研究中检索。中医药研究平台以口服生物利用度≥ 30%，药物相似性≥ 0.18筛选，中医百科全书和上海有机所的中药与化学成分数据库所收集蛋白与最新文献相匹配后进行活性成分筛选。通过PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)检索成分2D分子结构式并于PharmMapper和SwissTargetPrediction平台进行靶标预测。
1.4.2 RA疾病靶点获取以Rheumatoid arthritis为关键词于DrugBank(https://go.drugbank.com)、GeneCards(https://www.genecards.org)、OMIM(https://www.omim.org)等数据库完成RA疾病靶点获取，利用Excel软件去除重复靶点。
1.4.3 蛋白名称标准化和药物-疾病交集靶点获取采用Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/uniprot)对获取蛋白名称通过“reviewed”和“Homo sapiens”选项进行标准化，得到补骨脂-淫羊藿活性成分的作用靶点，并筛选药物-疾病的交集靶点。
1.4.4 RA与补骨脂-淫羊藿活性成分共同靶点的蛋白相互作用通过VENNY 2.1平台获取补骨脂-淫羊藿与RA交集靶点绘制韦恩图，并将靶点信息导入STRING数据库(https://string-db.org/)，以“Homo Sapiens”为条件并去除游离基因，构建蛋白相互作用网络。
1.4.5 基因本体论、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析和中药-成分-靶点-疾病=通路网络模型构建将药物-疾病交集靶点信息导入Metascape平台，以“H.Sapiens”提交，进行Gene Enrichment，根据基因本体论功能分析及KEGG通路分析结果筛选有效信息，通过Pathon进行可视化，P < 0.01具有生物学意义。利用Cytoscape 3.9.0构建中药-成分-靶点-疾病四重网络模型。
1.4.6 分子对接分析通过Cytoscape 3.9.0将中药-成分-疾病-靶点-通路网络中的核心靶点以Degree值排序，选择补骨脂与淫羊藿排名前3的分子和核心靶点，通过Pubchem数据库下载分子的3D结构式，并转换为mol2文件备用。采用AutoDock软件将筛选的靶点蛋白与小分子配体进行分析，并计算结合能(AutoDock-Vina)，Py MOL进行数据可视化。
1.4.7 动物实验验证设计
(1)实验动物分组：SPF级雌性SD大鼠32只按SPSS随机数法分为4组：空白组、模型组、补骨脂-淫羊藿临床等效剂量1倍组(BH-1X)、补骨脂-淫羊藿临床等效剂量3倍组(BH-3X)。临床等效剂量1倍剂量为补骨脂15 g，淫羊藿10 g，计算药量为：25 mg/(60 kg·d)×6.8×1=2.83 mg/(kg·d)，人等效3倍为3×2.83 mg/(kg·d)=8.5 mg/(kg·d)。将两者混合煎煮，过滤药渣，制成含生药浸膏(2 g/L)，配置不同浓度灌胃药液。

(2)造模与实验方案：除空白组外，其余3组均造模。将大鼠在异氟烷(Isoflurane，型号：R510-22)0.5 mL/只吸入麻醉下，尾部脱毛。初次免疫(Day0)采用Ⅱ型胶原0.5 mL+完全弗氏佐剂0.5 mL，在冰上均匀混合充分乳化后，待乳液滴入水中凝聚成团，30 s不散。按0.5 mL/kg于大鼠尾部旁0.5 cm处皮内注射直径约1 cm的皮丘。7 d后进行二次加强免疫(Day7)，Ⅱ型胶原0.5 mL+不完全弗氏佐剂0.5 mL 1∶1混合乳化，按0.25 mL/kg操作同前。BH-1X组和BH-3X组中药灌胃2 mL，1次/d，连续3周；空白组、模型组正常饮食，生理盐水2 mL/只灌胃，连续3周。灌胃后3周在麻醉下取腹主动脉血清、关节滑膜等标本后处死大鼠。

(3)ELISA检测动物血清细胞因子水平：采用全波长酶标仪(MutiskanTM GO，ThermoFisher)，Elisa试剂盒(货号ER9078M，ER9072M，ER9074M，ER9113M；上海威奥公司)；冷冻离心机(Fresco21，ThermoFisher)等。将收集的血液离心20 min(3 000 r/min)，放至-20 ℃冷冻保存。检测之前将血液解冻，用超纯水稀释后备用，操作按试剂盒说明书进行操作，分次加入样本及标准品，生物素化，加SABC复合物、TMB显色液、终止液后读数。
(4)蛋白质免疫印迹(Western Blot)：采用各组间大鼠踝关节滑膜剪碎，20 mg组织加入100 μL裂解液(上海威奥，WB0101)的比例加入裂解液，冰上充分裂解后，12 000 r/min离心5 min，收集其上清液置于EP管中，离心30 min，稀释原液浓度，置入96孔板。清洗玻璃板后进行配胶，配制15%/12%/10%/8%分离胶10 mL，加TEMED 10 μL、10%过硫酸铵100 μL，混匀后立即灌胶，灌至齿梳下缘2.0-3.0 mm，用异丙醇封闭液面以去除气泡并隔绝空气，室温静置45 min待胶完全聚合。待胶完全聚合后拔出梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，用电泳缓冲液冲洗上样孔以去除气泡。每孔加上样液150 μg，留一孔加10 μL预染的Marker。加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用70 V恒压电泳，约30 min，当指示剂溴芬蓝进入分离胶后改用90 V恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5 cm处时关闭电源，取出胶板。转模(200 mA，2 h)，加入5%封闭液，摇床封闭2 h，回收封闭液，4 ℃摇床过夜，加入一抗稀释液加入p-PI3K(正能，1∶1 000兔来源)、p-AKT(正能，1∶1 000兔来源)、p-FOXO1(正能，1∶1 000兔来源)和β-actin(上海威奥，1∶2 000小鼠来源)、TBST洗膜5 min×3次，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(Jackson，1∶2 000)；辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗(Jackson，1∶2 000)，室温孵育2 h。TBST洗膜15 min×5次。膜于化学发光检测试剂(试剂A∶试剂B=1∶1)反应2 min，取出膜，甩去多余的液体，上机显色。成像软件采用Image J进行分析条带。
1.5 主要观察指标 ①各组间炎性细胞因子(白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)的变化；②各组间磷酸化蛋白表达(p-PI3K、p-AKT、p-FOXO1)。
1.6 统计学分析使用IBM SPSS Statistics 26进行统计分析，GraphPad Prism 9.0进行图表绘制。统计数据符合正态分布的计量资料用x±s表示，多组间比较采用One-way ANOVA，方差不齐时用Welch’s校正；不符合正态分布，两组间采用U检验，多组间比较采用Kraskal wall’s test；等级资料采用秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经上海中医药大学医学生物统计学专家审核。

讨论

RA是一种慢性自身免疫性疾病，发病隐匿，RA的典型特征为小关节受累为主，如近端或远端指间关节、掌指关节肿痛，屈伸不利等。同时可损害关节外器官，包括心、肾、肺等脏器，以及眼睛、皮肤黏膜、消化道系统和神经系统[20]。一些研究表明，黏膜部位和失调的微生物群之间的相互作用可能促进RA的炎症发展，最早可能从黏膜部位开始，但影响具体黏膜-关节过程尚不明确[21]。近年来中医介入治疗临床上RA取得显著疗效[22-23]，研究表明中药在抗炎、调节免疫等方面具有良好效果，如补骨脂、淫羊藿等[24-25]。作者所在课题组前期探索了国医大师施杞教授临床经验方蠲痹强骨方(补骨脂为君药，淫羊藿为臣药)在改善CIA小鼠和RA患者关节炎症的机制[26]，发现其中有效成分柚皮苷、骨碎补总黄酮等可明显降低CIA小鼠血清白细胞介素6、肿瘤坏死因子α及趋化因子4等炎症因子，减轻RA患者关节肿痛，减缓骨破坏的发生[27-28]。因此借助网络药理学及分子对接技术，作者拟探索补骨脂-淫羊藿治疗RA新的靶点。
结果表明补骨脂-淫羊藿与RA主要靶点集中在AKT1、肿瘤坏死因子α、血管内皮生长因子A、原癌基因酪氨酸受体激酶，其中表皮生长因子受体、AKT1、血管内皮生长因子A与RA关节滑膜血管翳增生物有密切联系。研究表明与AKT相关通路的异常激活可促进滑膜细胞的异常增殖，已证实RA患者的滑膜细胞可显示出癌样表型，其特征是滑膜组织不受控制的过度增殖和对细胞凋亡的敏感性降低[29-30]，普遍认为成纤维细胞的过度增殖和细胞凋亡不足是RA的病理基础[31]。白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α是RA患者关节炎症的主要致炎因子之一，血液、关节炎及关节滑膜中常可检测到异常增高[32]。已有研究发现肿瘤坏死因子α的异常表达可促进破骨细胞及其前体细胞的异常激活，引起骨代谢失常，从而导致骨破坏的发生[33-34]。另外，原癌基因酪氨酸受体激酶和表皮生长因子受体常在肿瘤患者中异常表达，表现出类似RA患者滑膜增生的表型[35]。如FOXO1受AKT的直接调控，已有研究表明其可明显改善M1型巨噬细胞与M2型巨噬细胞的比例，减缓RA关节炎症[36]。
通过基因本体论分析得到补骨脂、淫羊藿影响的生物过程有丝氨酸蛋白磷酸化与修饰、AKT活性正调控、活性氧代谢过程等。通过KEGG通路富集分析得到补骨脂、淫羊藿可能主要在前列腺癌、PI3K-AKT信号通路、表皮生长因子受体信号通路等。近年研究发现肿瘤相关通路与细胞的异常增殖与凋亡直接相关，RA滑膜细胞类似于肿瘤细胞的异常增殖[37]。
据报道，RA患者关节滑膜中的成纤维细胞由于抗凋亡分子和促凋亡分子不平衡而对凋亡具有抵抗力，如肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体、p53上调凋亡基因PUMA和Bid在RA患者的成纤维细胞中下调[38]。PI3K/AKT信号通路介导细胞增殖、细胞周期和糖代谢的调节，在细胞生长、存活、分化以及炎症介导中发挥重要作用，已有证据表明调节PI3K/AKT通路也是中医药治疗RA的重要途径。一项体内实验表明，在薯蓣总皂苷(100 μg/L)的干预下，成纤维细胞中的PI3K和AKT蛋白下调，表明PI3K/AKT通路促进了大鼠成纤维细胞凋亡因子的活性[39]。另有研究发现断藤益母汤的干预显著抑制了PI3K和AKT的活化[40]。此外，双乌玄痹颗粒含药血清对RA-成纤维细胞也有类似的促凋亡作用，其机制与PI3K/Akt信号通路异常有关[41]。黑骨藤追风活络胶囊(0.315 g/kg)可下调缺氧诱导因子α、p-PI3K、p-AKT和Bcl-2，而上调CIA大鼠滑膜组织中的Bax，调节PI3K/AKT通路可能抑制CIA大鼠的炎症反应[42]。此研究分析结果给体内实验提供了参考，发现AKT1与前期课题组研究基础FGFR1/PI3K/AKT通路密切相关，故作者采用了CIA大鼠模型，验证补骨脂-淫羊藿对PI3K/AKT/FOXOs通路的影响，结果表明其可明显下调p-PI3K、p-AKT、p-FOXO1；可明显降低CIA大鼠模型血清中的炎症因子水平(白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)，进一步说明了其可能在细胞增殖与凋亡、炎症介导中发挥治疗作用，从而减缓关节滑膜肿胀与疾病进展。在3倍中药的干预下，作者发现较1倍剂量组对PI3K/AKT/FOXO1通路的影响更明显，白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α表达水平明显下降。因此，补骨脂-淫羊藿的治疗作用可能与调节PI3K/AKT通路及肿瘤坏死因子α等炎症因子发挥作用密切相关。
已有研究表明补骨脂具有肝毒性和生殖毒性[43-44]，虽然3倍中药用量已超临床常用剂量和中华药典规范计量[45-46]，但大鼠并未出现眼眶出血、肝脾肿大等明显不良反应，仍需进一步的毒理实验来进行验证。分子对接分析后发现主要核心成分与交集靶点的结合能均≤-5 kJ/mol，说明成分与靶点的结合较为紧密，主要结合成分为补骨脂甲素、山柰酚、槲皮素，其中山柰酚、槲皮素为淫羊藿等药物中常有的活性成分，但含有相同成分的中药疗效迥异，故共有成分在不同的药物和主要结合分子之中可能发挥不同的作用。因此，补骨脂与淫羊藿治疗效应是协同作用。但此次研究尚有一定局限：因技术原因，现有数据库未能涵盖所有药物新的分子及疾病新的靶点，对预测结果可能造成一定偏倚；此外，体外药物主要有效成分与入血成分的一致性仍需进行动物模型实验深入研究；未来将从补骨脂、淫羊藿主要入血成分与现有数据库对比研究、毒理研究与主要单体有效性研究3个方面进行下一步的探索。
综上所述，此次研究通过网络药理学、分子对接和动物实验阐明了补骨脂、淫羊藿可能通过PI3K/AKT及多种生物功能共同协作发挥作用治疗RA，为临床的合理使用及新药开发提供了参考依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

补骨脂-淫羊藿对类风湿关节炎抗炎机制的分子对接分析：动物实验验证

Molecular docking analysis of the anti-inflammatory mechanism of Cibotium barometz and Epimedium for rheumatoid arthritis: animal experiment validation

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