葛根汤治疗骨关节炎的网络药理学分析及动物实验验证

doi:10.12307/2023.996

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (2): 193-199.doi: 10.12307/2023.996

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葛根汤治疗骨关节炎的网络药理学分析及动物实验验证

刘宝方1，徐斌1，陈雷2

1安徽医科大学第一附属医院骨科，安徽省合肥市 230001；2皖南医学院第一附属医院烧伤整形科，安徽省芜湖市 241000

收稿日期:2022-11-22 接受日期:2023-02-24 出版日期:2024-01-18 发布日期:2023-06-29
通讯作者: 徐斌，硕士，主任医师，博士生导师，安徽医科大学第一附属医院骨科，安徽省合肥市 230001
作者简介:刘宝方，男，1988年生，江苏省邳州市人，安徽医科大学在读硕士。
基金资助:
安徽省自然科学基金项目(1808085MH243)，项目负责人：徐斌；芜湖市科技计划项目(2021jc2-4)，项目负责人：陈雷

Pueraria decoction in the treatment of osteoarthritis: network pharmacology analysis and animal model validation

Liu Baofang1, Xu Bin1, Chen Lei2

1Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230001, Anhui Province, China; 2Department of Burns and Plastic Surgery, the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241000, Anhui Province, China

Received:2022-11-22 Accepted:2023-02-24 Online:2024-01-18 Published:2023-06-29
Contact: Xu Bin, Master, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230001, Anhui Province, China
About author:Liu Baofang, Master candidate, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230001, Anhui Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Anhui Province, No. 1808085MH243 (to XB); Science and Technology Plan of Wuhu City, No. 2021jc2-4 (to CL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

网络药理学：是基于药物的主成分，通过系统生物学理论构建疾病生物靶点和药物成分之间的网络联系，从而获得药物治疗疾病的有效成分。通过分析药物的药效成分，不仅可以提高药物的治疗效果，而且可以降低药物的毒性等，在科研的道路上可以提高新药实验的成功率，节省科研成本。

蛋白质互作网络：在前人的研究基础上，通过分析已知蛋白与预测蛋白之间的生物信号传递、基因表达调节、能量和物质代谢及细胞周期调控等相互作用的功能关系，绘制分析网络，现阶段蛋白互作网络研究可借助STRING数据库完成。

背景：葛根汤是中医著名方剂，具有抗炎止痛的良好疗效，通过网络药理学分析葛根汤在骨关节炎中的作用机制，从而获得葛根汤的主要疗效成分。
目的：通过网络药理学和动物实验验证葛根汤治疗骨关节炎的作用机制。
方法：首先，通过中草药分析平台(TCMSP)筛选葛根汤的活性成分，并在GeneCards数据库收集骨关节炎的相关基因；其次，利用Cytoscape软件构建“活性成分-作用靶点-疾病”网络图，探索核心靶基因及分析基因表达差异，随后通过小鼠骨关节炎模型进行葛根汤主成分之一木犀草素疗效的实验验证；最后，对靶标基因进行京都基因百科全书(KEGG)和基因本体(GO)富集分析进一步探索相关机制。

结果与结论：筛选出115种活性成分和147个相对应的靶标基因，KEGG和GO分析发现葛根汤可通过多种反应机制和代谢通路影响骨关节炎，筛选出6个核心表达差异基因和作用于这些基因的化合物，其中葛根汤的主要成分木犀草素在动物实验中可以较好地促进软骨修复，促进胶原蛋白Ⅱ的表达，抑制基质金属蛋白酶1、环氧合酶2的表达。结果表明，葛根汤中含多种活性成分通过氧化应激等作用机制和代谢通路阻止骨关节炎的进展。

https://orcid.org/0000-0001-5408-1676(刘宝方)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 葛根汤, 骨关节炎, 差异表达基因, 网络药理学, 信号通路, 炎症反应, 靶点预测, 木犀草素

Abstract: BACKGROUND: Pueraria decoction is a famous prescription of traditional Chinese medicine, which has good anti-inflammatory and analgesic effects. The mechanism of Pueraria decoction in osteoarthritis was analyzed using network pharmacology to obtain the main therapeutic components of Pueraria decoction.
OBJECTIVE: To analyze the mechanism of Pueraria decoction in the treatment of osteoarthritis through network pharmacology and animal experiments.
METHODS: First, the active ingredients of Pueraria decoction were screened through the Chinese Herbal Medicine Analysis platform (TCMSP) and the genes related to osteoarthritis were collected in the GeneCards database. Second, Cytoscape software was used to construct the “active ingredient-target-disease” network diagram, explore hub genes and analyze gene expression differences. Subsequently, the therapeutic effect of luteolin, one of the main components of Pueraria decoction, was verified in a mouse model of osteoarthritis. Finally, the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) and the gene ontology (GO) enrichment analyses of the target genes were conducted to further explore the relevant mechanisms.
RESULTS AND CONCLUSION: 115 active ingredients and 147 target genes related to osteoarthritis were identified. GO and KEGG analyses found that Pueraria decoction could affect osteoarthritis through a variety of reaction mechanisms and metabolic pathways. Six hub genes and compounds acting on these genes were determined. Luteolin, the main component of Pueraria decoction, could better promote cartilage repair, accelerate the decrease of typy II collagen and inhibit the expression of matrix metalloproteinase 1 and cyclooxygenase 2 in animal experiments. To conclude, Pueraria decoction contains various active ingredients to prevent the progression of osteoarthritis through oxidative stress and metabolic pathways.

Key words: Pueraria decoction, osteoarthritis, differentially expressed gene, network pharmacology, signaling pathway, inflammatory response, target prediction, luteolin

中图分类号:

刘宝方, 徐斌, 陈雷. 葛根汤治疗骨关节炎的网络药理学分析及动物实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 193-199.

Liu Baofang, Xu Bin, Chen Lei. Pueraria decoction in the treatment of osteoarthritis: network pharmacology analysis and animal model validation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(2): 193-199.

图/表（结果） 9

2.1 葛根汤有效成分和骨关节炎相关基因的筛选根据设置值域口服生物利用度≥30%，药物相似性≥0.18，总共筛选出111种主要成分，主要作用于230个靶标基因，此外在GeneCards数据库中查询到2 287个与骨关节炎相关的基因，获取葛根汤和骨关节炎共同相关基因147个，见图1。

2.2 药物的有效成分和疾病相关的网络图根据药物治疗基因靶点和疾病相关基因的联系，构建了网络图，通过Cytoscape软件可视化，见图2，可得葛根汤的有效化合物有111个，化合物作用靶点基因最多的依次为PTGS2、ESR1、SP90AB、ESR2、NOS2、PTGS1、GSK3B、PPARG等基因，有不同的化合物作用于这些基因，其中大部分来自于甘草，说明葛根汤的多种成分作用于不同的靶点基因，协调不同的蛋白相互作用，从而起到抗炎的作用。

2.3 蛋白互作网络和核心基因的鉴定通过将靶点基因上传至STRING数据库，可获得靶点基因对应的蛋白互作网络，并将此网络导入Cytoscape软件可视化，根据Cytoscape插件CytoNCA分别计算网络节点的拓扑参数：中间度中心性、贴近中心性、学位中心性、特征向量中心性、基于局部平均连通性的方法、网络中心性，先后根据各个参数数值的中位数运算筛选核心基因2次，运算值域分别为大于6个运算值参数的中位数。最终获得14个核心基因，分别为MAPK1、MAPK14、AKT1、STAT3、FOS、JUN、CDKN1A、ESR1、MAPK3、CCND1、TP53、MYC、RELA、HIF1A，见图3。

2.4 核心基因的表达差异和有效化合物的筛选通过分析在线数据库(GEO)中骨关节炎的相关基因表达数据集GSE114007[21]，发现14个核心基因中有6个基因表达存在差异，分别为CCND1、CDKN1A、FOS、JUN、MYC、RELA，见图4，其中CCND1在骨关节炎中高表达，CDKN1A、FOS、JUN、MYC、RELA在骨关节炎中低表达，根据化合物作用于6个差异基因的多少排序分别为：槲皮素、木犀草素、甘草查尔酮、山柰酚、二氢槲皮素、芒柄花黄素、β-谷固醇、异鼠李素、柚皮素，见表1。

2.5 动物实验验证在多项研究中已经充分证明槲皮素有治疗骨关节炎的效果，此次实验选取了对差异表达核心基因作用较多的化合物木犀草素作为实验研究对象。通过动物实验验证木犀草素治疗骨关节炎的作用，番红固绿染色显示，对照组软骨表面完整光滑，软骨胶原和软骨结构完整；骨关节炎组软骨表面粗糙，结构破坏严重，软骨胶原丢失较多，软骨基质染色减少；与骨关节炎组比较，治疗组软骨表面相对平整，结构破坏相对减轻，软骨胶原丢失较少，软骨基质染色相对较好，见图5。通过骨关节炎小鼠模型免疫组化实验评价木犀草素在骨关节炎中的抗炎作用，结果显示：与骨关节炎组相比，治疗组的基质金属蛋白酶1和环氧合酶2表达明显减少，胶原蛋白Ⅱ明显增加。总的来说，这些实验表明木犀草素在动物体内具有保护作用，见图6。

2.6 靶基因的功能分析此次实验根据R语言“ClusterProfiler包”分析靶基因在GO功能上的主要富集，生物过程包括对氧化应激的反应、金属离子的响应、细胞对化学压力的反应、对脂多糖的反应、对活性氧的反应、细胞对氧化应激的反应；细胞成分包括膜筏、膜微域、转录调节复合体、胞质小泡腔等；分子功能包括DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、转录因子的调节、氨基酸的代谢等功能上，见图7A。KEGG功能富集主要有：糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、白细胞介素17信号通路、肿瘤坏死因子α信号通路、PI3K/Akt信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路等，见图7B，其中葛根汤治疗骨关节炎的36个靶基因主要富集在PI3K/Akt信号通路上，6个差异核心基因中有3个富集在此通路上，见图8。

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引言

骨关节炎是全球最常见的疼痛性致残性疾病之一，影响约2.5亿人[1]，常见于老年人群，超过65周岁人群的发病率高达50%[2]。随着人口老龄化和预期寿命的增加，骨关节炎已越来越成为医患乃至社会关注的话题。关节疼痛是骨关节炎患者最显著的症状特征，常常作为患者寻求医疗帮助的首要原因[3-4]，另外，长期慢性疼痛对患者的心理、精神、睡眠和社会活动也产生负面影响[5-6]，严重影响患者的生活质量，给个人、家庭乃至整个社会带来巨大的经济负担[7-8]。
目前研究认为骨关节炎的发病诱因与多种因素有关，包括代谢性疾病、肥胖、年龄、炎症、创伤、过量或者超负荷关节运动以及关节不稳等[9]。最近也有研究表明骨关节炎与性别、遗传或者关节的解剖结构相关[10]。无论哪种因素导致的骨关节炎，最终出现关节的韧带或者肌肉的病理改变、软骨损伤、骨质肥大、骨赘形成、滑膜增生或者硬化，严重者关节畸形甚至功能障碍，其中软骨病理变化在骨关节炎的进展中起到重要作用[11]。软骨是覆盖于关节表面的无血管和神经的白色组织[12]，其重要作用是分散关节的承受力和缓冲关节冲击力以及减少关节之间的摩擦[13]。软骨主要由软骨细胞和细胞外基质构成，细胞外基质占软骨成分的90%以上，其主要为蛋白多糖和胶原纤维，也是关节软骨分散应力的基础成分。软骨细胞是目前鉴定出存在于软骨中唯一的细胞类型。软骨的退变首先是软骨微环境发生改变，而软骨细胞在维持软骨细胞外蛋白基质合成和代谢平衡中起到重要的作用[14]。现阶段，骨关节炎的治疗手段多样，药物改善患者疼痛或者软骨损伤仍是最常见的治疗方法。非类固醇抗炎药和阿片类镇痛药是治疗骨关节炎疼痛最常见的处方药。不少研究报道了持续口服非类固醇抗炎药相关的一些安全性问题，包括肝毒性、肾毒性、高血压或其他心血管事件风险的增加以及对上消化道存在多种负面损害[15-16]。
中国有数千年用天然物治疗疾病的历史，以天然物治疗疾病，不仅可降低药物的不良反应，还可以取得良好的治疗效果。中国古医书《伤寒论》中记载一药方“葛根汤”，此方由“葛根、麻黄、桂枝、生姜、甘草、白芍、大枣”多种中药组成，具有祛湿散寒、活血舒筋、解痉止痛等多种疗效。近来研究发现葛根汤在多种神经性疼痛疾病中具有良好的效果，同时发现葛根汤在肩周炎、类风湿关节炎等多种炎症性疾病中也有一定的作用，周军等[17]实验发现葛根汤可以改善大鼠骨关节炎的症状。但葛根汤对骨关节炎的作用机制并不清楚。此次实验通过网络药理学分析了葛根汤治疗骨关节炎的主要成分和作用机制，并通过动物实验验证了葛根汤的有效成分对骨关节炎的治疗作用，为今后研究药物治疗骨关节炎提供新的策略。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计通过网络药理学分析葛根汤在骨关节炎中的治疗靶点，结合转录组学差异基因分析葛根汤治疗骨关节炎的主要化合物成分，并通过动物实验进行葛根汤主要化合物成分的验证。
1.2 时间及地点 2022年1-11月在安徽医科大学基础实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 生信数据库及分析工具 TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)；GeneCard数据库(https://www.genecards.org/)；STRING数据库；NCBI基因表达综合数据库GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；UniProt数据库(https://www.UniProt.org/UniProt/)。分析工具：R 4.1.2版本，perl软件，Cytoscape软件，WPSoffice软件，SPSS 25.0统计软件。
1.3.2 实验动物 8周龄C57BL/6小鼠12只，雄性，体质量18-22 g，由安徽医科大学动物实验室提供，许可证号：SYXK(皖)2017-006。
实验方案经安徽医科大学动物实验伦理委员会批准(LLSC20220204)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.3 实验试剂和仪器
主要实验试剂：无水乙醇、二甲苯、正丁醇(国药集团化学试剂有限公司)；戊巴比妥钠、环保型脱蜡透明液、柠檬酸(pH 6.0)抗原修复液、EDTA 抗原修复液(pH 9.0)、40 g/L
多聚甲醛、正常兔血清、苏木精染液、苏木精分化液、苏木精返蓝液、超净快干封片胶、DAB 显色剂、番红固绿(Servicebio公司)；基质金属蛋白酶1、胶原蛋白Ⅱ、环氧合酶2一抗(中国成都正能生物公司)；木犀草素(上海麦克林公司)。
主要实验仪器：显微镜(Nikon公司)；脱水机(DIAPATH公司)；包埋机(武汉俊杰电子有限公司)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；烤箱(上海慧泰仪器制造有限公司)；载玻片(Servicebio)；冰箱(海尔有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 葛根汤主要成分和药物靶点的筛选 TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)是中草药分析平台[18]，此平台提供了中草药的成分分析、药物和靶标之间的关系。将葛根汤的的成分“生姜、大枣、麻黄、桂枝、白芍、葛根、甘草”分别输入TCMSP平台筛选各个草药的化合物成分和药物靶标，根据前人研究设置口服生物利用度(OB)≥30%，药物相似性(DL)≥0.18[19-20]，利用UniProt数据库(https://www.UniProt.org/UniProt/)进行每个化合物靶点和基因的转换，此步骤用R软件完成。
1.4.2 骨关节炎相关基因的获取和药物靶基因的获取在GeneCard数据库(https://www.genecards.org/)搜索“骨关节炎”关键词，根据关键词搜索到的疾病相关基因与葛根汤药物对应的靶基因取交集，通过venn图展示疾病与药物靶基因的交集基因数，此步骤通过“VennDiagram R”包完成。
1.4.3 药物的有效成分对疾病相关基因作用的网络图构建通过药物有效成分作用的靶点基因和疾病相关基因的交集，绘制药物有效成分和疾病靶点基因的网络图。利用Perl软件整理葛根汤-药效成分-靶点基因、疾病-基因之间的网络关系，随后应用Cytoscape软件将网络可视化，每个节点对应的是基因或者是葛根汤的有效化合物，之间予以边进行联系，基因对应的化合物越多，基因结点越大；来源于不同草药的化合物的结点应用不同颜色表示，多重来源的化合物予以对应的混合颜色表示。
1.4.4 蛋白-蛋白互作网络分析和核心基因的筛选通过STRING数据库构建药物作用骨关节炎的靶点基因的PPI网络，并用Cytoscape软件可视化，使用Cytoscape的CytoHCA插件中的6种算法：中间度中心性(BC)、贴近中心性(CC)、学位中心性(DC)、特征向量中心性(EC)、基于局部平均连通性的方法(LAC)、网络中心性(NC)，得出每种算法打分的中位值，超过每种算法的中位值的结点基因被保留，循环运行2次，筛选出重要结点的基因即核心基因。
1.4.5 核心基因表达分析从NCBI基因表达综合数据库GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载包含骨关节炎和正常软骨组织的基因表达数据集GSE114007，通过R语言分析核心基因在正常组和疾病组之间的表达差异，设置P < 0.05为差异有显著性意义，并将核心基因用热图表示。随后通过WPS Office整理差异核心基因对应的化合物。
1.4.6 动物实验验证将12只C57BL/6小鼠随机分为3组：对照组(4只)、骨关节炎组(4只)和治疗组(4只)。对照组只切开小鼠膝关节，予以皮肤缝合，不做其余任何手术处理；骨关节炎组和治疗组切开小鼠膝关节，用尖刀片破坏膝关节交叉韧带，造成关节失稳而诱导骨关节炎，术后关闭关节腔缝合伤口；治疗组每周周日给予1次灌胃木犀草素治疗(10 mg/kg)。
标本的获取与固定：8周后，以3%戊巴比妥钠溶液麻醉生效后，颈椎离断处死小鼠，乙醇消毒，手术切取膝关节标本，置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h，10%乙二胺四乙酸脱钙4周，随后进行脱水、标本透明浸蜡、包埋、切片等相关处理。
番红固绿染色：取上述石蜡切片脱蜡至水，苏木精复染，自来水冲洗，1%盐酸乙醇分化，自来水冲洗，0.02%固绿染色，水洗去多余染液、0.1%番红染色，水洗去多余染液，1%醋酸分化，水洗，乙醇脱水，二甲苯透明，晾干封固，显微镜下观察关节软骨表面结构、软骨胶原破坏程度和软骨细胞分布情况。OARSI评分标准：0分，正常；0.5分，软骨面有异常，番红素缺失但无结构性改变；1分，软骨面纤维性破坏有小裂伤但无软骨的丢失；2分，软骨面破坏较重且有少许软骨丢失；3分，软骨磨损至软骨下骨，损伤面积小于25%；4分，软骨磨损至软骨下骨，损伤面积在25%-50%；5分，软骨磨损至软骨下骨，损伤面积在50%-75%；6分：软骨磨损至软骨下骨，损伤面积超过75%。
免疫组化染色：取上述石蜡切片脱蜡清洗后，柠檬酸盐缓冲液抗原修复，PBS清洗3次，正常山羊血清室温封闭，PBS清洗3次，加入基质金属蛋白酶1、胶原蛋白Ⅱ、环氧合酶2一抗4 ℃冰箱孵育过夜，PBS清洗，羊兔二抗室温1 h，PBS清洗，滴加 DAB 显色液，PBS清洗，苏木精复染，常规脱水，透明，干燥，封固，显微镜下观察。
1.4.7 基因功能富集分析通过BioConductor开发的开源工具R包，将葛根汤作用的靶点基因进行R语言分析，进行京都百科全书(KEGG)和基因本体论(GO)分析，GO分析包括生物过程、细胞成分和分子功能。
1.5 主要观察指标葛根汤有效成分和骨关节炎相关基因的筛选，验证葛根汤主成分之一木犀草素在骨关节炎模型中的治疗作用。
1.6 统计学分析此次实验数据处理和绘图采用软件SPSS.25版本和R 4.1.2版本，组间均数比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过安徽医科大学生物统计学专家审核。

讨论

中医理论认为，骨关节炎多伴肝肾功能不全，可伴有血管闭塞或者关节痛多种症状，多靶点治疗在关节炎中具有良好的效果[21]。复方中药可以提供多项靶点治疗疾病，而网络药理学可以用来研究中药方剂中各种成分的潜在机制，如葛根汤在骨关节炎中的作用。虽然有多项研究已经证明葛根汤有抗炎镇痛等疗效，但其中的相关机制并没有得到充分解释，并且应用在骨关节炎中的研究较少。为了探索葛根汤的有效化合物，该研究通过网络药理学进行药方分析，以期为提取药方的精华、去除有害物质、减少药方的不良反应提供参考。
TCMSP是开源分析中草药的数据库，此数据库中包含几千种中草药，为很多中草药研究学者提供了方便[22-23]。TCMSP数据库包含草药主要活性化合物、化合物ID及分子式，同时还提供了化合物的生物利用度、类药性、药物半衰期等多个草药化合物信息，通过此数据库还可以分析草药的靶标和相关疾病之间的网络联系。通过此数据库获得生物利用度和类药性值，一般学者设置生物利用度≥20%，类药性≥
0.1获得草药的有效成分和对应的靶标，为了获得更准确的葛根汤主要活性化合物和治疗靶标，前人多项研究提高了值域，分别设置生物利用度≥30%，类药性≥0.18[24-25]。通过TCMSP分析，发现葛根汤中含有大量的活性化合物作用于骨关节炎相关的基因，这也许是葛根汤有效治疗关节炎的原因之一。
为了进一步探索葛根汤治疗骨关节炎的主要化合物成分和核心靶标基因，首先通过STRING数据库进行相关基因表达的蛋白互作网络分析，从而探索药物治疗疾病的相关靶基因之间的相互作用网络，利用Cytoscape的CytoHCA插件算法进行分析，在CytoHCA插件算法中主要以中心性进行研究，它研究一个网络节点在此网络的中心程度，从而分析此节点的价值，中心度的算法包括中间度中心性、贴近中心性、学位中心性、特征向量中心性、基于局部平均连通性的方法、网络中心性等多种算法，为了探索研究蛋白互作网络的核心基因，此次研究同时运行了6种点中心程度的算法，以同时大于每种算法的中位值为值域，先后运行2次用以提高核心靶基因探索的准确性，最后获得14个核心靶基因。除此之外，为了探索这些核心靶基因在正常软骨和骨关节炎组织中的表达情况，借助GEO数据库GSE114007数据集进行14个核心靶基因表达分析，最后发现有6个核心靶基因存在表达差异，并且以这6个核心差异基因为靶标的化合物，探索到葛根汤药物治疗骨关节炎的主要有效成分按作用大小排序依次为：槲皮素、木犀草素、甘草查尔酮、山柰酚、二氢槲皮素、芒柄花黄素、β-谷固醇、异鼠李素、柚皮素。槲皮素可在多种植物中提取，是一种黄酮醇类化合物，具有抗氧化、抗炎以及抑制肿瘤细胞侵袭等作用，在骨关节炎中可以通过抑制炎症细胞因子的产生和介入氧化应激反应从而阻止软骨细胞凋亡和软骨细胞外基质降解，缓解病情的进展[26-28]。
木犀草素是一种黄酮类化合物，分布在大量的蔬菜和中草药中[29]，具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤以及在肝脏疾病中起到保护等多种作用[30]。甘草查尔酮是主要来源于甘草的类黄酮化合物，可以抑制脂多糖诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症因子的产生，在小鼠肺损伤中起到抗炎作用；同时甘草查尔酮可以通过调节NF-κB信号通路，降低环氧合酶2、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13、一氧化氮合酶等炎症细胞因子的表达，抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症反应[31]。山柰酚同样是一种天然类黄酮，主要见于水果、豆类和茶类等植物中，可以通过抑制MAPK信号通路，降低白细胞介素1β诱导的基质金属蛋白酶和炎症因子的产生[32]。此次实验选取了在骨关节炎中报道较少的木犀草素化合物作为研究对象，通过动物实验也验证了木犀草素不仅可以改善小鼠关节炎的软骨结构，修复受损软骨组织，还可以抑制环氧合酶2和基质金属蛋白酶1的表达，提高胶原蛋白的表达。综上研究充分说明木犀草素在骨关节炎中具有保护软骨的作用。
为了进一步探索葛根汤治疗骨关节炎的具体作用途径，通过葛根汤治疗骨关节炎靶标基因的富集分析，提示其可调节活性氧、氧化应激和脂多糖等多种反应生物过程，同时还可以影响配体激活、DNA转录结合、氨基酸代谢等分子功能，从多种信号通路影响骨关节炎的细胞代谢，如白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、PI3K-Akt、Toll样受体、HIF-1等信号通路。白细胞介素17是一种促炎因子[33]，由6种细胞因子家族组成，包括白细胞介素17A-F[34]，在骨关节炎患者的血液和关节液中白细胞介素17A表达增高，白细胞介素17A/F靶基因表达增高，可以通过磷酸化C/EBP β促进白细胞介素17信号传导的负调节，通过泛素化介导MAPK 和NF-κB信号通路[35]。高表达的白细胞介素17不仅可促进骨关节炎的软骨病理进展，还可以促进白细胞介素1的产生，从而加重骨关节炎病情[36]。肿瘤坏死因子α可结合TNFR1和TNFR2两种受体，结合的两种受体可以形成复合体从而激活NF-κB 和 MAPK信号通路，促进炎症因子的产生[37-38]，其次MAPK通路可以级联激活NF-κB信号通路，从而进一步加重炎症反应。Toll样受体为跨膜信号转导受体，是Ⅰ型信号跨膜转导蛋白，其分布在细胞外区、跨膜区、细胞质区[39]，在骨关节炎软骨中高表达，Toll样受体的高表达或者传导通路的激活都影响着骨关节炎的进展[40-41]。HIF是低氧诱导因子，其家族成员有HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，HIF-1可以维持软骨细胞内环境的稳定并且调节细胞分化，从而起到保护软骨细胞的作用[42]。HIF-1可分为HIF-1α和HIF-1β两个亚基，是异源二聚体，研究表明高表达HIF-1α在骨关节炎中起到保护作用，HIF-1α通过抑制软骨细胞β连环蛋白的转录活性下调基质金属蛋白酶13，从而缓解骨关节炎的发展；缺乏HIF-1α会强化软骨的分解代谢[43]。
PI3K/Akt信号通路是软骨细胞代谢途径的重要通路，PI3K/Akt属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，通过磷酸化可激活NF-κB信号通路，从而级联产生基质金属蛋白酶，加重骨关节炎的炎症。此次富集分析显示包括核心差异基因在内的葛根汤靶标主要集中在PI3K/Akt信号通路。PI3K/AKT参与许多病理过程，如细胞的氧化损伤和肿瘤的增殖与凋亡以及加重胰腺炎的炎症反应[44-47]。AKT一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K信号通路中重要的下游靶激酶，激活的AKT影响下游效应分子的激活，促进许多炎症因子的表达[48]，随后PI3K在炎症因子刺激下，通过构象变化导致AKT磷酸化并促进基质金属蛋白酶家族的过表达[51]。多项研究表明抑制PI3K/AKT信号通路，可降低基质金属蛋白酶13的表达[49]。因此可以认为，在骨关节炎的疾病进展中可通过多种途径影响PI3K/AKT信号通路从而抑制软骨细胞的凋亡[50-51]。
综上研究，葛根汤中的槲皮素、木犀草素、甘草查尔酮、山柰酚、二氢槲皮素、芒柄花黄素、β-谷固醇、异鼠李素、柚皮素等多种有效化合物通过调节PI3K/Akt等多个信号通路对骨关节炎起到良好的治疗作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

葛根汤治疗骨关节炎的网络药理学分析及动物实验验证

Pueraria decoction in the treatment of osteoarthritis: network pharmacology analysis and animal model validation

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