过表达线粒体蛋白磷酸酶2C对人肾小管上皮细胞转录组的影响

doi:10.12307/2023.915

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (1): 68-73.doi: 10.12307/2023.915

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

过表达线粒体蛋白磷酸酶2C对人肾小管上皮细胞转录组的影响

张丽1，2，3，4，5，杨文君1，2，3，4，5，桑晓红1，2，3，4，5，韩媛媛1，2，3，4，5，冒智捷1，2，3，4，5，王顺1，2，3，4，5，陆晨1，2，3，4，5

1新疆医科大学第一附属医院肾脏病中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；2新疆肾脏替代治疗临床研究中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；3国家肾脏疾病临床医学研究中心新疆分中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；4新疆维吾尔自治区血液净化质量控制中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；5新疆维吾尔自治区肾脏病研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011

收稿日期:2022-11-29 接受日期:2023-01-29 出版日期:2024-01-08 发布日期:2023-06-28
通讯作者: 陆晨，博士，主任医师，新疆医科大学第一附属医院肾脏病中心, 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
作者简介:张丽，女，1976年生，新疆维吾尔自治区昌吉回族自治州人，汉族，2016年新疆医科大学毕业，博士，主任医师，主要从事血液净化及终末期慢性肾脏病的临床及流行病研究。
基金资助:
国家自然科学基金 (81960145)，项目负责人：张丽

Effect of overexpression of protein phosphatase 2Cm on transcriptome of human renal tubular epithelial cells

Zhang Li1, 2, 3, 4, 5, Yang Wenjun1, 2, 3, 4, 5, Sang Xiaohong1, 2, 3, 4, 5, Han Yuanyuan1, 2, 3, 4, 5, Mao Zhijie1, 2, 3, 4, 5, Wang Shun1, 2, 3, 4, 5 , Lu Chen1, 2, 3, 4, 5

1Nephrology Center of First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Xinjiang Clinical Research Center of Renal Replacement Therapy, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3Xinjiang Branch of National Clinical Research Center for Kidney Disease, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 4Xinjiang Blood Purification Medical Quality Control Center, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 5Institute of Nephrology of Xinjiang, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2022-11-29 Accepted:2023-01-29 Online:2024-01-08 Published:2023-06-28
Contact: Lu Chen, MD, Chief physician, Nephrology Center of First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Xinjiang Clinical Research Center of Renal Replacement Therapy, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Xinjiang Branch of National Clinical Research Center for Kidney Disease, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Xinjiang Blood Purification Medical Quality Control Center, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Institute of Nephrology of Xinjiang, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhang Li, MD, Chief physician, Nephrology Center of First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Xinjiang Clinical Research Center of Renal Replacement Therapy, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Xinjiang Branch of National Clinical Research Center for Kidney Disease, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Xinjiang Blood Purification Medical Quality Control Center, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Institute of Nephrology of Xinjiang, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81960145 (to ZL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

线粒体蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2Cm，PP2Cm)：为支链α-酮酸脱氢酶磷酸酶，PP2Cm与支链α-酮酸脱氢酶E2亚单位相互作用，并以底物依赖和相互排斥的方式与支链α-酮酸脱氢酶激酶竞争，因此是支链氨基酸分解代谢的关键调节因子。PP2Cm广泛分布于机体各组织器官中，并在一切器官中表达较高，如心脏、大脑及肝脏。PP2Cm 与胚胎发育、线粒体内膜通透性、心衰及细胞凋亡密切相关。

转录组测序技术：是二代测序技术，具有高灵敏度、高精确度、成本低等特点，可以在基因层面上对疾病和药物进行分析。运用转录组测序技术研究疾病相关基因表达主要集中在差异表达基因分析、GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析。GO功能分析是利用数据库的注释结果，对差异表达基因在分子功能、细胞组分、生物过程这三大类各个层次说明差异基因富集的功能部位。

背景：课题组前期研究发现相较于野生型小鼠，线粒体蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2Cm，PP2Cm)基因缺失小鼠明显发生肾功能衰竭的症状，因此推测PP2Cm可能在肾脏纤维化发展过程中发挥重要保护作用，然而其分子机制尚不明确。
目的：探究PP2Cm基因对于人肾小管上皮细胞转录组的影响。
方法：培养人肾小管上皮细胞，用质粒将PP2Cm基因转染进入人肾小管上皮细胞，荧光定量PCR实验和Western blot实验检测细胞中PP2Cm的表达，随后分别提取细胞RNA进行转录组测序，寻找转染组和对照组之间的差异性表达基因，利用生物信息学方法进一步对所得的差异基因进行GO分析和KEGG分析。

结果与结论：通过测序分析，与未转染空白细胞相比，在转染PP2Cm基因的人肾小管上皮细胞中存在796个差异性表达基因，其中553个下调基因，243个上调基因，GO分析结果显示，上调表达的基因显著富集在细胞生物合成过程、蛋白质翻译、内在凋亡信号通路等；下调表达的基因显著富集在内皮细胞增殖、细胞黏附等信号通路；KEGG分析结果显示，显著上调表达的基因富集在氨基酸代谢、生物合成等代谢相关信号通路；下调表达的基因显著富集在泛酸和辅酶A的生物合成等信号通路。结果表明，PP2Cm过表达可以影响肾小管上皮细胞的一系列生物学过程相关的多条信号通路，可能在氨基酸代谢、生物合成等代谢相关信号通路中起重要作用。

https://orcid.org/0000-0001-5220-3385 (张丽)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 肾小管上皮细胞, PP2Cm, 转录组测序, 富集分析, 信号通路

Abstract: BACKGROUND: A previous study by our group found that protein phosphatase 2Cm (PP2Cm) null mice developed significantly fewer symptoms of renal failure relative to wild-type mice, and thus it was speculated that PP2Cm may play an important protective role in the development of renal fibrosis, however, the molecular mechanisms remain undefined.
OBJECTIVE: To investigate the effect of the PP2Cm gene on the transcriptome of human renal tubular epithelial cells.
METHODS: Cultured human renal tubular epithelial cells were transfected with the PP2Cm gene into human renal tubular epithelial cells using plasmids. The expression of PP2Cm in the cells was detected by fluorescence quantitative PCR assay and western blot assay, and subsequently, cell RNA was separately extracted for transcriptome sequencing to look for differentially expressed genes between transfected and control groups. The resulting differential genes were further subjected to GO analysis and KEGG analysis using bioinformatics methods.
RESULTS AND CONCLUSION: There were 796 differentially expressed genes, 553 of which were downregulated genes and 243 upregulated genes, in human renal tubular epithelial cells transfected with the PP2Cm gene compared with untransfected blank cells by sequencing analysis. GO analysis results showed that the upregulated genes were significantly enriched in cellular biosynthetic processes, protein translation, intrinsic apoptotic signaling pathways, and so on. The downregulated expressed genes were significantly enriched in endothelial cell proliferation, cell adhesion and other signaling pathways. KEGG analysis results showed that the significantly up-regulated genes were enriched in metabolism-related signaling pathways such as amino acid metabolism and biosynthesis. The downregulated expressed genes were significantly enriched in signaling pathways such as pantothenate and coenzyme A biosynthesis. Our results show that PP2Cm overexpression can affect a number of signaling pathways related to a range of biological processes in renal tubular epithelial cells, which may be important in metabolism-related signaling pathways such as amino acid metabolism and biosynthesis.

Key words: renal tubular epithelial cell, PP2Cm, transcriptome sequencing, enrichment analysis, signaling pathway

中图分类号:

张丽, 杨文君, 桑晓红, 韩媛媛, 冒智捷, 王顺, 陆晨. 过表达线粒体蛋白磷酸酶2C对人肾小管上皮细胞转录组的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 68-73.

Zhang Li, Yang Wenjun, Sang Xiaohong, Han Yuanyuan, Mao Zhijie, Wang Shun, Lu Chen. Effect of overexpression of protein phosphatase 2Cm on transcriptome of human renal tubular epithelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(1): 68-73.

图/表（结果） 9

2.1 HK-2细胞形态 HK-2细胞呈贴壁生长，细胞大小不一，形态不规则，呈圆形、梭形等，漩涡式增殖，漩涡中心细胞密集，细胞内可见一两个核仁，培养基中仅存少量漂浮细胞及细胞碎片；转染PP2Cm后细胞形态改变不大，呈圆形、梭形等，细胞增殖速度未改变，培养基中仅存少量漂浮细胞及细胞碎片，见图1。

2.2 Western blot实验验证PP2Cm过表达 Western blot检测结果显示转染PP2Cm基因的HK-2细胞存在PP2Cm蛋白的表达，见图2。

2.3 PCR实验验证PP2Cm过表达 PCR实验结果表明PP2Cm基因成功转染至HK-2细胞，转染效率达78.2%(P < 0.01)，见图3。转染效率高，PP2Cm稳定表达，可用于后续实验。

2.4 转录组测序质量评估转录组测序结果显示Q20百分比为100%，Q30百分比均超过99%，GC含量所占比例为 50.0%-50.5%，见表2，测序质量总体较好, 可进行后续分析。

2.5 过表达PP2Cm基因对HK-2细胞转录组的影响 RNA-seq结果显示，31 369个基因在过表达组与对照组细胞共同表达，796个基因特异性表达，其中243个基因上调表达，553个基因下调表达，下调表达的基因明显多于上调表达的基因(FC ≥ 2 or ≤ 0.5，FDR < 0.05)，见图4。

通过提取PP2Cm过表达后上调表达基因进行GO分析，结果显示，上调表达的基因显著富集在细胞氨基酸生物合成过程、tRNA氨基酰化、内质网应激反应中的内源性凋亡信号通路、凋亡过程、对病毒的反应、内质网应激反应、对有毒物质的反应、钙离子转运、神经系统发育、细胞钙离子稳态等生物学过程，见图5。

GO分析结果显示，下调表达的基因显著富集在细胞外基质组织、内皮细胞增殖的正向调控、急性期反应、血管生成、细胞黏附、跨血脑屏障运输、Notch信号通路、内肽酶活性的负调节、女性怀孕、上皮细胞分化等生物学过程，见图6。

通过提取PP2Cm过表达后上调表达基因进行KEGG分析，结果显示，上调表达的基因显著富集在半胱氨酸和蛋氨酸代谢、氨基酸的生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、癌症中的转录失调、维生素B6代谢、代谢途径、VEGF信号通路、胰岛素抵抗、鞘糖脂生物合成、钙重吸收调节等生物学过程，见图7。

KEGG分析结果显示，下调表达的基因显著富集在泛酸和辅酶A的生物合成、癌症通路、乳腺癌、Rap1信号通路、AGE-RAGE信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调节、蛋白质消化吸收、IL-17信号通路、轴突传导、补体和凝血级联等生物学过程，见图8。

参考文献

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引言

慢性肾脏病具有患病率高、知晓率低、预后差以及医疗费用高等特点，是继心脑血管疾病、糖尿病和恶性肿瘤之后，又一严重危害人类健康的疾病。近年来慢性肾脏病的患病率呈逐年上升的趋势，研究发现全球一般人群患病率已高达14.3%，中国横断面流行病学研究显示，18岁以上人群慢性肾脏病患病率为10.8%，患病人群接近1.2亿[1-3]。然而目前现代医学仍然没有针对慢性肾脏病的特效疗法，临床多采用一体化综合对症治疗的手段，若疾病发展至慢性肾脏病4-5期，通常在此治疗基础上添加肾脏替代疗法[4-5]。因此，慢性肾脏病的早期防控是中国目前亟待解决的重大公共卫生问题，寻找有效延缓或逆转慢性肾脏病的干预靶点，对防治慢性肾脏病具有重要的现实意义。
课题组前期研究发现在小鼠慢性肾功能衰竭模型中，相较于野生型小鼠，线粒体蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2Cm，PP2Cm)基因缺失小鼠明显发生肾小球及间质血管扩张充血和出血、肾小球出血性坏死、间质纤维组织增生伴炎性细胞浸润、尿肌酐清除率明显下降、尿中蛋白水平升高等。由此，作者推测PP2Cm可能在肾脏病进展过程中发挥重要保护作用，然而其分子机制尚不明确。SHIMADA等[6]使用高磷饮食制备大鼠肾小管损伤模型，研究发现大鼠肾脏PP2Cm表达下调，并且PP2Cm调控的支链脂肪酸代谢受到抑制。研究发现：PP2Cm为支链酮脱氢酶(branched chain α-keto acid dehydrogenase，BCKD)磷酸酶，PP2Cm与BCKD E2亚单位相互作用，并以底物依赖和相互排斥的方式与BCKD激酶竞争[7]，因此是支链氨基酸(branched-chain amino acid，BCAA)分解代谢的关键调节因子。PP2Cm广泛分布于机体各组织器官中，并在一些器官中表达较高，如心脏、大脑及肝脏。PP2Cm 与胚胎发育、线粒体内膜通透性、心衰及细胞凋亡密切相关[8-9]。研究已证实，在糖尿病小鼠肝脏及脂肪组织中，PP2Cm 蛋白的表达显著低于普通小鼠[10]；另外发现脂联素可以调控糖尿病小鼠PP2Cm和支链氨基酸代谢水平，这表明脂联素可以改善糖尿病状态下支链氨基酸的分解代谢；郭雄[11]研究发现PP2Cm基因缺失小鼠心肌缺血再灌注损伤较对照组更严重。LIAN等[12]发现PP2Cm直接介导糖尿病患者的支链氨基酸分解代谢和氧化应激，PP2Cm过度表达可以通过减少支链氨基酸的分解代谢和氧化应激来减轻心肌缺血再灌注损伤。WU等[13]发现特异性PP2Cm基因敲除对小鼠心脏结构和运动功能没有显著影响，但它减弱了运动对心肌梗死的心脏保护作用。因此，PP2Cm作为分解代谢的关键调节因子发挥着关键作用。
目前PP2Cm在分解代谢调节中的作用仍知之甚少，并且PP2Cm与多种疾病存在相关性，结合课题组前期研究结果，作者推测PP2Cm可能在肾脏纤维化发展过程中发挥重要保护作用，然而其分子机制尚不明确，因此该研究使用质粒将PP2Cm基因转染进入人肾小管上皮细胞(HK-2)，以此作为研究对象，通过转录组测序技术(RNA-seq)全面筛查PP2Cm参与调节的基因和通路，为肾脏病治疗带来新的途径。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计人肾小管上皮细胞转录组测序分析。
1.2 时间及地点 2021年6月至2022年6月在新疆医科大学第一附属医院中心重点实验室完成，其中样本委托武汉生命之美科技有限公司进行RNA-seq分析，建库结果使用Illumina Novaseq 6000测序平台进行双端(paired-end)测序。在实验过程中严格按照新疆医科大学第一附属医院中心实验室医学伦理学标准实施(实验伦理审批号：20220308-045)。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞人肾小管上皮细胞(HK-2)购买于武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.3.2 实验试剂及设备体积分数为75%乙醇(江西草珊瑚消毒用品有限公司，中国)；胎牛血清(Gibico，美国)；0.25%胰蛋白酶溶液(Gibico，美国)；DMEM基础细胞培养基(Gibico，美国)；平衡盐溶液(Gibico，美国)；青链霉素(Gibico，美国)；RIPA裂解液(索莱宝，中国北京)；蛋白上样缓冲液(索莱宝，中国北京)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(索莱宝，中国北京)；Tris-甘氨酸电泳缓冲液(索莱宝，中国北京)；电泳转移缓冲液(索莱宝，中国北京)；TBST缓冲液(索莱宝，中国北京)；脱脂奶粉(索莱宝，中国北京)；Novex™ AP 显色底物(BCIP⁄NBT) (ThermoFisher，美国)；Anti-PP2Cm抗体(Proteintech，美国)；Goat Anti-rabbit IgG(博奥森，中国北京)；Anti-GAPDH(博奥森，中国北京)；氯仿(索莱宝，中国北京)；异丙醇(Merck KGaA，德国)；DEPC处理水(索莱宝，中国北京)；LipofectamineTM 3000(Invitrogen公司，美国)；1.5 mL EP管(雷博尔，中国海门)；聚偏二氟乙烯膜(ThermoFisher，美国)；Mini-PROTEAN® Tetra 电泳槽(Bio-Rad，美国)；PowerPac™ HC 高电流电泳仪电源(Bio-Rad，美国)；Gel Doc™ XR+ 系统(Bio-Rad，美国)；37 ℃细胞培养箱(Thermo science，型号：371型，美国)；低温高速离心机(Hitiachi，型号：CT15RE型，日本)；恒温水浴锅(亚荣，B-260，中国上海)；荧光倒置显微镜(蔡司，型号：ZEISS Axio observer Z1，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 人肾小管上皮细胞培养 HK-2细胞复苏后接种于25 cm2培养瓶，内有含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，将培养瓶置于37 ℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱培养。待倒置显微镜下可见细胞融合率80%-90%时进行传代。
1.4.2 PP2Cm质粒的构建 PP2Cm质粒委托湖南优宝生物公司进行构建。
1.4.3 质粒转染HK-2 选用第3代人HK-2细胞，细胞密度达70%-80%可行转染实验。转染前4 h，更换无血清DMEM培养基培养细胞，取2.5 μg质粒加入100 μL opti-MEM孵育5 min，取5 μL Lipofectamine™ 2000加入100 μL opti-MEM孵育5 min，混匀上述试剂。将上述混合物加入预处理细胞中进行转染。
1.4.4 Western blot实验验证PP2Cm的蛋白表达转染72 h后，吸弃培养基，使用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，收集消化完毕的细胞至1.5 mL EP管，离心弃上清后加入100 μL RIPA裂解液，置于冰上裂解30 min；裂解结束后离心15 min(12 000 r/min)，取上清进行蛋白定量；配置定量后的蛋白液，于100 ℃煮10 min；制作10% SDS-PAGE凝胶，每个泳道添加30 μg蛋白；打开电泳仪，上层胶电压为80 V(30 min)，下层胶电压为100 V(2 h)，转膜2 h(100 V)；转膜结束后，5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST清洗3遍；剪裁聚偏二氟乙烯膜，在膜上滴加PP2Cm(1∶1 000)抗体3 mL和内参GAPDH(1∶1 000)抗体3 mL，4 ℃摇床过夜，于第2天取出，TBST清洗3遍，加入二抗(Goat Anti-rabbit IgG 1∶1 000)，室温孵育2 h，TBST清洗3遍；清洗结束后，加入3 mL AP显色液，避光显色，待条带清晰后，使用凝胶成像系统扫描，应用Image Lab软件计算待测条带灰度值。
1.4.5 细胞RNA提取转染48 h后，吸弃培养基，使用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，收集消化完毕的细胞至1.5 mL EP管，离心弃上清后加入1 mL Trizol，室温放置5 min后加入200 μL氯仿，室温放置5 min后离心15 min(12 000 r/min)，转移上层水相于另一新EP管中，加入异丙醇后离心10 min(12 000 r/min)，可见白色沉淀；弃上清，干燥RNA沉淀10 min，将沉淀溶于适量的DEPC水中，计算RNA的纯度和浓度。

1.4.6 RT-PCR检测PP2Cm的mRNA表达根据说明书，在离心管依次加入1 μL Total RNA、2 μL DNA digester Buffer、1 μL DNA digester，加入RNase free ddH2O至10 μL配制成反转录体系，按Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒操作说明进行反转录。使用Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒检测细胞PP2Cm的表达。以GAPDH做内参，结果应用公式X= 2-ΔΔCT法分析。引物序列见表1。

1.4.7 样本分组与mRNA文库构建转染PP2Cm基因的HK-2为N组，实验重复3次，分别为N1、N2、N3，使用质粒空载转染HK-2为对照组，实验重复3次，分别为A1、A2、A3。转染结束后，吸弃培养基，使用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，收集消化完毕的细胞至1.5 mL EP管，离心弃上清后加入1 mL PBS，置于-80 ℃冰箱保存，样本委托武汉生命之美科技有限公司进行RNA-seq 分析，建库结果使用Illumina Novaseq 6000测序平台进行双端(paired-end)测序，获得了高质量的转录组数据。6个样品构建的测序文库数据经过滤后计算每个测序文库的Phred值(Q20、Q30)和GC含量，得到有效数据用于后续分析。
1.4.8 RNA-seq数据处理对数据进行质控，随后进行基因定量分析、基因表达水平分析(主成分、相关性、差异基因筛选等)，并对筛选出的差异表达基因进行GO分析和KEGG分析。
1.5 主要观察指标两组细胞转录组测序分析结果。
1.6 统计学分析实验数据采用x±s表示，使用SPSS v22.0软件(IBM SPSS Statistics for Windows)进行统计分析。采用单因素方差分析(One-wayANOVA)Tukey’s HSD检验，P < 0.01为差异有显著性意义。文章统计学方法已经新疆医科大学第一附属医院生物统计学专家审核。

讨论

PP2Cm导致蛋白质功能缺陷的单核苷酸多态性与许多人类疾病相关，如心血管疾病、枫糖尿病(Maple Syrup Urine Disease)、2型糖尿病和神经系统疾病[14]。为了进一步研究PP2Cm在肾脏疾病中的重要作用，该研究对转染PP2Cm 基因的HK-2细胞进行转录组测序。研究发现31 369个基因在过表达组与对照组细胞共同表达，796个基因特异性表达，其中243个基因上调表达，553个基因下调表达。从表达基因的GO和KEGG分析发现，大多数与氨基酸代谢、细胞生物合成相关。
GO分析结果显示上调表达的基因与氨基酸生物合成、内质网应激、凋亡信号等相关；郭雄[11]研究发现PP2Cm基因缺失小鼠心肌缺血再灌注损伤较对照组更严重，使用心肌点注射腺病毒上调糖尿病小鼠心肌中PP2Cm 的表达水平后，糖尿病小鼠心功能损伤显著减轻；使用丙酮酸脱氢酶激酶抑制剂(BT2)治疗糖尿病小鼠后，小鼠缺血再灌注损伤减轻，该实验证实PP2Cm 分子表达的下调，可使心肌缺血再灌注损伤加重，也进一步证实PP2Cm 分子表达下降是糖尿病心肌缺血再灌注损伤加重的重要机制。CARAGNANO等[15]发现miR-22、PP2Cm、BCAA、mTOR和ALP是扩张型心肌病的关键调控因子，这些调控因子能改变蛋白稳态，激活炎症小体。LIAN等[12]证实PP2Cm的过度表达通过减少支链氨基酸的分解代谢和氧化应激来减轻心肌缺血再灌注损伤。细胞凋亡和多种疾病相关，研究发现细胞凋亡促进了肾小管细胞的丢失，促进慢性肾脏病的发展[16-19]，靶向细胞凋亡调控相关基因可治疗急性或慢性肾脏疾病[20-24]。
KEGG结果显示转染PP2Cm 基因后，显著上调表达的基因富集在氨基酸生物合成以及半胱氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等区域；显著下调表达的基因显著富集在泛酸和辅酶A的生物合成过程，以及与AGE-RAGE信号通路相关，这与孙海鹏团队的研究结果一致[9，25]。孙海鹏团队通过蛋白质组学和生化分析，已经确定PP2Cm是内源性BCKD磷酸酶，负责支链氨基酸诱导的BCKD去磷酸化和激活。研究证实PP2Cm基因缺失小鼠的BCKD活性调节受损，导致血浆支链氨基酸浓度升高和潜在细胞毒性α-酮酸衍生物(支链-α-酮酸[BCKA])清除率受损[9，25]。当喂食高蛋白饮食时，PP2Cm基因缺失小鼠出现了人类MSUD的特征，新生小鼠死亡率增加。研究证实，在糖尿病小鼠的肝脏及脂肪组织中PP2Cm 蛋白的表达显著低于普通小鼠，并与糖尿病患者的支链氨基酸代谢紊乱密切相关[10，26]。
在这项研究中，PP2Cm仍有部分生物作用未有文献报道。GO分析结果显示上调表达的基因显著富集在凋亡过程、对有毒物质的反应、钙离子传输、神经系统发育等方面，显著下调表达基因显著富集在血管生成、细胞黏附、血脑屏障运输、Notch信号通路等方面；KEGG分析结果显示上调表达的基因显著富集在VEGF信号通路、钙吸收信号通路、癌细胞的转录失调等，下调表达基因显著富集在癌症通路、Rap1信号通路、AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、凝血级联通路等方面。
另外还有文献报道PP2Cm具有预测高尿酸血症、肝损伤、肿瘤等作用[27-29]。SANDOVAL-PLATA等[30]对痛风患者和无症状高尿酸血症患者进行全基因组关联研究，结果发现ABCG2、SLC2A9、SLC22A11、GCKR、MEPE、PPM1K-DT、LOC105377323和ADH1B中的13个独立单核苷酸多态性达到全基因组意义，并可作为无症状高尿酸血症向痛风转变的预测因子。HU等[31]通过对234例患者长达4年的随访研究，发现PP2Cm rs1440581 CC和rs7678928 TT基因型与脑血管疾病具有相关性，并且PP2Cm rs1440581 CC基因型携带者更容易发生肝损伤和非酒精性脂肪肝。LIU等[32]研究发现PP2Cm的缺失显著延长了白血病模型小鼠的生存期，这些发现将增加干细胞代谢和营养代谢领域的认知。
综上所述，通过RNA-seq测序技术和生物信息学分析探究了过表达PP2Cm对HK-2细胞中整体基因表达的影响，结果表明PP2Cm可以影响HK-2细胞中的一系列生物学过程和分子生物学功能，调节多条细胞内重要信号通路，由此推测PP2Cm在肾脏疾病发生、发展中起重要作用。同时，RNA-seq分析结果中涉及到多个此前未报道的PP2Cm调节基因和调节通路，这为后续进一步研究PP2Cm的功能提供了新方向和新思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

过表达线粒体蛋白磷酸酶2C对人肾小管上皮细胞转录组的影响

Effect of overexpression of protein phosphatase 2Cm on transcriptome of human renal tubular epithelial cells

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