2.1   实验动物数量分析   实验共纳入C57BL/6小鼠54只，分为9组，实验期间无动物死亡，无加力装置脱落，全部进入结果分析。
2.2   牙移动距离测量   正畸牙移动的距离随正畸力作用时间的延长而增加。与空白组相比，正畸力施加12 h组测量到磨牙出现(0.020±0.007) mm移动(P < 0.01)，加力1 d组可测量出明显的牙移动距离(0.030±0.005) mm(P < 0.01)，加力7 d牙移动距离最远(0.110±0.020) mm(P < 0.01)，见图2。



2.3   压力侧牙周膜形态改变    观察发现，加力30 min至4 h组压力侧牙周膜没有发生明显的变化。加力12 h组开始观察到随加力时间延长，压力侧牙周膜内细胞及纤维排列由规则有序逐渐变紊乱，牙周膜逐渐被压缩，至3 d组压力侧牙周膜间隙最窄，7 d组牙周膜间隙稍恢复；加力1 d组压力区出现透明样变化，至7 d组透明样变达最大面积，见图3。



2.4   TRAP染色   阳性染色破骨细胞的胞质呈紫红色，见图4。空白组和加力30 min至4 h组压力侧偶尔可见到破骨细胞的出现；加力12 h组压力侧破骨细胞开始增多(P < 0.01)，随后随加力时间的增加而增加，至加力7 d其数量达最大值(P < 0.01)，见图5。








2.5   Belin-1、LC3B以及细胞核YAP的免疫组化染色   免疫组织化学染色可见：压力侧牙周膜内Beclin-1和LC3B主要在细胞质中表达，细胞核YAP即active-YAP主要在细胞核内表达，三者的阳性染色皆为棕色，见图6-8。

Beclin-1和LC3B在实验组压力侧牙周膜中免疫组化染色的变化趋势类似。加力30 min 时压力侧Beclin-1、LC3B的平均吸光度值均高于空白组(P < 0.05)，加力1 h二者平均吸光度值均最高(P < 0.01)；加力1-4 h期间逐渐减弱，但4 h组二者的平均吸光度值仍然比空白组高(P < 0.05)；加力12 h二者的平均吸光度值明显增强，达又一峰值(P < 0.01)；随后回落，至加力7 d它们的表达水平与空白组接近(P > 0.05)，见图9及表1。

加力30 min组压力侧牙周膜内可见active-YAP的平均吸光度值增加(P < 0.01)；加力1 h其平均吸光度值最强(P < 0.01)；加力1-4 h组逐渐减少，至4 h组active-YAP的平均吸光度值达最弱，但仍强于空白组(P < 0.01)；加力12 h组再次增强(P < 0.01)，随后逐渐减弱，至加力7 d组与空白组无差异(P > 0.05)，见图9及表1。
2.6   Beclin-1、LC3B与active-YAP表达变化的相关性分析   实验结果中压力侧牙周膜中Beclin-1和LC3B的表达变化趋势与active-YAP趋势相似，表达强度都在加力1 h达峰值。随后逐渐降低，于加力4 h降至谷值，加力12 h它们的表达增强达又一峰值，而后回落，于7 d都降至基础水平，见图10。

Pearson相关性分析：可见Beclin-1与active-YAP的表达变化呈高度正相关，相关系数r=0.941，P < 0.01；LC3B与active-YAP的表达变化也呈高度正相关，相关系数r=0.956，P < 0.01，见表2。

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通常正畸治疗是施加正畸力使错位的牙齿移动到正确的位置，但这个过程并不是一个简单的位移过程。正畸牙移动是一种由机械力学刺激引起的牙周组织改建的过程，这个过程涉及了细胞对机械信号的感知和转导，多种生物因子和信号通路参与其中。虽然，目前对于这些信号通路和生物因子的研究尚不明确，但是近年来自噬被发现似乎参与牙周细胞对正畸力的应变[1]；而Hippo-Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)通路因参与细胞对机械刺激的响应[2]，在机械转导过程中发挥关键作用，且能够调控自噬[3]，近年来其在关于正畸牙移动的研究中也逐渐受到关注。

作为一种重要的细胞机制，自噬常常在细胞中扮演着“管家”的角色，通过降解细胞中功能受损的或不需要的细胞器等自噬为细胞的生存和功能维持提供能量[4]。自噬在细胞正常生理活动的维持和许多疾病中都有重要作用，它积极参与细胞对内、外环境变化以及各种应激的应答。健康细胞的自噬一般处于低水平状态[5]，但是，以往研究发现各种刺激都可以引起细胞自噬水平的变化[6-7]。机械刺激诱导细胞自噬的现象已经被证实是普遍存在的[7-8]，有学者曾用透射电镜在正畸牙的压力侧牙周膜内观察到自噬小体[9]；近年来，许多研究都证实自噬参与正畸牙移动过程中牙周组织的改建[10-11]，并在其中发挥重要作用。

在细胞存活、增殖、分化和器官大小的调控等方面Hippo信号通路都有重要作用，它广泛参与细胞的生物学活动[12]，此通路高度保守，受到各种内、外在信号的严格调控。YAP是一种转录共激活因子，它也是Hippo通路的关键效应因子。当Hippo通路被激活后，YAP将被磷酸化，YAP磷酸化后将留在细胞质中执行其他功能或被降解[13]。当Hippo通路失活，YAP会被易位到细胞核，而后与TEA结构域家族成员(TEAD)结合，调控下游基因的转录，发挥后续功能[14]。YAP被发现能够识别各种类型的机械刺激，被认为是力学感应因子。有学者发现，细胞在受到机械外力刺激后，位于细胞质的YAP会进入到细胞核，启动后续调控基因的转录[15]。Hippo-YAP通路也与自噬关系密切[3]，YAP被发现参与调控细胞的自噬[16]；还有学者提出自噬可能是YAP机械转导的下游调控事件[17]。总之，Hippo-YAP通路在机械刺激传导中有关键作用，与自噬之间也存在密切关联。因此，正畸牙移动期间作为机械刺激敏感通路的Hippo-YAP通路很可能参与此过程，它有可能介导了机械力学刺激对细胞自噬水平的影响。

此次研究通过构建C57BL/6小鼠正畸牙移动模型，设置不同的加力时间，观察各时间点压力侧牙周膜形态改变，并检测压力侧牙周膜细胞的自噬水平以及Hippo-YAP通路的变化。初步探究正畸牙移动期间是否有Hippo-YAP通路参与牙周膜细胞对机械刺激的响应，以及Hippo-YAP通路和自噬之间是否存在关联。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验。方差分析用于多组对比，LSD法用于组间两两对比。
1.2   时间及地点   实验于2021年11月至2022年2月在西南医科大学口颌面修复重建和再生实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   SPF级雄性C57BL/6小鼠，6-8周龄，体质量(25±7) g，购于成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK(川)2020-030。此次实验严格按ARRIVE指南执行[18]，符合赫尔辛基宣言的道德标准，已通过西南医科大学伦理委员会审批，审批号：20210819-17。54只小鼠按随机数字表法分为9组，每组6只，空白组小鼠不做任何处理，实验组小鼠行正畸牙移动建模，建模时间分别为30 min，1 h，2 h，4 h，12 h，1 d，3 d，7 d。

1.3.2   实验材料、仪器   结扎丝(杭州西湖)；0.12 mm镍钛螺旋拉簧(上海埃蒙迪)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色试剂盒、EDTA脱钙液、40 g/L多聚甲醛溶液、苏木精-伊红染液、DAB试剂盒(北京索莱宝)；Beclin-1、LC3B抗体，SP免疫组化检测试剂盒(北京博奥森)；active-YAP抗体(Abcam，美国)；YB-7LF冷冻包埋机、YT-7FB型生物组织摊烤片机(湖北亚光)；半自动轮转式切片机(Leica，德国)；显微摄像系统(Olympus，日本)。
1.4   实验方法   
1.4.1   牙移动建模   各实验组小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定已成功麻醉的小鼠，拉开小鼠的口角，用正畸结扎丝扎紧其右上第一磨牙，结扎丝再与镍钛螺旋拉簧连接，用测力计确定30 g近中向拉力，再用结扎丝将拉簧固定于上颌两切牙上，光固化树脂将上切牙和结扎丝一起包围固定，见图1。建模后进软食，每天检查小鼠口内装置是否稳固。 

1.4.2   牙移动距离测量、取材   造模后按设定时间点(30 min，1 h，2 h，4 h，12 h，1 d，3 d，7 d)，注射过量戊巴比妥钠处死小鼠(保证小鼠能死亡，具体剂量为100 mg/kg)。在小鼠未死亡前，用带表游标卡尺(50分度)测量其牙移动距离。测量方法为：先测量小鼠右侧上颌第一、二磨牙的近中边缘嵴最突点之间的距离，再用此距离减去第一磨牙矢状向宽度所得即为牙移动的距离。同一实验者测每只小鼠的牙移动距离3次，取3次测量值的均值为该小鼠的牙移动距离。而后分离小鼠的右侧上颌骨，去净附着软组织，取第一磨牙及其周围骨组织。
1.4.3   石蜡切片的制备   40 g/L多聚甲醛固定取材所得小鼠右上第一磨牙组织块1 d，固定完成后，于PBS中浸泡1 d；然后组织进行脱钙，使用pH=7.2的EDTA脱钙液；脱钙完成后，组织块常规脱水、透明。将组织块按第一磨牙颊侧或腭侧朝上行包埋，切片时沿小鼠磨牙长轴的矢状向方向切，切片的厚度为4 μm，选取磨牙近、远中根均完整的切片捞片，切片于4 ℃保存备用。
1.4.4   苏木精-伊红染色   切片先烤30 min，再脱蜡水化，随后用苏木精染7 min，自来水洗2 min；而后用盐酸乙醇分化30 s，自来水泡15 min；再用伊红染40 s，自来水洗2 min；脱水透明；封固，显微镜下观察。
1.4.5   TRAP染色   烤切片30 min，再脱蜡水化；稍晾干切片，TRAP固定液4 ℃固定1 min，自来水洗2 min；按说明书配制TRAP孵育液，避光37 ℃孵1 h，自来水洗3 min(×2)；再用苏木精染7 min，自来水洗3 min；而后将切片脱水透明，封固。显微镜下计数压力侧破骨细胞。
1.4.6   免疫组化染色   60 ℃烘烤切片过夜，脱蜡水化；用抗原修复液于37 ℃环境中修复30 min，UP水冲洗，PBS洗5 min；用H2O2(浓度3%)作用20 min ；加山羊血清孵20 min，室温，倾去，勿洗；加一抗：LC3B浓度为1∶200，Beclin-1 浓度为1∶400，active-YAP浓度为1∶2 000，4 ℃ 孵育过夜，PBS洗3 min(×3)；稍晾干切片，加二抗(试剂盒内匹配的二抗为直接使用原液，无需再配制)后盖上同组织大小的封口胶，孵20 min，室温，PBS持续冲洗3 min(×3)；加SA/HRP，孵15 min，PBS洗3 min(×3)；DAB显色，自来水冲洗；苏木精复染。切片脱水透明。封固后镜下观察牙根压力侧牙周膜近冠1/3部分，取不重叠视野3个，采图。图片中目的蛋白的平均吸光度值使用Image Pro-Plus 6.0软件分析。
1.5   主要观察指标   建模后按设定时间点(建模后30 min，1 h，2 h，4 h，12 h，1 d，3 d，7 d)处死小鼠，观察测量磨牙移动的距离。磨牙组织切片，苏木精-伊红染色观察压力侧牙周膜形态改变；TRAP染色计数压力侧破骨细胞数量；免疫组织化学染色观察细胞核YAP蛋白以及自噬相关蛋白LC3B、Beclin-1在压力侧牙周膜细胞内的表达情况。
1.6   统计学分析   文章统计学方法已经西南医科大学生物统计学专家审核。使用SPSS 23.0统计软件分析数据，计量资料用x±s表示，两组间比较采用LSD法，多组间比较用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。不同变量间进行两变量关联性分析(pearson相关系数法)，相关系数取值-1 < r < 1，检验水准α=0.05。

正畸牙移动是由机械力引起的，以牙周组织改建为特征。牙周组织对外界施加的机械力做出的生理反应和适应性改建过程是正畸牙移动的关键过程。牙周膜将牙根和牙槽骨相连接[19]，是牙周组织的重要组成部分，也是正畸力发挥生物学作用的重要部分[20]。当正畸力施加后，牙周膜快速接收到由牙体组织传导而来的力学刺激，张力侧牙周膜表现为被拉伸，而压力侧则呈现出被挤压的状态，牙周膜的形态结构以及其内细胞所处的微环境都将发生变化。所以，正畸力的施加使牙周膜形态结构发生改变，而后介导周围组织的改建，实现牙移动。此次研究也观察到随加力时间延长，压力侧牙周膜间隙先变窄，后期稍恢复，其内纤维束和细胞排列变紊乱；而且随着作用力时间延长，压力侧牙槽骨附近破骨细胞逐渐增多，提示骨改建活跃；正畸牙也在此阶段发生明显位移，这些变化是正畸力施加后细胞和组织应变的结果。但是，到目前为止，机械刺激诱导的牙周组织、细胞的改变和其中的机械转导机制仍不完全清楚。

自噬是细胞对机械刺激的综合反应的一部分，它使细胞能够应对不断变化的物理环境[21]。自噬参与细胞的多种生物学活动，如响应应激、调控细胞的发育和分化等。目前发现，在压应力作用下，牙周膜成纤维细胞等许多细胞中都存在细胞自噬水平增强，以协助细胞适应刺激[22-23]。作者所在课题组之前的研究也发现，在牙移动期间正畸牙压力侧牙周膜内自噬水平将发生变化，课题组认为正畸牙移动期间自噬在牙周膜内环境稳态的维持以及改建中起重要作用[24]。HUANG等[25]也证实自噬是正畸牙移动中的一个重要过程。此次研究也观察到机械力作用下细胞自噬增强的现象，在加力30 min组压力侧牙周膜内即可观察到Beclin-1和LC3B表达的增加，提示自噬水平的升高，此时升高的自噬水平可能有助于协调细胞适应机械刺激，维持细胞的生存和功能，在骨稳态的维持中自噬也起一定作用[26]。在对破骨细胞的调节中自噬似乎发挥双重作用，自噬被发现能负向调控破骨细胞的分化和成熟，并以此来维持骨稳态[27]。但是，应激环境下自噬又可为破骨细胞提供能量，维持其生存，促进破骨细胞分化、成熟[28-29]。正畸牙压力侧由于长期机械力的作用，存在应激环境[1,11]，此次研究中正畸牙压力侧的自噬水平在正畸加力12 h达另一峰值，与此同时观察到在牙根的压力侧破骨细胞开始在牙槽骨骨陷窝附近聚集，数量开始增加，这个过程可能受到自噬的积极影响。

所以，正畸牙移动过程中自噬积极参与响应机械刺激，以协助细胞对机械刺激的应变。但是，此过程中机械刺激通过何种途径诱导细胞自噬水平的变化还不得而知。有学者提出机械刺激作用下细胞的应变涉及一个重要过程——机械转导，即将机械刺激转化为生物化学信号的过程[30-32]。在机械转导的过程中Hippo-YAP通路被发现发挥重要作用[33-34]，在机械转导过程中，通过监测细胞骨架，Hippo-YAP通路间接感知、响应细胞机械环境的变化[35]。该通路关键效应因子YAP在机械转导过程中具有强大的生物学相关性，它可以将各种机械输入转化为后续转录反应和一致的生物学功能[36]。YAP与多种类型的细胞的机械感觉都有关，在成纤维细胞和间充质干细胞等细胞类型中都发现YAP在机械转导中发挥作用[37]。虽然牙周膜细胞是混合细胞，但成纤维细胞是其内主要细胞群体，所以Hippo-YAP通路很有可能参与正畸牙移动过程中细胞对机械力的应变。有学者曾发现在大鼠正畸牙移动期间，牙周膜内YAP的活性表达增强[38]。此次研究施加正畸力30 min后即可观察到压力侧细胞核YAP蛋白染色的明显增加，而后随正畸力作用呈现动态变化，这表明正畸牙移动期间机械力引起了压力侧Hippo-YAP通路的变化，此通路接收并转导机械刺激，它可能参与了压力侧细胞将机械刺激转换为生物化学信号的过程。

Hippo-YAP通路与自噬关系密切，它可以通过影响自噬小体与溶酶体这二者的融合来调控自噬通量[39]。在敲低YAP的细胞中或者用Verteporfin(YAP抑制剂)治疗的情况下都发现了自噬的显著抑制[40-41]。研究发现，机械信号作为Hippo-YAP通路的上游输入，自噬则可能是该通路机械转导的下游事件。上游输入控制YAP介导的下游基因转录激活，进而影响自噬体小泡与溶酶体的融合，调节自噬水平[30]。简而言之，机械信号可能通过调控YAP的转录活性来影响自噬通量的变化。此次研究中观察到，正畸力施加后，压力侧牙周膜内细胞的active-YAP的表达增强，与此同时自噬水平也增高。对比牙移动期间压力侧牙周膜中Beclin-1和LC3B与
active-YAP的表达强度变化趋势，发现Beclin-1和LC3B的变化趋势与active-YAP相似，在active-YAP表达增强时可检测到Beclin-1和LC3B的表达增强；同样，active-YAP表达减弱时，它们的表达也降低。通过三者的相关性分析也发现，Beclin-1和LC3B都与active-YAP存在高度相关性。因此，鉴于正畸牙移动期间自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B与active-YAP在压力侧牙周膜内表达变化的高度相关性，以及前人的研究结果，作者推测在正畸牙移动期间Hippo-YAP通路积极介导机械力对细胞自噬的影响，进而影响细胞的生物学活动。

综上所述，Hippo-YAP通路积极参与正畸牙移动，在此过程中积极响应和转导机械刺激，以协助细胞发生应变对机械刺激做出反应，最终实现牙周组织改建及正畸牙移动。在此过程中Hippo-YAP通路和自噬存在一定关联，Hippo-YAP通路可能是自噬的上游调控事件，它可能通过转导机械刺激进而参与调控压力侧牙周膜细胞的自噬。当然，此次研究也有许多不足之处，此次研究仅观察到正畸加力后压力侧牙周组织中Hippo-YAP通路和自噬的变化情况，结合研究和相关性分析推论二者存在关联，其二者之间的具体调控关系仍有待进一步实验验证。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
正畸牙移动：是一个与牙周组织对外界施加机械力的持续生理反应和适应有关的过程。
Hippo-Yes相关蛋白通路：是一种控制器官大小和组织稳态的进化保守的通路。对机械刺激敏感，在机械转导过程中有重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

近年来自噬被发现似乎参与牙周细胞对正畸力的应变；而Hippo-Yes相关蛋白(YAP)通路因参与细胞对机械刺激的响应，在机械转导过程中发挥关键作用，且能够调控自噬，近年来其在关于正畸牙移动的研究中也逐渐受到关注。此次研究通过构建C57BL/6小鼠正畸牙移动模型，设置不同的加力时间，观察各时间点压力侧牙周膜形态改变，并检测压力侧牙周膜细胞的自噬水平以及Hippo-YAP通路的变化。初步探究正畸牙移动期间是否有Hippo-YAP通路参与牙周膜细胞对机械刺激的响应，以及Hippo-YAP通路和自噬之间是否存在关联。

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