2.1   人WJMSC的形态及鉴定结果   WJMSC贴壁生长，呈成纤维样，梭形、不规则形胞体，两端有伪足伸出，有一定折光性，见图1A。流式细胞仪检测第3代WJMSC高表达CD105、CD44、CD90、CD73，不表达CD34、CD45、HLA-DR，见图1B。



2.2   H9C2细胞的形态及建模情况   H9C2细胞贴壁生长，呈椭圆形、三角形、梭形等多形性，两端有角长出，有折光性，予以低氧培养6 h后细胞形态无明显变化，可见少量漂浮细胞，见图2A。H9C2细胞加入WJMSC条件上清后镜下观察细胞生长快，形态无明显变化，见图2B。试剂盒检测显示模型组H9C2细胞上清中乳酸脱氢酶活力为(266.00±28.58) U/L，较常氧对照组[(63.67±9.02) U/L]明显升高(P < 0.001)，表明缺血再灌注损伤模型构建成功；加入常氧WJMSC条件上清后H9C2细胞上清中乳酸脱氢酶活力为(212.3±14.29) U/L，加入低氧WJMSC条件上清后乳酸脱氢酶活力为(160.7±11.06) U/L，较模型组均明显降低(P < 0.05和P < 0.001)，说明加入WJMSC条件上清液后H9C2细胞损伤减少，见图2C。




2.3   WJMSC条件上清对缺血再灌注损伤H9C2细胞凋亡的影响    流式细胞仪检测显示，常氧培养组H9C2细胞凋亡率为(13.26±1.49)%，模型组为(29.62±0.98)%，模型组凋亡率增加了123.39%(P < 0.000 1)；加入条件上清后，常氧条件上清组和低氧条件上清组凋亡率分别为(26.46±0.88)%和(17.18±0.69)%，细胞凋亡减少，且低氧条件上清组减少更明显(P < 0.000 1)，说明WJMSC条件上清能减少再灌注损伤引起的细胞凋亡，且低氧条件上清作用更显著，见图3。



Western blot检测显示，与常氧培养组相比，模型组Bax蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达降低(P < 0.000 1)，说明H9C2细胞凋亡增加；与模型组相比较，常氧条件上清组和低氧条件上清组Bax蛋白表达均降低，低氧条件上清组Bcl-2蛋白表达升高，说明条件上清组细胞凋亡减少；与常氧条件上清组相比，低氧条件上清组Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，说明低氧条件上清组细胞凋亡更少，差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)，见图4。



2.4   WJMSC条件上清对缺血再灌注损伤H9C2细胞自噬的调节   Western blot检测显示，与常氧培养组相比，模型组p62蛋白表达降低，Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高(P < 0.01或P < 0.000 1)，表明经缺氧复氧及无血清处理后H9C2细胞自噬水平升高；与模型组相比，常氧条件上清组、低氧条件上清组p62蛋白表达升高(P < 0.001或P < 0.000 1)，LC3Ⅱ/Ⅰ表达降低(P < 0.05或P < 0.01)，自噬水平降低，而Beclin-1蛋白表达差异无显著性意义；低氧条件上清组较常氧条件上清组p62蛋白表达升高，LC3Ⅱ/Ⅰ表达降低，差异均有显著性意义(P < 0.001或P < 0.05)，见图5。

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急性心肌梗死后及时再灌注是抢救缺血心肌的唯一途径，然而，再灌注挽救心肌的同时，还可能加重心肌损伤，这一病理过程即为心肌缺血再灌注损伤。虽然冠状动脉再灌注治疗的应用越来越多，治疗方案越来越完善，但急性心肌梗死后死亡率和心力衰竭发生率仍然很高，这与再灌注引起心肌细胞死亡和心肌梗死面积扩大有关[1]。因此，采取有效的措施减轻缺血再灌注损伤是急需解决的重要临床问题。人华通胶间充质干细胞(Wharton’s jelly derived mesenchymal stem cell，WJMSC)来源于新生儿脐带内透明的、黏液状的华通胶组织，分离获得过程无创，来源较骨髓间充质干细胞丰富，增殖能力也更强，因而成为一种重要的间充质干细胞[2-3]。WJMSC具有胚胎干细胞和成体干细胞的特性，且免疫原性更低，移植后几乎不引起移植物抗宿主病，也无致畸和致癌性，有大量研究将其用于治疗移植物抗宿主疾病、神经系统疾病、肾脏损伤、肝脏损伤、系统性红斑狼疮等疾病，具有巨大的治疗应用潜力[2，4]。课题组前期已证实人WJMSC经冠状动脉内移植能有效改善心肌梗死后心功能[5]。低氧预处理间充质干细胞可促进其增殖、分泌外泌体、表达缺氧诱导因子1α等[6-7]。目前对低氧预处理WJMSC的条件上清在心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制尚未完全明确。

缺血再灌注损伤主要与再灌注引起的氧化应激、钙超载、pH值改变、炎症、代谢改变、镁、低温、线粒体膜通透性转换孔开放等因素有关[1]，近年来研究发现自噬在心肌缺血再灌注损伤中也发挥重要作用。自噬是真核生物细胞内一种保守的进化机制，将细胞内多余的或有潜在危险的细胞器、蛋白质等(如受损的线粒体、入侵的病原体等)包裹在双膜囊泡内并运送至溶酶体降解，然后循环利用或者排出胞外，对维持正常代谢、损伤修复具有重要作用[8]。在心肌缺血期间，增加细胞的自噬水平可能对细胞具有保护作用，但若自噬过度激活，将导致细胞死亡[8]。

该研究将在前期研究基础上进一步探讨缺氧预处理WJMSC条件上清对体外心肌缺血再灌注损伤模型心肌细胞凋亡及自噬的影响，为临床治疗心肌缺血再灌注损伤提供实验基础及依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   体外细胞实验，采用随机分组对照设计，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2020年12月至2021年11月在解放军总医院第六医学中心心内科实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验细胞   大鼠心肌细胞(H9C2)购买于赛齐(上海)生物工程有限公司；WJMSC来源于解放军总医院第六医学中心心内科实验室，提取制备方法按照课题组前期发表文章[9]，简略步骤如下：取人新鲜脐带，生理盐水漂洗3遍，剪成2.0-3.0 cm小段，剔除脐动脉、脐静脉及脐带外膜，提取脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织，剪成1 mm3及以下块状，清洗后组织贴壁培养，10-14 d后收集贴壁生长的WJMSC，传代培养。

1.3.2   实验试剂与仪器   DMEM/F12培养基、胎牛血清(Gibco)；无外泌体胎牛血清(SBI)；DMEM低糖培养基、0.25%胰酶、磷酸盐缓冲溶液(HyClone)；RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、10孔蛋白电泳预制胶(12%)、ECL Plus超敏发光液(索莱宝)；Annexin-V-FITC/PI凋亡试剂盒(联科生物)；乳酸脱氢酶测定试剂盒(南京建成)；PE-抗人CD105、CD44、CD90、CD73、CD34、CD45、HLA-DR抗体(BioLegend)；兔抗大鼠Bax、Bcl-2抗体、小鼠抗大鼠GAPDH抗体(Proteintech)；兔抗大鼠Beclin-1、p62、LC3抗体(Affinity)；辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；常氧和低氧细胞培养箱(Thermo)、电泳仪(北京六一仪器厂)、酶标仪(Thermo)、电子显微镜(Olympus)、流式细胞仪(Beckman)等。
1.4   实验方法   
1.4.1   人WJMSC的鉴定   取第3代对数生长期的WJMSC，PBS洗涤，离心弃上清，加入100 μL PBS重悬细胞，然后分别加入适量带有荧光标记的抗人CD105、CD44、CD90、CD73、CD34、CD45、HLA-DR抗体，枪头轻柔吹吸混匀，室温避光孵育30 min，PBS洗涤2遍，离心弃上清，500 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。
1.4.2   人WJMSC条件上清的制备   WJMSC的低氧预处理参照已发表文献[10-11]。将WJMSC分别进行常氧和低氧(氧体积分数为1%)培养。取第3代WJMSC接种至T25瓶中，接种密度为5×105/瓶，待细胞生长至80%时，弃DMEM/F12完全培养基，PBS洗涤3遍，加入新鲜含有无外泌体血清的DMEM/F12完全培养基，常氧培养细胞放入正常氧气体积分数的培养箱中培养，低氧培养细胞放入体积分数为1%O2培养箱中培养。24 h后取上清2 000×g离心10 min得到常氧条件上清(N-CM)和低氧条件上清(H-CM)。
1.4.3   H9C2细胞培养和缺血再灌注损伤模型建立   H9C2细胞贴壁生长，每2 d换液，3 d左右传代。H9C2缺血再灌注损伤模型建立按照已发表文献进行[12]。取第3代H9C2细胞以2×105/孔接种至6孔板，待细胞生长至50%-60%，弃DMEM/F12完全培养基，PBS洗涤3遍，加入DMEM低糖基础培养基(不含血清)，置于低氧(氧体积分数为1%)培养箱中，培养6 h后弃培养基，更换为新鲜DMEM/F12完全培养基，放入常氧培养箱中继续培养24 h。
1.4.4   实验分组及处理   实验分为常氧培养组、模型组、常氧条件上清组和低氧条件上清组。常氧培养组H9C2细胞置于正常氧体积分数的培养箱常规培养；模型组H9C2细胞经过缺氧无血清培养6 h后弃培养上清，加入新鲜含无外泌体血清的DMEM/F12完全培养基2 mL；常氧条件上清组H9C2细胞经过缺氧无血清培养6 h后弃培养上清，加入新鲜含无外泌体血清的DMEM/F12完全培养基1 mL和常氧培养的WJMSC条件上清1 mL；低氧条件上清组H9C2细胞经过缺氧无血清培养6 h后弃培养上清，加入新鲜含无外泌体血清的DMEM/F12完全培养基1 mL和低氧培养的WJMSC条件上清1 mL。各组置于常氧培养箱中继续培养24 h。
1.4.5   乳酸脱氢酶测定试剂盒检测H9C2细胞培养上清中乳酸脱氢酶活力   收集各组H9C2细胞培养上清，2 000×g离心10 min，取上清液按照乳酸脱氢酶测定试剂盒说明书检测培养上清中的乳酸脱氢酶活力。
1.4.6   流式细胞仪检测细胞凋亡情况   消化收集干预后的各组H9C2细胞，细胞数量为8×105，预冷PBS洗涤2遍，300×g离心5 min后弃上清，加入500 μL 1×结合溶液轻柔吹散成细胞悬液，每组细胞悬液加入5 μL FITC-Annexin-V和10 μL PI，室温避光孵育5 min，上流式细胞仪检测。
1.4.7   Western blot检测凋亡与自噬相关蛋白的表达   取干预后的各组H9C2细胞，按照每1×106数量的细胞加入250 μL含PMSF的RIPA裂解液，混匀后在4 ℃下静置裂解30 min，在4 ℃下12 000×g离心5 min，取上清用BCA试剂盒测定总蛋白浓度。取总蛋白质量相等的各组细胞裂解液，加入适量蛋白上样缓冲液，沸水浴变性10 min，将变性的蛋白用SDS-PAGE以100 V进行电泳分离约90 min，接着100 V 湿转70 min将蛋白转移至PVDF膜上，然后将PVDF膜浸入5%脱脂牛奶，室温摇床封闭2 h，PBST洗膜5次，每次5 min，加入稀释的抗Bax(1∶10 000)、Bcl-2(1∶1 500)、p62(1∶1 200)、Beclin-1(1∶1 000)、LC3(1∶1 000)和GAPDH(1∶50 000)抗体4 ℃孵育过夜，次日弃一抗稀释液，PBST洗膜5次，每次5 min，加入稀释的二抗溶液室温孵育1 h，PBST洗涤5次，每次5 min，于暗室滴加适量ECL超敏发光液曝光显影。最后使用ImageJ对蛋白条带进行半定量分析，最终结果以目的蛋白与内参的吸光度比值表示。
1.5   主要观察指标   ①H9C2细胞经缺氧复氧及加入条件上清后的细胞形态；②各组H9C2细胞培养上清中乳酸脱氢酶活力；③各组H9C2细胞凋亡率；④各组H9C2细胞内凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和自噬相关蛋白p62、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ的表达。
1.6   统计学分析   采用软件SPSS 25.0、Graphpad prism 9.0、ImageJ分析。所有实验均重复3次。计量资料以x±s表示，采用t检验进行两组间比较、单因素方差分析进行多组间比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

根据《中国心血管健康与疾病报告2020》，中国冠心病患病率仍处于上升阶段，死亡率也呈快速上升趋势，挽救损伤心肌及改善心功能仍然是研究急性心肌梗死的重要课题[13]。WJMSC因其多种优异性被广泛用于心血管疾病的研究[2，4]，如WJMSC移植能改善心脏功能[5]。虽然WJMSC几乎无免疫原性，但其移植入体内仍存在争议，且间充质干细胞移植后其归巢率和存活率低，大部分被肝脏、肾脏代谢。随后研究者们发现间充质干细胞的心脏保护作用主要通过其旁分泌功能发挥作用，如间充质干细胞来源外泌体、细胞因子等[14-15]，其培养上清成为无细胞治疗研究的热点。脂肪间充质干细胞的培养上清可通过降低p53正向凋亡调控因子、纤维相关蛋白ETS-1的表达来减轻缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡和纤维化[16]。羊膜间充质干细胞的条件上清可增加Wnt/β-catenin信号通路活性，抑制肿瘤坏死因子α的表达和增加白细胞介素10的表达以抑制神经炎症，从而保护缺血性脑卒中后神经作用[17]。脂肪间充质干细胞的条件上清可能通过抑制内质网应激，改善肝细胞脂质代谢从而改善肝脏缺血再灌注和肝切除术后的损伤[18]。上述研究均表明间充质干细胞的条件上清能减轻组织损伤，改善脏器功能。该研究显示，与模型组相比，常氧条件上清组H9C2细胞凋亡降低，Western blot检测显示凋亡相关蛋白Bax表达降低，表明WJMSC条件上清可减少缺血再灌注引起的H9C2细胞凋亡，这与LEE等[16]的研究结果一致。

间充质干细胞在体内通常处于体积分数为1%-7%的氧气环境中，心肌梗死区域的氧气体积分数更低，为0.4%-2.3%，甚至为无氧环境[19-20]，因此提高间充质干细胞的低氧耐受性可能提高移植后的治疗效果。研究指出，低氧预处理提高了间充质干细胞移植治疗非人灵长类动物心肌梗死的有效性[21]。低氧预处理WJMSC后其克隆性和增殖能力增强，细胞活性增高，体外迁移能力和蛋白水解酶活性均增强[20，22-23]。低氧处理WJMSC后其旁分泌作用增强，培养上清中成分发生变化[7，24]。研究指出低氧预处理骨髓间充质干细胞的条件上清可促进小胶质细胞向抗炎症型极化，减轻缺血再灌注引起的细胞损伤[25]。低氧处理间充质干细胞来源外泌体可通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路减轻缺氧无血清培养的H9C2细胞凋亡[7]。在该研究中，与常氧条件上清组相比，低氧条件上清组H9C2细胞凋亡进一步降低，Western blot检测显示凋亡相关蛋白Bax表达降低，Bcl-2表达升高，差异有显著性意义，表明经低氧处理后，WJMSC条件上清能更显著降低再灌注损伤引起的H9C2细胞凋亡。

自噬过程包括诱导自噬、自噬小体的组装和形成、自噬小体与溶酶体膜对接和融合、自噬小体内内容物的降解和循环[26]。自噬常用的标志物有Beclin-1、LC3、p62、ULK1、WIPI1、WIPI2、ATG5等[27]。Beclin-1蛋白由BECN1基因编码，是一种启动自噬过程所需的蛋白，在自噬泡形成的起始阶段起核心作用[28]。LC3是目前使用最广泛的自噬小体标志物。LC3蛋白经Atg4剪切后产生胞浆型LC3Ⅰ，LC3Ⅰ经泛素样体系修饰加工，与磷脂酰乙醇胺偶联，形成定位于自噬小体膜上的膜型LC3Ⅱ，LC3Ⅱ的数量反映了自噬小体的数量和自噬相关结构[28-30]。自噬是一个动态过程，某一时间点LC3Ⅱ的量并不一定能估计自噬活性，LC3 Ⅱ/Ⅰ比例的升高提示自噬小体积累，可以此估计自噬水平高低[31]。p62是一种选择性的运输蛋白，与LC3结合，参与转运自噬小体到溶酶体，并被自噬溶酶体中的蛋白水解酶降解，自噬损伤通常伴随有p62蛋白的积累[29-30]。

自噬对心脏具有重要的保护作用，可降低心脏缺血时的损伤，还能减少缺血后心脏重构，并通过减少错误折叠蛋白积累、线粒体功能障碍和氧化应激使心脏适应超负荷等应激[8]。自噬可由多种应激因素激活，如缺氧、氧化应激、内质网应激、代谢异常及基因突变等[32]，而自噬的过度激活可促进细胞死亡。如有研究指出间充质干细胞来源外泌体中的miR-143-3p可抑制心脏缺血再灌注损伤引起的过度自噬，减轻细胞凋亡，从而保护心功能[33]。该研究中，与常氧培养组相比，模型组Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高，p62表达降低，表明经缺氧复氧无血清处理后H9C2细胞自噬水平升高；与模型组相比，常氧条件上清组、低氧条件上清组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ降低，p62表达升高，低氧条件上清组Beclin-1降低，表明WJMSC条件上清有效抑制了再灌注损伤引起的细胞自噬水平升高；与常氧条件上清组相比，低氧条件上清组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ降低，p62表达升高，且差异有显著性意义，表明低氧WJMSC条件上清对自噬的抑制作用更加显著。

该研究中，常氧条件上清组、低氧条件上清组H9C2细胞凋亡较模型组减少，自噬水平降低，说明WJMSC条件上清可能通过抑制再灌注引起的自噬水平升高来减少H9C2细胞凋亡；低氧条件上清组H9C2细胞凋亡和自噬水平较常氧条件上清组进一步降低，说明低氧WJMSC条件上清对自噬水平的抑制作用更强。

综上所述，低氧预处理WJMSC条件上清可减轻心脏缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡，这种作用可能与低氧WJMSC条件上清抑制缺血再灌注损伤引起的自噬水平升高有关。该研究为心肌缺血再灌注损伤提供了可能的治疗方法及实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
华通胶间充质干细胞：来源于新生儿脐带内透明的、黏液状的华通胶组织，是一种比成体骨髓间充质干细胞更原始的间充质干细胞，同样具有间充质干细胞的双向调节免疫和炎症反应、抗氧化应激、多向分化、抗凋亡等特性，还具有免疫原性更低、来源广泛等特点。
缺血再灌注损伤：心肌、肝脏、肾脏等脏器或组织在缺血以后再通血管使脏器重新获得血供时，脏器原有损伤加重或者受到新的损伤，这种现象称为缺血再灌注损伤，缺血再灌注损伤使再灌注的治疗效果降低，给治疗带来新的困难。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

目前关于低氧预处理华通胶间充质干细胞的条件上清对心脏缺血再灌注损伤的研究较少，但有较多研究从常氧培养的间充质干细胞培养上清提取外泌体，研究外泌体对心肌缺血再灌注损伤的作用及机制。华通胶间充质干细胞经低氧预处理后其条件上清不仅表现为外泌体数量以及内容物的变化，同时其旁分泌的细胞因子种类及含量也发生变化，且有相关研究表明某些细胞因子在一些疾病模型中能发挥重要作用，因此低氧预处理华通胶间充质干细胞的条件上清仍具有研究意义。低氧预处理华通胶间充质干细胞的条件上清对心脏缺血再灌注损伤的作用机制尚不清晰，是重要的研究方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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