1.1 设计 体外细胞观察对比实验，采用单因素方差分析进行多组间比较，组间两两比较采用LSD-t检验。
1.2 时间及地点 实验于2020年9月至2021年6月在广西中医药大学科学实验中心进行，细胞实验于分子生物学实验室完成，动物实验于动物实验中心进行，实验许可证编号：SYXK(桂)2019-0001。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞株和动物 HepG2细胞(iCell-h092)提供商为赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。含药血清制备所需雌性SPF级Wistar大鼠32只，6-8周龄，体质量160-250 g，均购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证编号：SCXK(湘)2016-0002。实验方案经广西中医药大学动物伦理委员会批准(动物伦理审查号：2019010)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 实验药物 江阴天江药业有限公司生产的免煎中药配方颗粒进行药物制备，敷和备化方由17味中草药组成，其中白花蛇舌草30 g，茵陈蒿30 g，牛膝30 g，鳖甲24 g，茯苓15 g，白术15 g，制香附12 g，柴胡12 g，杭白芍12 g，制半夏12 g，当归12 g，莪术12 g，西洋参10 g，三七10 g，枳实10 g，生姜10 g，甘草6 g。将所有中药颗粒充分加入ddH2O进行溶解后于广西中医药大学第一附属医院制剂室使用120目网筛将药液过滤。过滤完成后蒸馏浓缩，将药物浓缩成1 g/mL含药液，高温灭菌法灭菌后进行封装，于4 ℃环境中保存。雷帕霉素(美国Sigma-Aldrich公司，货号：D8371)。
1.3.3 实验试剂 胰蛋白酶-EDTA消化液、青链霉素混合液(100×)、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PBS、RIPA裂解液(北京索莱宝科技有限公司，批号分别为 T1300、P1400、PH0326、sv300160.03、P0013B)；乳铁蛋白、N2、B27、DMEM(美国 Gibco 公司，批号分别为yb-E12455、17502048、17504-004、MD202)；DMEM/F12(中国武汉BOSTER公司，批号：11330032)；表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(美国PEPROTECH公司，批号分别为HZ-4567R、Rs-6706R)；PE MOUSE ANTI-HUMAN CD133(北京BD Biosciences公司，批号：12-1331-82)；CD133 microbead kit、MACS Buffer(德国美天旎生物技术公司，批号分别为130-097-049、130-091-221)；CCK-8试剂盒(中国上海东仁化学科技有限公司，批号：ab228554)；Nuclease-Free Water(莫纳生物科技有限公司，批号：AM9932)；山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(美国Sigma-Aldrich公司，批号分别为1010-04、12-448)；脱脂奶粉(中国光明牌， 批号：080922 DN7)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、SDS-PAGE上样缓冲液、干样细胞消化液、ECL发光液 (碧云天上海生物技术有限公司，批号分别为 P1200、YT050-CWN、MX2001、PH0353)；β-肌动蛋白、兔抗PI3K单克隆抗体、兔抗AKT单克隆抗体、兔抗p-AKT单克隆抗体、兔抗mTOR单克隆抗体、兔抗p-mTOR单克隆抗体、兔抗LC3单克隆抗体、兔抗LC3-Ⅱ单克隆抗体(英国Abcam公司，批号分别为：ab8226、ab278545、ab38449、ab8805、ab32028、ab32028、ab128025、ab192890)；引物(中国武汉金开瑞公司，批号：D3118)；FastKing RT Kit、SuperReal PreMix Plus(TIANGE，批号分别为 FP205、KR116-02)；Scientific TRIzolTM Reagent (Thermo 中国公司，批号：15596026)。
1.3.4 实验仪器 BBS-H1500型超净工作台(中国山东博科生物产业有限公司)；MCO175M型CO2细胞培养箱(日本Sanyo公司)；DMi1型倒置生物显微镜(德国Leica公司)；高压蒸汽灭菌锅(中国上海三申医疗器械厂)；电泳仪、全波长酶标仪、CL10型离心机、Multiskan FC型酶标仪、磁力搅拌器(美国Thermo 公司)；制冰机(美国Bio-Rad公司)；PCR循环仪、GE多功能成像仪(美国通用)；CytoFLEX流式细胞仪(美国贝克曼公司)；水平摇床(北京市六一仪器厂)；170-4158型转膜仪(美国Bio-Rad公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 HepG2 细胞培养 HepG2细胞株采用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养基，在CO2培养箱中孵育，细胞融合至85%左右，加入0.25%胰酶消化，每3 d以1∶3的比例传代，传代后取对数生长期的细胞用于后续实验。
1.4.2 CD133+ HepG2 肝癌干细胞的分离、纯化
(1)干样细胞诱导：配备干样细胞培养液，包括成纤维细胞生长因子(20 μg/L)+人白血病抑制因子(10 μg/L)+表皮生长因子(20 μg/L)+DMEM/F12+ B27(1×)+N2(1×)。取对数生长期的HepG2细胞，加入PBS充分洗涤3次后，加入1 mL 0.25%胰酶+0.02%EDTA干样细胞消化液(0.25%胰酶+0.02%EDTA)，充分消化后加入DMEM终止消化，在离心机上以1 000 r/min、4 ℃低温离心5 min，离心后吸弃上清液，于低黏度6孔板中加入细胞(2×104个/孔)进行培养，待细胞总数达108个，进行磁珠分选。
(2)磁珠分选：取出细胞加入1 mL干样细胞消化液进行消化，于离心机上以1 000 r/min、4 ℃低温条件离心5 min收集细胞沉淀，加入300 μL的buffer缓冲液混匀后重悬。低黏度6孔板每孔加入100个细胞，于避光4 ℃环境下加入FCR Blocking Reagent 100 μL、CD133 Micro Beads 100 μL孵育30 min。置LS柱于MACS磁选机，以buffer液冲洗干净，加入细胞悬液进行缓慢滴落，收集滴落细胞后以2 mL的buffer液冲洗干净。将滴落的细胞悬液于离心机上以1 000 r/min、4 ℃低温条件离心5 min，离心后PBS清洗2遍。将清洗后的细胞用DMEM/F12培养基(不含酚红)进行悬浮培养6 d，培养后于镜下观察细胞形态，离心、收集干样细胞球，收集后胰酶消化并重悬，重悬静置5 min后将细胞球反复吹打至单个细胞，再次以PBS清洗后进行离心。离心后收集细胞沉淀，将细胞重悬培养于干细胞专用培养基，于6孔悬浮细胞培养板中按1∶2比例进行传代。细胞培养21 d后采用流式细胞术鉴定CD133+HepG2细胞纯度。
(3)流式鉴定：取出细胞，1 000 r/min、4 ℃离心5 min，加1 mL的PBS重悬细胞，加10 μL细胞悬液于计数板A孔，计数，总数超过106 即可下一步实验。按照实验要求将细胞分为空白对照管、同型对照管、实验管，每管加入100 μL细胞悬液，实验管、空白对照管、同型对照组管分别加入PE CD133抗体、染色剂、同型对照抗体，于4 ℃环境下避光反应30 min，反应后离心收集细胞沉淀，PBS反复清洗2遍，再次离心后加入PBS对细胞进行重悬，重悬后使用流式细胞仪检测CD133阳性表达率。
1.4.3 敷和备化方含药血清制备及保存 严格按照中药复方血清药理学的研究方法进行含药血清的制备。将大鼠随机分为空白组和中药组，每组16只，分为4笼饲养，参考成人(60 kg)的临床计量，大鼠按100 g/mL的药量进行灌胃，以同等标准用生理盐水对空白组大鼠进行灌胃，连续灌胃1周，1次/d，末次灌胃2 h后腹主动脉采血。收集血液后静置4 h，300 r/min离心15 min收集血清。将血清于56 ℃水浴锅水浴30 min灭活。灭活后于无菌操作台以0.22 μm微孔滤膜注射滤器对血清进行过滤、灭菌，用无菌EP管分装敷和备化方含药血清和正常大鼠血清，置-20 ℃保存备用，并应用色谱与质谱联用技术对敷和备化方含药血清进行鉴定。
1.4.4 敷和备化方含药血清最佳干预浓度测定 参照前期研究结果和相应中药含药血清细胞实验规范，配制体积分数为2%，4%，8%，16%含药血清以备后续使用。取对数生长期第2代或第3代CD133+HepG2细胞，制备细胞悬液，按105个/孔的密度接种于96孔板，每孔1 mL细胞悬液，每组6个复孔，于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，镜下观察细胞生长状况，加入体积分数为2%，4%，8%，16%含药血清，每孔1 mL，对照组加体积分数为10%的正常大鼠血清，每孔1 mL，于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养24，48，72，96 h，取出孔板，吸弃旧的培养液，PBS洗涤2次，加入CCK-8溶液，每孔10 μL，于培养箱中培养1-4 h，用酶标仪检测波长450 nm处吸光度值，计算敷和备化方含药血清对CD133+HepG2细胞的抑制率，抑制率=(对照孔吸光度值-试验孔吸光度值)/(对照孔吸光度值-空白孔吸光度值)×100%，筛选出最佳体积分数的含药血清用于后续实验。
1.4.5 流式细胞术检测各组CD133+HepG2细胞百分比 将第2代或第3代CD133+ HepG2肝癌干细胞分为血清对照组、空白对照组、雷帕霉素组和敷和备化方组，将细胞以每孔106个接种于低黏度6孔板中，血清对照组加入2 mL含体积分数为16%正常大鼠血清的DMEM/F12培养基，空白对照组加入等量无血清DMEM/F12培养基，雷帕霉素组加入2 mL含0.05%雷帕霉素的DMEM/F12培养基，敷和备化方组加入2 mL含体积分数为16%敷和备化方含药血清的DMEM/F12培养基，于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养6 d后进行流式鉴定。倒置显微镜下观察细胞形态，采用细胞计数器进行计数，待细胞总数超过106进行下一步实验。每孔吸取100 μL细胞悬液分装至无菌EP管中，分别加入CD133抗体、染色剂4 ℃避光反应30 min，离心收集细胞进行重悬后于流式细胞仪检测。
1.4.6 RT-PCR法检测各组细胞中PI3K、AKT、mTOR、LC3-Ⅱ、Beclin-1的mRNA表达 将第2代或第3代CD133+HepG2肝癌干细胞分为血清对照组、空白对照组、雷帕霉素组和敷和备化方组，将细胞以每孔106个接种于低黏度6孔板中，血清对照组加入2 mL含体积分数为16%正常大鼠血清的DMEM/F12培养基，空白对照组加入等量无血清DMEM/F12培养基，雷帕霉素组加入2 mL含0.05%雷帕霉素的DMEM/F12培养基，敷和备化方组加入2 mL含体积分数为16%敷和备化方含药血清的DMEM/F12培养基，于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养6 d后提取RNA，反转录为cDNA，RT-PCR检测各组细胞PI3K、AKT、mTOR、LC3-Ⅱ和Beclin-1的mRNA表达水平，严格按说明书操作。引物序列见表1。
1.4.7 Western blot 法检测各组细胞中PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、LC3-Ⅱ蛋白表达水平 将第2代或第3代处于对数生长期CD133+ HepG2细胞分为血清对照组、空白对照组、雷帕霉素组和敷和备化方组，将细胞以每孔106个接种于低黏度6孔板中，血清对照组加入2 mL含体积分数为16%正常大鼠血清的DMEM/F12培养基，空白对照组加入等量无血清DMEM/F12培养基，雷帕霉素组加入 2 mL含0.05%雷帕霉素的DMEM/F12培养基，敷和备化方组加入2 mL含体积分数为16%敷和备化方含药血清的DMEM/F12培养基，37 ℃、体积分数为5%CO2条件下继续培养6 d后进行Western blot检测。离心收集细胞，加入RIPA裂解液充分反应，离心取上清进行BCA蛋白定量。每孔取等量蛋白加入到8% SDS-PAGE胶中进行电泳分离，再将分离后的蛋白以300 mA，1.5 h的转膜条件转膜至PVDF膜；PBS漂洗3次，将膜在室温条件下用5%脱脂奶粉封闭2 h，PBS洗涤5 min；加入PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、LC3-Ⅱ、β-actin一抗(1∶300)室温孵育2 h，PBS洗涤3次，每次5 min，将膜置于双色红外激光发光显色仪中进行发光检测，凝胶成像系统拍照，用Quantity One软件测量各蛋白条带平均吸光度值。
1.4.8 免疫荧光法检测各组细胞中LC3、LC3-Ⅱ的表达 将处于对数生长期第2代或第3代CD133+HepG2细胞分为血清对照组、空白对照组、雷帕霉素组和敷和备化方组，将细胞以每孔106个接种于低黏度6孔板中，血清对照组加入2 mL含体积分数为16%正常大鼠血清的DMEM/F12培养基，空白对照组加入等量无血清DMEM/F12培养基，雷帕霉素组加入2 mL含0.05%雷帕霉素的DMEM/F12培养基，敷和备化方组加入2 mL含体积分数为16%敷和备化方含药血清的DMEM/F12培养基，于37 ℃、体积分数为5%CO2条件下继续培养6 d后进行免疫荧光检测。将各组CD133+ HepG2细胞以每孔106个接种于6孔板爬片，37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中孵育24 h，取出6孔板，弃培养基，PBS清洗3次，加入40 g/L多聚甲醛2 mL，常温固定20 min，自然干燥10 min，PBS洗3次，每次5 min，0.2% Triton X-100透膜，室温放置20 min，体积分数为10%羊血清室温封闭30 min，PBS洗3次，每次5 min，滴加LC3、LC3-Ⅱ一抗，4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，每次5 min，滴加二抗，避光室温孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min，滴加DAPI(0.5 mg/L)避光孵育5 min，PBS洗涤3 次，树脂封固剂封固、烘干，爬片于荧光显微镜下观察并采集图像。
1.5 主要观察指标 ①CD133+HepG2细胞增殖水平；②CD133+HepG2细胞百分比；③CD133+HepG2细胞中PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、LC3-Ⅱ的蛋白表达水平；④CD133+HepG2细胞中PI3K、AKT、mTOR、LC3-Ⅱ和Beclin-1的mRNA表达水平；⑤CD133+HepG2细胞中LC3、LC3-Ⅱ免疫荧光表达水平。
1.6 统计学分析 所有实验数据以EXCEL 2013版录入，采用SPSS 25.0软件作统计学数据分析，用GraphPad Prism 8软件统计作图。所有实验数据结果以x±s表示，采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)进行多组间比较比较，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准设定为 α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。
