股骨头坏死组第2周时的典型股骨头病理切片见图1，从切片上可清晰观察到骨坏死，可见骨小梁结构极其紊乱，分布稀疏、较正常骨小梁变细，有的已发生断裂，甚至出现碎片；造血细胞数量减少；成骨细胞排列不规则；切片中可观察到大量的空缺骨陷窝；骨髓内的脂肪细胞体积较大，有的甚至融合在一起，形成泡状表现。3-甲基腺嘌呤组第2周时股骨头病理切片上骨坏死情况较股骨头坏死组轻。



2.3   实时荧光定量PCR检测MAP1LC3 mRNA在组织中的表达    应用实时荧光定量PCR检测MAP1LC3 mRNA的表达，MAP1LC3主要表达在细胞浆，结果显示：在实验的前3周，股骨头坏死组标本内MAP1LC3 mRNA的表达均较对照组增高；但随着用药时间的延长，股骨头坏死组MAP1LC3 mRNA表达量逐渐下降，而对照组MAP1LC3 mRNA表达量略有升高；至第4周股骨头坏死组MAP1LC3 mRNA表达量低于对照组；3-甲基腺嘌呤组MAP1LC3 mRNA表达量均低于股骨头坏死组。采用单因素方差分析检验不同时间段3组标本中MAP1LC3 mRNA表达差异均有显著性意义(P < 0.05)，采用t检验进行各组之间的比较，第1周对照组与3-甲基腺嘌呤组之间差异无显著性意义，第3周对照组与股骨头坏死组之间差异无显著性意义，其余各组间差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表2及图2。







2.4   Western blot 检测骨组织中MAP1LC3蛋白表达水平   提取模型组织中蛋白适量，选取参照物：内参(β-actin)，定量分析蛋白表达，结果见图3。计算灰度值比值=灰度值MAP1LC3 /灰度值β-actin，结果见图4，进行单因素方差分析，结果见表3。

在实验前2周，3组标本中MAP1LC3蛋白表达水平差异有显著性意义(P < 0.05)，而在实验的后2周3组标本之间结果差异无显著性意义(P > 0.05)。对结果进行t检验发现，第1周3组之间结果差异均有显著性意义；对照组与股骨头坏死组之间MAP1LC3蛋白表达差异有显著性意义(P=0.064，P < 0.05)，股骨头坏死组MAP1LC3蛋白表达明显增多；股骨头坏死组与3-甲基腺嘌呤组MAP1LC3蛋白表达差异也有显著性意义(P=0.016，P < 0.05)，3-甲基腺嘌呤组标本内MAP1LC3蛋白表达下降，且接近对照组(P=0.534，P > 0.05)。在实验第2周该趋势表现结果与第1周相似，股骨头坏死组MAP1LC3蛋白表达明显增多(P=0.072，P < 0.05)，3-甲基腺嘌呤组MAP1LC3蛋白表达明显下降(P=0.048，P < 0.05)，且接近对照组(P=1.582，P > 0.05)。在实验的后2周，3组间MAP1LC3蛋白表达水平相比差异均无显著性意义(P > 0.05)。

激素性股骨头缺血坏死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH)的研究至今仍是很棘手的难题，关于其发病机制仍存在争议，但对于自噬型程序性细胞死亡在SANFH中的作用机制尚未完全明确。就SANFH早期骨细胞、成骨细胞的病理改变及其潜在原因，特别是细胞的死亡方式及其可逆转因素一直未能明确，至今仍有许多质疑[1-5]。近年，研究者更多倾向于关注基因表达与调控在疾病中的作用[6-8]，而程序性细胞死亡(凋亡型与自噬型)理论亦逐渐受到重视[6-10]。已有学者开始对骨细胞、成骨细胞凋亡型程序性细胞死亡在SANFH中的作用进行了初步探讨，对其发病机制有了新的认识[11]。对于自噬型程序性细胞死亡在SANFH中的作用，目前已有部分报道，研究的重点内容是寻找及明确其发病机制。近年来，相关工作更多的集中于促血管生长因子及其差异表达基因的研究。作者的前期研究结果表明，激素对股骨头节段血管中血小板衍生生长因子与血管内皮生长因子的超强抑制而引起的血供中断与SANFH存在关联性，诸多促血管生长因子及差异表达基因的调控在SANFH中发挥着重要作用[12-16]。

研究表明，自噬型细胞死亡的发生机制主要与激素、饥饿、缺血缺氧、氧化应激、钙稳态失衡、线粒体功能障碍等有关[17]。如果自噬调控机制出现失调，会出现如肿瘤、炎症性疾病、自身免疫病等多种疾病，并在其发生过程中观察到细胞过度自噬型死亡。CARPENTER等[18]通过研究证实，皮肤水痘带状疱疹病毒感染与内质网应激相关，最终导致LC3高表达与细胞自噬型死亡发生。研究结果表明，编码自噬相关蛋白的重要基因有很多，其中微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3)是编码自噬相关蛋白的重要基因[17]，其编码的蛋白定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，它是在2条泛素样蛋白的加工修饰过程中形成自噬体。HERBST等[19]在研究移植物抗宿主病时发现，MAP1LC3基因高表达，进而引起细胞自噬，而3-甲基腺嘌呤能够抑制细胞自噬发生。

此次研究采用建立SANFH动物模型的方法进行实验，在使用激素诱导出SANFH动物模型的基础上，光学显微镜观察各组组织细胞缺血坏死情况；利用实时荧光定量PCR法检测骨细胞、成骨细胞中MAP1LC3 mRNA；Western blot定量检测MAP1LC3；对模型组动物肌肉注射3-甲基腺嘌呤，观察其是否可以抑制骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡，以及对MAP1LC3 mRNA与蛋白表达的影响，探索SANFH发病机制的新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程 

1.1   设计   随机对照动物实验，计数资料采用χ2检验，组间比较独立样本t检验。
1.2   时间及地点   实验于2017年6月至2018年6月在内蒙古医科大学分子病理实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   健康5月龄新西兰大耳白兔36只，体质量2.0-2.5 kg，雌雄不限，标准饮食，单笼饲养，购自陕西省西安市迪乐普生物资源开发有限公司，合格证编号：61001600000083。实验方案经内蒙古医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号：2013086。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2   实验用主要试剂   MAP1LC3及内参β-actin引物均购自于生工生物工程(上海)股份有限公司；实时荧光定量PCR相关试剂盒均购自于天根生化科技(北京)有限公司；MAP1LC3兔单克隆抗体、内参β-actin兔单克隆抗体、荧光二抗均购自于Cell Signaling公司；Western blot相关试剂盒均购自于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。生理盐水由内蒙古医科大学第二附属医院提供，甲基强的松龙购自法玛西亚普强公司，3-甲基腺嘌呤购自Selleck公司。
1.4   实验方法   
1.4.1   造模及取材   将36只新西兰大耳白兔按雌雄随机分配分成3组，每组12只。对照组单纯肌肉注射生理盐水，2 mL/只，每周1次，共4次；股骨头坏死组肌肉注射甲基强的松龙4 mg/kg，每周1次，共4次；3-甲基腺嘌呤组，肌肉注射甲基强的松龙4 mg/kg，之后随即肌肉注射3-甲基腺嘌呤2 μL/只，每周1次，共4次。

在实验第1，2，3，4周麻醉后采用耳缘静脉注射空气栓塞法处死，每组每次处死3只。半无菌条件下取出双侧后肢的股骨头：左侧股骨头固定在体积分数40%的中性甲醛溶液中，苏木精-伊红染色后光镜观察组织学表现；右侧股骨头标本置于液氮中保存，进行MAP1LC3的mRNA与蛋白表达、自噬型细胞死亡检测。 
1.4.2   光镜下组织形态学观察   取固定在体积分数40%中性甲醛溶液中的左侧股骨头，在10%EDTA脱钙液中微波脱钙，梯度乙醇脱水，石蜡包埋标本组织块，制成切片，厚4 μm，苏木精-伊红染色，中性树胶封固制成切片。首先在400倍率下观察空缺骨陷窝形态，并留取图像，在100倍率下，随机选5个视野，每个视野依次计数50个骨陷窝，数出空缺骨陷窝数，求出空缺骨陷窝占骨陷窝的百分数，取5组数据的均值，即为该切片的空缺骨陷窝率。每个标本随机选取3张切片计算空骨陷窝率，取各组3个标本所有切片的平均值为该组的空骨陷窝率。 
1.4.3   实时荧光定量PCR检测标本内MAP1LC3 mRNA水平   从液氮中取出冻存的股骨头组织，电子天平迅速称取50 mg组织加入1 mL TRNzol于6孔板的每孔中，用匀浆仪进行匀浆处理后室温放置5 min至其完全裂解；将匀浆液置于12 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清液移入另一新的1.5 mL EP管中；将0.2 mL氯仿加入，将管盖盖好，震荡、摇晃，然后放在冰上孵育5 min；然后以1 000 r/min 4 ℃离心15 min，将上清液转移到另一新的1.5 mL EP管中；再加入等体积异丙醇，混匀后冰上孵育10 min；然后以12 000 r/min 4 ℃离心5 min，倒掉上清液；加入1 mL 体积分数75%的无水乙醇洗涤沉淀，保存在4 ℃环境下，震荡，使其混合充分；7 500 r/min 4 ℃离心5 min，抽掉上清液，此时可见白色沉淀附着于管底；室温放置晾干，约15 min；加入80 μL RNase-Free ddH2O，在EP管中溶解RNA(-80 ℃冰箱)保存；在55-60 ℃下孵育3-5 min，使RNA溶解充分。

MAP1LC3的上游引物序列为5'-GAT GTC CGA CTT ATT CGA GAG C-3'，下游引物序列为5'-TTG AGC TGT AAG CGC CTT CTA-3'，目的片段为363 bp；内参β-Actin的上游引物序列为5'-ACT CGT CAT ACT CCT GCT-3'，下游引物序列为5'-GAA ACT ACC TTC AAC TC-3'，目的片段132 bp。

将获得的RNA溶液在冰上反转录为cDNA，将所得的cDNA溶液与引物溶液混合，配置反应体系，移入八连管，放入ABI 7500 Fast荧光定量PCR仪，按照说明设置反应程序，数据用PCR仪原机软件进行分析。 
1.4.4   Western blot检测MAP1LC3蛋白表达水平   将储存在液氮中的右侧股骨头取出后用电子天平称质量，放入研磨器中，然后加入少量液氮研磨股骨头组织，用预冷的刮勺将研碎后的骨组织刮入离心管中，每加入1 g/mL的骨组织，就要同时加入10 g/mL组织蛋白提取试剂(含有蛋白酶抑制剂)，然后放在冰上裂解30 min，后1 000 r/min 4 ℃离心15 min，总蛋白在上清液中，所以收集上清液，即可测定蛋白浓度(BCA法)。制备10%分离胶，将蛋白样本和蛋白上样缓冲液混合，加入上样孔内，80 V电泳1 h，160 V电泳1.5 h，将NC膜与分离胶紧贴，135 mA转膜1.5 h，转好的NC膜在稀释的内参蛋白和MAP1LC3蛋白一抗(1∶1 000)溶液中4 ℃孵育过夜，在稀释的荧光二抗(1∶500)溶液中孵育1 h，放入ODESSY荧光红外扫描系统中检测目的蛋白的表达情况。分别测量每个标本中内参蛋白和MAP1LC3蛋白条带的灰度值，计算每个标本灰度值比值=灰度值MAP1LC3/灰度值β-actin，取3个标本灰度值比值平均值为该组的平均灰度值比值。 
1.5   主要观察指标   ①光镜下组织形态学观察；②荧光定量PCR检测组织中MAP1LC3 mRNA表达水平；③Western blot检测标本组织中MAP1LC3蛋白的表达水平。
1.6   统计学分析   文章统计学方法已经内蒙古医科大学第二附属医院赵振群专家审核。应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，实验数据以x±s表示，计数资料采用χ2检验，组间比较独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

短期大量或长期糖皮质激素的使用可以引起SANFH，通过很多方式破坏股骨头血液供应，使股骨头骨细胞和骨髓成分变性、坏死，最终导致股骨头的正常结构发生变化，晚期多可伴有骨小梁压缩断裂，破坏髋关节功能，最终给患者正常生活带来不可逆的损伤，其特点是致残率高、预后较差，股骨头缺血坏死的发病机制至今仍没有统一的定论。近年研究发现，细胞自噬既参与了人体多种正常的生理过程，同时也与多种病理过程息息相关，包括细胞的衰亡、胰岛素的抵抗、癌症及其他疾病的发生发展等，类似于一把双刃剑的存在，一定强度范围内的细胞自噬在维持细胞内环境稳态、细胞存活方面都起着至关重要的作用[20]。有学者认为细胞自噬不仅是必要的，并且至少在某些情况下，也足以延长寿命。细胞自噬是一种涉及细胞内组分自身降解的重要过程，调节方式多样，对于其检测和监测方法仍没有统一的定论[21]。研究发现，自噬可激活成骨细胞的分化过程[22]，当缺乏溶酶体硫酸脂酶时，可激活自噬致使骨质发育异常，另外，自噬也可参与保护成熟骨骼的形成过程[23]。大剂量糖皮质激素可增强破骨细胞的分化，致使其对骨的吸收活性增强，破坏正常骨细胞[24]，糖皮质激素可打破骨重塑平衡，既促进破骨细胞的分化，也加强了对骨质的吸收，从而阻碍骨的修复和重建。在股骨头缺血坏死的发病过程中，股骨头局部的缺血缺氧改变可引起骨细胞、成骨细胞发生一系列病理变化，因此自噬与SANFH之间也存在着紧密的联系。

MAP1LC3是哺乳动物细胞中参与自噬的特异性基因[25]，通过与Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶形成复合体来调节其他自噬相关基因编码蛋白，然后在自噬前体结构中定位，调节自噬活性。IDIKIO等[26]研究发现，肝癌与前列腺癌组织中MAP1LC3基因mRNA表达水平明显增高，并可能因其可调控细胞自噬而成为癌症治疗的靶点。EZAKI等[27]通过动物实验研究发现，胰岛素通过调控肝细胞自噬而促进糖异生，从而维持正常血糖，同时MAP1LC3也在变化，可通过检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值来说明自噬变化程度。GAMBERI等[28]通过实验发现，用脂联素基因敲除小鼠的骨骼肌LC3Ⅱ表达，可使LC3 Ⅱ表达下降，说明LC3Ⅱ的表达升降与细胞自噬存在紧密关联。学者们通过实验认为3-甲基腺嘌呤是Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(hVps30)的抑制剂，可通过切断自噬泡与溶酶体的结合，从而阻止自噬体形成过程，通过调节细胞自噬可以治疗心血管疾病。总之，自噬受很多因素的调控，激素、缺血缺氧、氧化应激、线粒体损伤等均可引起细胞MAP1LC3基因表达增强，从而导致细胞过度的自噬型死亡，进而引起疾病的发生发展，而这一过程受到3-甲基腺嘌呤的调控。作者推测，在SANFH模型中，由于应用激素及其导致的细胞缺血缺氧极有可能引起骨细胞与成骨细胞某种形式的自噬，3-甲基腺嘌呤可以阻断形成自噬体，进而干扰MAP1LC3蛋白活性，达到抑制自噬型细胞死亡的目的。针对这些问题，此次研究通过激素诱导兔股骨头坏死，诱导出股骨头骨细胞、成骨细胞自噬的发生，并使用3-甲基腺嘌呤自噬抑制剂抑制自噬，光镜下计数各组空缺骨陷窝，应用实时荧光定量PCR检测MAP1LC3 mRNA的表达，应用Western blot 免疫印迹法检测骨细胞、成骨细胞中MAP1LC3蛋白的表达量。

结果发现，3组股骨头的大体形态无明显差异；应用光学显微镜观察激素诱导股骨头坏死股骨头病理切片可见典型的骨坏死，骨小梁结构不规则，骨小梁变得细而稀，坏死主要集中在股骨头软骨下，骨陷窝出现细胞空缺，骨髓内脂肪细胞体积增大变形，骨髓内脂肪细胞核消失，有的破裂融合成脂肪囊泡。LC3是哺乳动物参与自噬的特异性基因，包括LC3Ⅰ(18 kD)和LC3Ⅱ(16 kD)2种形式。由于细胞中LC3的含量和自噬泡的数目呈正相关关系，因此它可作为检测自噬的标记物。当股骨头骨细胞因激素诱导引起自噬时，细胞内LC3的总含量会明显增多。实时荧光定量PCR实验结果显示：MAP1LC3在激素诱导股骨头缺血坏死标本中的表达程度要显著强于对照组。作为细胞自噬发生的特异性标志物，MAP1LC3在激素诱导组中的表达显著强于对照组，说明激素诱导股骨头缺血坏死中细胞自噬的发生与发展是显著增强的，进一步表明MAP1LC3 mRNA的高表达状态，可能存在自噬型细胞死亡。随着激素用量的继续增加，可能出现股骨头完全坏死的情况，致使在第4周中出现激素诱导股骨头坏死组MAP1LC3 mRNA表达量低于对照组的情况，3-甲基腺嘌呤治疗组中MAP1LC3 mRNA表达量一直较低，表明3-甲基腺嘌呤在该自噬型细胞死亡过程中可能起到抑制作用。Western blot 免疫印迹法蛋白分析实验鉴定骨细胞中MAP1LC3蛋白表达量结果显示：与3-甲基腺嘌呤治疗组相比，激素诱导组中MAP1LC3蛋白表达水平较高，3-甲基腺嘌呤治疗组MAP1LC3蛋白水平与对照组相近。进一步证实激素可能导致股骨头的自噬性死亡，而且3-甲基腺嘌呤对于激素性股骨头坏死中自噬型细胞死亡可能起到抑制作用。根据以上实验结果可以认为：大剂量糖皮质激素的使用可以明显诱导骨细胞自噬的发生发展；而在SANFH的过程中，细胞自噬又在一定程度上、或者某一阶段参与并促使了SANFH的发展进程，并最终导致了股骨头的缺血坏死。正如作者之前所推测的那样，细胞自噬很有可能是SANFH的重要发病机制。

由上可以得出以下结论，在兔股骨头缺血坏死模型中，激素可使股骨头骨细胞、成骨细胞自噬型死亡，同时也可以使其中MAP1LC3的mRNA与蛋白高表达，而这一系列自噬型细胞死亡过程可以通过3-甲基腺嘌呤得到抑制。此次研究为体内实验，存在一定的局限性，可能受本体以及其他因素的影响，因此细胞培养将成为下一步研究的重点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程 

文题释义：
自噬基因微管相关蛋白1轻链3：是哺乳动物细胞中参与自噬的特异性基因，通过与Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(ClassⅢ PI3K)形成复合体来调节其他自噬相关基因编码蛋白，然后在自噬前体结构中定位，调节自噬活性。
3-甲基腺嘌呤：是一种细胞自噬抑制剂，它通过抑制ClassⅢ PI3K来抑制自噬体的形成，从而抑制自噬过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

已有学者开始对骨细胞、成骨细胞凋亡型程序性细胞死亡在SANFH中的作用进行了初步探讨，对其发病机制有了新的认识。但对于自噬型程序性细胞死亡在SANFH中的作用，目前已有部分报道，研究的重点内容是寻找及明确其发病机制。近年来，相关工作更多的集中于促血管生长因子及其差异表达基因的研究。作者的前期研究结果表明，激素对股骨头节段血管中血小板衍生生长因子与血管内皮生长因子的超强抑制而引起的血供中断与SANFH存在关联性，诸多促血管生长因子及差异表达基因的调控在SANFH中发挥着重要作用。 

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程