苏木精-伊红染色显示，肌腱组移植物边界清楚，周边由睑板腺体细胞包绕，移植物中央可见呈条索状平行排列的胶原纤维结构，肌腱边界处部分纤维结构不清，证实移植体为实验填充的肌腱；移植体周围可见散在分布的新生毛细血管，周围未见明显的炎症细胞浸润。异体巩膜组异体巩膜被胶原纤维替代，细胞排列紊乱。
2.4   两组睑板复合体生物力学测试结果   肌腱-睑板复合体和异体巩膜-睑板复合体的最大载荷分别为(10.521±3.497)，(9.450±4.032) N，最大载荷时的拉伸位移分别为(6.110±0.347)，(4.590±0.732) mm，杨氏弹性模量分别为(5.562±1.156)，(2.575±0.978) MPa，组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

根据正常眼睑的拉力测试结果，从开始受力直至标本拉断，眼睑的力学性要经过弹性阶段、屈服阶段、强化阶段和局部变形阶段，见图3A，其中在局部变形阶段标本断裂，力学图记载结束。异体巩膜-睑板复合体在弹性阶段斜率和在强化阶段的最高点(最大载荷)低于正常的眼睑组织，没有屈服阶段，见图3B，力学性能下降明显，对下睑组织的支撑作用不如肌腱，经苏木精-伊红染色后光镜下可见其纤维断裂、排列紊乱，睑板腺体细胞增生。肌腱-睑板复合体的最大载荷、最大位移和弹性模量等眼睑力学性能较异体巩膜组眼睑有了很大改善，见图3C，肌腱修复虽不能完全恢复到破坏前的状态，但其承重及拉伸能力均优于异体巩膜且修复后眼睑接近正常，闭合功能不受影响，没有出现复发。



2.5   自体肌腱的组织相容性   由眼睑组织形态学观察结果可知，自体肌腱组织与睑板具有较好的组织相容性。

眼睑缺损常见于先天性、肿瘤切除术后、创伤等情况[1]，不仅影响患者面部美观且常造成患者结膜、角膜干燥甚至穿孔，因此常需行眼睑原位重建手术进行治疗。由于睑板在生理上存在一定韧度，同时对面部的美观至关重要，所以眼睑重建的关键是寻找理想的睑板替代物[2]。目前临床上将替代材料大致分为三类：自体组织(如自体睑板、软骨和硬腭黏骨膜等)[3]、同种异体组织(如巩膜[4]、硬脑膜等)及生物材料(如脱细胞真皮基质[5]、生物硬脑膜片)等，但大都存在一定的不足[6]。自体睑板是十分理想的替代物，但取材困难，可能造成对侧眼的功能障碍，术后出现感染、瘢痕等。软骨、硬腭骨膜等自体材料取材不便且难以固定。同种异体组织中异体巩膜应用较为广泛，但异体巩膜存在一定程度的伦理学限制，且来源受限，术后也常有排异反应的报道。生物材料如Medpor、生物硬脑膜片等硬度偏大，常常造成术后眼睑与角膜接触不佳，眼睑形态不良，甚至角膜上皮细胞坏死。自体肌腱取材于自体组织，无排异反应、炎症反应轻，其结构致密具有良好的承重能力及拉伸力[7]，临床上常用于韧带修复等[8]，但应用于眼睑重建的报道国内外少见。此次实验制备兔下眼睑缺损模型，将自体肌腱移植于睑板处形成肌腱睑板复合体重新塑造眼睑，并从生物特性、组织学检查方面分析自体肌腱是否可作为睑板替代物应用于眼睑重建。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   动物观察实验，组间比较进行单因素方差分析、t检验。
1.2   时间及地点   实验于2019年11月至2020年2月在湖北医药学院动物实验中心内完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   健康雄性日本大耳白兔20只，普通级，体质量2.0-2.5 kg，20-24周龄，由湖北医药学院实验动物中心提供，使用许可证号：SYXK(鄂)2019-0031，生产许可证号：SCXK(鄂)2019-0008。在SPF级动物房饲养，每笼1只，饲养环境温度为14-20 ℃，湿度为60%-70%，自然光照和人工光照14 h/d，术前在实验动物中心以颗粒饲料适应性喂养1周。实验方案经湖北医药学院动物实验伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2   主要试剂   苏木精(美国SIGMA公司)；水溶伊红(天津光复精细化工有限公司)；甲醛、H2O2、梯度乙醇、二甲苯、盐酸、中性树胶封闭液、PBS(自配，国产分析纯)；戊巴比妥钠(上海物竞化工科技有限公司)；盐酸奥布卡因滴眼液(参天制药株式会社)。
1.3.3   主要仪器   高速落地离心机(型号Sorvall LYNX4000，美国Thermo Scientific公司)；冰冻切片机(CM1860 US，德国莱卡公司)；包埋机(型号KD.BM，浙江金华科迪有限公司)；成像系统(型号Nikon Ds-u3，日本尼康公司)；AquapIus2系列艾科浦超纯水制成机(美国艾科浦国际有限公司)；正置显微镜(日本奥林巴斯公司)；生物力学实验机(型号311r Frame，美国Testresources公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   制作眼睑缺损模型   取13只日本大耳白兔，参考RUBIN等[9]的方法制备兔眼睑缺损模型。

术前结膜囊滴4%的盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉，庆大霉素冲洗。3%戊巴比妥溶液按3 mL/kg于兔耳缘静脉缓慢注射进行全身麻醉，将兔子固定于标准兔台中，常规消毒铺巾，下眼睑用1%利多卡因及1∶100 000 肾上腺素行局部注射麻醉。用亚甲蓝指示剂距睑缘下0.5-1.0 mm做平行标记，由眶隔最低点沿眶隔边缘向两侧眼角做下标记；沿平行标记划开皮肤，见表皮、眼轮匝肌、眶隔筋膜，锐性分离肌肉组织和眶隔筋膜至下标记处，剪去已分离的皮肤和肌肉组织，去除睑板组织4 mm×3 mm。①植入自体肌腱：一侧眼取兔自体后腿第2，3趾趾深屈肌腱，将两端肌肉剔除干净后浸泡于生理盐水中备用。用8-0可吸收缝线将睑板残端与自体肌腱缝合，局部做滑行结膜瓣覆盖缺损区域，0.1%苯扎溴安冲洗伤口，消毒，用6-0尼龙线间断缝合皮肤。外翻结膜涂抹红霉素眼膏、滴氯霉素眼药水，防止感染。②植入同种异体巩膜：另一侧眼植入家兔同种异体巩膜。提前72 h制备同种异体巩膜。取7只日本大耳白兔，麻醉处死后行眼球摘除术，分离巩膜，将巩膜周围组织及色素去除干净；大量生理盐水冲洗巩膜壳后用体积分数 95%乙醇脱水 24 h，期间更换一次乙醇，置入体积分数75%乙醇中存放72 h以上。使用前将同种异体巩膜置入含庆大霉素320 mg/L 的生理盐水中复水30 min。修剪异体巩膜，使其与模型兔缺损睑板相匹配，用8-0可吸收缝线将睑板残端与异体巩膜缝合，局部做滑行结膜瓣覆盖缺损区域，0.1%苯扎溴安冲洗伤口，消毒，用6-0尼龙线间断缝合皮肤。外翻结膜涂抹红霉素眼膏、滴氯霉素眼药水，防止感染。
1.4.2   术后处理   术后每日点诺氟沙星滴眼液3次/d，连续2周。分笼饲养，每日观察家兔精神、进食等一般状况。术后4周，耳缘静脉空气栓塞法处死动物，取出术侧肌腱-睑板复合体及对侧异体巩膜-睑板复合体。 
1.5   主要观察指标   
1.5.1   大体形态观察   切口有无红肿、分泌物，移植区有无愈合不良、植片暴露、排斥反应，眼睑有无闭合障碍、睑球粘连，观察角膜情况及眼球活动度。
1.5.2   组织形态学观察   40 g/L多聚甲醛固定标本24 h，然后体积分数75%，80%，90%，100%乙醇梯度脱水，2 h/次，二甲苯透明2次，浸蜡，包埋后切片，切片厚度4 µm，然后行苏木精-伊红染色，显微镜下观察炎性细胞数量、胶原纤维结构及新生血管是否长入。
1.5.3   生物力学检测   将取出组织置于TestResources型万能材料测试机的夹具上，调整测试物与拉力方向一致，进行拉力测试。先以拉力为5 N，速度为2 mm/min的预拉力循环5次，使材料预张，然后再以10 mm/min的拉伸速度施加拉力至标本拉断，记录标本损毁模式，以试验机绘制的载荷-位移曲线，确定标本的最大载荷(曲线最高点数值)、最大位移、弹性模量。
1.6   统计学分析   使用统计学软件SPSS 25.0进行统计分析，计量资料若呈非正态分布、方差不齐，采用两样本非参数的秩和检验；若符合正态分布和方差齐性，用x±s表示，组间比较进行单因素方差分析方法、t检验，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。该文统计学方法已经湖北医药学院生物统计学专家审核。

眼睑缺损严重者导致眼睑不能完全闭合，睑结膜外露，不仅影响美观，而且易发生溢泪、暴露性角膜炎、角膜脱失甚至造成失明、穿孔等严重并发症。眼睑缺损按病因可分为先天性和后天性眼睑缺损两类，缺损可分为上睑缺损、下睑缺损、睑缘缺损、内外眦部眼睑缺损等。先天性缺损可发生在上、下睑，单侧或双侧，常伴有眦角、泪道、眉等畸形或额骨和上颌骨缺损，视力正常或有障碍。后天性缺损多由创伤所致，常因伴有眶骨骨折、眼肌损伤等而出现复视，严重者可致眼球损伤、视力受损，治疗常较困难[10-12]。由眼睑肿瘤切除所致后天性眼睑缺损，视力多无损害[13]。按损伤范围可将眼睑缺损分轻、中、重三类[14-15]，轻度缺损指缺损小于眼睑长度的1/4者，中度缺损指缺损达到眼睑长度的1/4-1/2之间，如眼睑缺损超过其长度2/3以上者被称为重度缺损。轻度缺损可采取直接闭合或者选择局部皮瓣辅助修复[16]，如“V-Y”局部皮瓣、双蒂皮瓣、菱形皮瓣等；中度缺损可选择外侧推进皮瓣或旋转皮瓣修复，同时可联合应用外眦切开术[17]，增加软组织量；重度缺损则需应用睑板结膜瓣修复后层缺损，皮肤及软组织修复前层缺损等[18]。对于中重度眼睑缺损具的体治疗方案如下：①皮肤及软组织覆盖：有报道采用以颞浅动静脉为蒂的耳后皮瓣、“V-Y”局部皮瓣、眼轮匝肌推进皮瓣、鼻外侧超薄皮瓣、额部扩张皮瓣以及耳后全厚皮片移植进行浅层修复[19-21]；②寻找睑板替代物：异体组织中采用异体巩膜、异体睑板结膜、异体骨等；自体组织中采用鼻中隔软骨鼻黏膜、自体脂肪、自体骨等[22-23]；另外，也有报道使用仿生人工材料，如Medpor[24-26]、异种脱细胞真皮基质[27-33]、壳聚糖[34-35]、锯齿线悬吊等方法对眼睑后层组织进行填充修复[36]。以上材料比如骨组织等来源不足；而黏膜组织及脂肪组织等不能有效对抗重力及瘢痕牵拉力量，术后容易再次形成眼睑畸形，异体组织如异体巩膜存在来源少，存在一定的伦理学限制以及可能发生排异反应。Medpor假体等人工材料虽已经市场化应用，但常有术后眼睑形态不良的报道。故有学者提出采用肌腱来修复眼睑后层代替睑板并在临床上已经使用，但目前并无基础实验依据及理论基础。此次实验旨在应用动物实验探寻应用肌腱组织代替睑板组织的可行性，并评价其效果。

睑板腺细胞数量少，不易体外分化培养，故应寻找良好的替代品。肌腱细胞和睑板腺细胞同为致密结缔组织，且肌腱工程已利用干细胞的体外分化形成肌腱组织[37-38]，故如能将体外分化形成的肌腱作为眼睑后层的替代产品必然是一种突破，利用干细胞分化形成同种异体的组织移植拥有广大的受益群体及巨大的经济效益，它能直接提高经济效益的同时更能有效解决临床上所遇到的问题。同时，人体不同的组织具有同源性，利用干细胞分化进行干预可体外培养可替代材料，治愈眼睑外翻及缺损方面的疾病，对美容也可进行一定的补充。如可将体外培养的肌腱支架置于眼睑后层达到替代睑板的作用，不仅可有效解决眼睑缺损及外翻的情况，更能改善患者的外观，并且可减少复发率，更好地与眼周软组织相融合，这样不仅可有效降低临床治疗的副损伤及并发症的发生率，而且能让更多的患者接受。因此，作者将睑板替代组织锁定为肌腱，利用肌腱和睑板相近的生物学特性将肌腱应用于睑板的再造。

异体巩膜为公认较理想的睑板替代材料，但存在易收缩、易降解、来源少等特点，且因来自异体，安全性亦无法保障[39]。此次实验结果显示，相较传统异体巩膜，自体肌腱具有以下优势：①良好的生物相容性，自体肌腱取材于自体组织，与眼睑组织没有发生明显的排斥反应，且炎性反应较轻；②手术操作简单，自体肌腱取材方便、来源广泛、易于处理及塑型；③生物力学测试结果表明，自体肌腱具有更强的承重能力和拉伸能力。但由于是首次研究，设计还存在不足之处，只观察到4周后的效果，肌腱远期转归如何尚需要进一步研究。但是此次实验仍可说明应用肌腱来替代睑板可达到对眼睑后层的重建效果，不仅可维持生物学稳定，而且能更好地与眼周软组织相融合，达到功能与形态的统一，具有广阔前景。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：
睑板腺：存在于包括人在内的哺乳类动物的眼睑内，是一种皮脂腺，分泌眼脂。该腺体存在于构成眼睑中核结缔组织板的睑板中，所以也叫睑板腺。腺体与眼睑缘呈垂直方向排列，各腺都单独地开口于眼睑缘。
自体肌腱：来源于自身的肌腹两端的索状或膜状致密结缔组织，便于肌肉附着和固定。
眼睑原位重建：对眼睑缺失患者行手术治疗重建眼睑，关键是寻找合适的睑板替代物，以维持眼睑正常的形态。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

眼睑缺损严重影响患者的眼睑外观和功能，目前所用手术方法均存在各自优缺点。修复眼睑缺损的关键是重建睑板。睑板的替代物有很多，如异体巩膜、自体脂肪、Medpor假体等，但均存在不足之处。自体肌腱具有来源广泛、生物相容性好、韧性高等特点，因此此次实验尝试用自体肌腱作为睑板替代物用于眼睑重建，具有应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程