2.1   人牙周膜干细胞的分离培养   原代培养3-5 d，可见梭形细胞自组织块边缘爬出，细胞体积较小，胞体丰满，细胞核清晰可见，细胞呈放射状生长，见图1A。传代后，细胞呈成纤维细胞样，长梭形或纺锤形，漩涡状生长，见图1B。



2.2   人牙周膜干细胞的鉴定
2.2.1   流式细胞术分析细胞表面标志物    细胞阴性表达泛白细胞标志物CD45(0.01%)和造血细胞标志物CD34(0.15%)，细胞阳性表达间充质干细胞特异性标志物 CD90(99.1%)、CD105(99.92%)和CD73(99.23%)，见图2，证实培养细胞为间充质来源。




2.2.2   体外多向分化潜能    成脂诱导21 d后，油红O染色可见大小不等的红色脂滴，见图3A，证实培养细胞具有成脂分化能力。成骨诱导21 d后，茜素红S染色可见红色矿化结节，见图3B，证实细胞具有成骨分化能力。



2.3   琼脂糖细胞培养板及人牙周膜干细胞球体制备    琼脂糖培养板每个微孔大小均匀，排列整齐，见图4A。将第3-6代人牙周膜干细胞铺入琼脂糖凝胶微孔后，对细胞聚集体进行了10 d的研究。最初，5 h内人牙周膜干细胞开始聚集，自我聚集形成一堆细胞，直到得到一个球体形状，见图4B；24 h后细胞融合成一个细胞球体，见图4C；随着培养时间增长，干细胞球体直径逐渐缩小，见图4C-F。



2.4   人牙周膜干细胞球Live/Dead染色   Live/Dead染色通过测量细胞的酯酶活性和质膜完整性来量化活细胞和死细胞。活细胞产生均匀的绿色荧光，死细胞产生红色荧光。如图5所示，可以看出随着培养时间变长，细胞球体核心死细胞逐渐增多。



2.5   人牙周膜干细胞球体细胞骨架/细胞核染色   图6为人牙周膜干细胞球聚集体于3，7，10 d的细胞骨架/细胞核染色结果。丝状肌动蛋白(F-actin)染色可以看出细胞球体细胞骨架在第1周内发生变化，随着时间的推移，微球体紧密，皮层肌动蛋白网络越来越狭窄。



2.6   3D培养技术对人牙周膜干细胞成骨分化的影响
2.6.1   碱性磷酸酶活性测定   成骨诱导3，7 d时对人牙周膜干细胞球体和正常铺板人牙周膜干细胞进行碱性磷酸酶活性测定。如图7所示，诱导3 d时，与对照组2D培养相比，3D培养组碱性磷酸酶活性显著增强(P < 0.000 1)，细胞碱性磷酸酶活性增强了约0.18倍；诱导7 d时，与对照组2D培养相比，3D培养组碱性磷酸酶活性降低(P < 0.01)，细胞碱性磷酸酶活性降低了约0.5倍。




2.6.2   成骨基因表达   成骨诱导3，4，7 d时，通过qRT-PCR检测细胞成骨相关基因ALP、RUNX2、OCN和COL1的mRNA表达。如图8所示，成骨诱导3 d时，与2D培养相比，3D培养组ALP、OCN mRNA表达水平均显著上调(P < 0.05)。成骨诱导4 d时，与2D培养组相比，3D培养组RUNX2、OCN mRNA表达水平显著上调(P < 0.05)。成骨诱导7 d时，与2D培养组相比，3D培养组RUNX2、OCN mRNA表达水平显著上调，仅OCN基因有统计学意义(P < 0.05)。此外，还分析了β-catenin的mRNA表达水平以评估3D培养技术对Wnt/β-catenin信号通路的影响。如图8所示，在成骨诱导3，4 d时β-catenin的mRNA表达水平显著上调(P < 0.01)，成骨诱导7 d时也存在上调趋势。

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干细胞是人体内一类具有自我更新与多向分化潜能的原始细胞群。在不同类型的干细胞中，间充质干细胞因其有着容易获取、致瘤风险低等优点，成为干细胞应用研究的主要对象[1-2]。间充质干细胞主要分布于口腔、骨髓、脂肪、脐血等多种组织中[3-7]。人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)作为牙源性间充质干细胞一员，具有较强的增殖和成骨分化能力，是近年来牙周骨组织工程研究的热点[8-9]。

目前基于干细胞的骨再生医学仍面临许多挑战，比如成骨效率低等[10]。研究表明，微环境在由间充质干细胞介导的骨缺损愈合方面起着关键作用[11]。因此，建立有利的微环境是改善基于间充质干细胞的组织工程的有效途径[12]。与传统二维(two-dimensional，2D)培养相比，三维(three-dimensional，3D)细胞培养技术可以更好地模拟细胞与细胞相互作用的生理条件，为外源性移植的间充质干细胞建立有益的微环境[13]。研究已经证明：与2D培养相比，3D培养技术有利于维持间充质干细胞的干性并且提高成骨分化潜能[14-15]。

目前3D细胞培养装置可以分为静态和动态培养装置[16]。静态培养装置简单，它们通过静态物理力促进聚集体的形成，如悬滴技术和液体覆盖技术；而动态培养系统则通过施加如向心力、磁场等外力使细胞聚集。与动态培养系统相比，静态培养系统无需昂贵或专业的设备即可形成用于小规模实验的球体，多用于基础研究[17]。液体覆盖技术是由琼脂、琼脂糖等抑制细胞附着的材料构成培养板，通过阻断细胞在非黏附培养板上的黏附来形成球体[18]。该实验采用液体覆盖技术，使用的是带有若干微孔的微图案聚二甲基硅氧烷的模具，孔直径为 200 μm，孔间距为100 μm[18-19]，然后利用该模具制备琼脂糖微孔板，在重力的作用下，人牙周膜干细胞从悬浮液中沉淀到微孔中，形成大小高度均匀且易于收获的球体。通过观察3D培养技术对人牙周膜干细胞形态、活性及成骨分化能力的影响，为3D培养技术应用于牙周组织和骨组织再生提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   研究3D培养技术对人牙周膜干细胞成骨分化影响的体外观察实验。采用单因素ANOVA进行统计分析。
1.2   时间及地点   实验于2020年12月至2021年9月在吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室完成。
1.3   材料   聚二甲基硅氧烷母模(安徽中鼎玉铉新材料科技有限公司，中国)；Ⅰ型胶原酶和 Dispase 酶、吲哚美辛、维生素C、地塞米松(Sigma，美国)；PBS缓冲液、2.5%胰蛋白酶、胎牛血清、α-MEM培养基、青-链霉素(Hyclone，美国)；小鼠抗人CD45 (BioLegend，美国)；小鼠抗人IgG1、CD73、CD90、CD34、CD105(eBioscience，美国)；琼脂糖、油红O染色液、β-甘油磷酸钠、1%茜素红染色液(索莱宝，中国)；胰岛素(酷来搏，中国)；Live/Dead染色试剂盒(贝博试剂公司)；细胞骨架(肌动蛋白；F-actin)绿色荧光染色试剂盒(Bio-Rad公司，美国)；DAPI染色液、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，中国)；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(普西唐，中国)；碱性磷酸酶活性检测试剂盒(南京建成，中国)；培养细胞总RNA提取试剂盒(成都福际，中国)；染料法qPCR试剂盒、cDNA合成试剂盒(翌圣，中国)；引物(生工，中国)；流式细胞仪(BD，美国)；二氧化碳恒温培养箱(SANYO，日本)；酶标仪(Bio-TEK，美国)；分光光度计(Thermo Scientific，美国)；qRT-PCR仪(Bio-rad，美国)；激光共聚焦显微镜、倒置相差显微镜(Olympus，日本)。
1.4   实验方法  
1.4.1   人牙周膜干细胞的分离培养  所有实验程序均经吉林大学口腔医院医学伦理委员会批准(批准号：2021年临审第 66 号)。患者及监护人同意并签署知情同意书后，从就诊于吉林大学口腔医院的12-18岁正畸拔牙患者健康前磨牙取得牙周膜组织，拔出的牙齿储存在含5%双抗的α-MEM培养基中，4 ℃冰盒保存并尽量于2-4 h内完成实验。在超净台提取牙周膜时，首先冲洗牙齿，然后从牙根中部1/3区域用无菌刀片刮取牙周膜组织。将刮下的组织块用眼科剪剪至0.5-1.0 mm3大小，加入含有等比例6 g/L Dispase分离酶和8 g/L Ⅰ型胶原酶的混合消化液100 μL，于37 ℃下消化20 min。消化结束后离心，弃去消化液，加入1 mL完全培养基(含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的α-MEM培养基)重悬并转移至培养瓶中最后补液至4 mL，于 37 °C、体积分数5% CO2饱和湿度培养箱中培养，每三四天换液1次，3-5 d时可观察到细胞从组织块边缘爬出，继续培养细胞至80%汇合，采用胰酶消化法传代。此后细胞融合度达到80%-90%时按1∶3比例传代，后续实验使用第3-6代细胞。 
1.4.2   人牙周膜干细胞的鉴定

(1)流式细胞术分析细胞表面标志物：胰酶消化并收集第3代人牙周膜干细胞，PBS洗涤，重悬，进行细胞计数，将细胞悬液浓度稀释为5×109 L-1。取6个Ep管，每管加入100 μL细胞悬液，参考流式抗体厂家说明书，向6个Ep管分别加入不同的抗体(小鼠IgG1同型对照、小鼠抗人CD45、CD73、CD34、CD90和CD105)，吹打均匀后避光冰上孵育15 min，孵育结束后PBS洗涤2次，然后加入300 μL PBS重悬，最后将细胞转移至流式管中，采用流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达水平。

(2)成骨能力鉴定：按1×105个/孔的密度将第3代人牙周膜干细胞接种至6孔板内，待细胞生长至80%融合时，加入成骨诱导液(含10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 mg/L维生素C的完全培养基)继续培养。每3 d换液，诱导21 d后，40 g/L多聚甲醛室温固定20 min，PBS洗涤，1%茜素红染色液染色20 min，PBS洗涤3-5次，最后于倒置显微镜下观察，拍照。

(3)成脂能力鉴定：按1×105个/孔的密度将第3代人牙周膜干细胞接种至6孔板内，待细胞生长至80%融合时，换为成脂诱导培养基(含1 μmol/L地塞米松、200 μmol/L吲哚美辛、10 mg/L胰岛素和500 μmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的完全培养基)继续培养。每3 d换液，诱导21 d后，40 g/L多聚甲醛室温固定20 min，PBS洗涤，油红O染色液室温染色20 min，PBS洗涤3-5次，最后于倒置显微镜下观察，拍照。
1.4.3   琼脂糖细胞培养板及人牙周膜干细胞球体制备   用高压处理后的3%琼脂糖溶液浇注到聚二甲基硅氧烷母模上，制备培养板。待琼脂糖固化后，将面积≈1.8 cm2的微孔放入24孔板中，每孔加入1 mL PBS，在紫外线下消毒30 min。每个琼脂糖培养板含有约2 000个微孔。第3-6代人牙周膜干细胞经酶消化收集形成细胞悬液，控制24孔板每孔细胞密度为1×106，细胞悬液在重力作用下自聚集形成干细胞球体，隔天换为成骨诱导液，每2 d更换1次。
1.4.4   人牙周膜干细胞球Live/Dead染色  人牙周膜干细胞球成骨诱导3，7，10 d后，每孔加入1 mL PBS洗涤细胞球两三次，根据试剂盒说明书配制成染色工作液，在室温避光孵育30 min。孵育完成后用PBS洗涤细胞球一两次，而后将琼脂糖培养板转移至荧光共聚焦专用观察皿进行荧光共聚焦显微镜观察，拍照。
1.4.5   人牙周膜干细胞球细胞骨架荧光标记染色  人牙周膜干细胞球成骨诱导3，7，10 d后，每孔加入1 mL PBS洗涤细胞球一两次，40 g/L多聚甲醛室温固定20 min，双蒸水洗涤两三次，使用细胞骨架绿色荧光染色试剂盒进行细胞骨架荧光标记，避光孵育20 min，加入DAPI染液对细胞核进行荧光标记，继续避光孵育10 min，孵育完成后用PBS洗涤细胞球一两次，将琼脂糖培养板转移至荧光共聚焦专用观察皿进行荧光共聚焦显微镜观察，拍照。
1.4.6   碱性磷酸酶活性测定  将第3-6代人牙周膜干细胞以1×106个/孔的密度接种在24孔琼脂糖培养板，对照组以1×105个/孔的密度接种在6孔板中，待细胞体融合稳定后，更换为成骨诱导培养基，每2 d换液。成骨诱导3 d和7 d后，PBS洗涤，收集细胞球于离心管中。在离心管和正常2D培养的孔板中加入RIPA裂解液收集细胞裂解物，根据说明书，使用碱性磷酸酶测定试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒测定碱性磷酸酶活性和蛋白浓度。
1.4.7   qPCR检测成骨相关基因表达  将第3-6代人牙周膜干细胞以1×106个/孔的密度接种在24孔琼脂糖培养板，对照组以1×105个/孔的密度接种在6孔板中，待细胞体融合稳定后，更换为成骨诱导培养基，每2 d换液。成骨诱导3，4，7 d，根据说明书，使用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，检测mRNA浓度及纯度。根据反转录试剂盒说明书进行反转录，然后进行real-time PCR实验。每个反应使用同一cDNA样品进行3次重复。采用2-ΔΔCt方法计算目标基因相对于内参基因GAPDH表达量。引物设计见表1。

1.5   主要观察指标   ①人牙周膜干细胞的形态、表面标志物及多向分化能力；②3D培养条件下人牙周膜干细胞球的活性和形态随时间的变化；③3D培养和2D培养条件下成骨诱导3 d和7 d时人牙周膜干细胞的碱性磷酸酶活性；④3D培养和2D培养条件下成骨诱导3，4，7 d时成骨相关基因表达水平。

1.6   统计学分析   采用SPSS 18.0软件进行数据分析，所有数据进行正态性检验并表示为x±s。采用单因素ANOVA 进行统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义。Imaris 7 软件用于共聚焦图像处理；Graphpad Prism 8 软件用于绘制统计图表。文章统计学方法已经通过吉林大学生物统计学专家审核。

人牙周膜干细胞亚群于2004年首先被发现，来自牙周膜。在体外培养时，人牙周膜干细胞能表达多种成牙骨质/成骨细胞标志物，并形成矿化结节[20]。尽管人牙周膜干细胞是间充质干细胞进行牙周再生的首选，但体内骨形成方面，人牙周膜干细胞容易受到炎症微环境的损害[3]，而且组织再生需要在目标位置有一定数量的细胞才能发挥作用[21]。因此，在牙周组织修复过程中，由于干细胞数量不足以及炎症微环境的影响，牙周组织再生能力往往无法满足治疗的需要。

目前关于组织工程中提高种子细胞数量的策略主要包括体外提高细胞移植数量和活性或体内通过细胞材料相互作用促进细胞募集和归巢[22]。作为单细胞悬浮液注射的替代品，细胞片和聚集体提供了无支架细胞递送的新策略，使移植细胞能够稳定植入和长期存活[23]。研究表明，在体内移植单层或分层人牙周膜干细胞片后，能够观察到骨样组织/牙周膜样复合物，展现了人牙周膜干细胞片的牙周再生潜力[24]。因此，在特定条件下培养产生细胞聚集体，现已成为再生医学中的一种有吸引力的策略。与单细胞悬液相比，细胞片和聚集体更容易输送和移植，且因干细胞体外培养过程中产生的细胞外基质利于保护移植过程中细胞活力，细胞损失小[25]。与单个细胞或细胞片相比，细胞聚集体含有更多的细胞外基质，进而使得干细胞球的自我更新能力、促血管生成能力和多向分化能力显著提高[26-27]。

基于这一优点，研究人员使用支架材料载细胞球体移入兔颅骨缺损模型促进骨愈合[28]，或者多个小的细胞球体聚集形成较大的细胞聚集体直接用于小鼠股骨缺损处观察成骨效果[18]。

在该研究中，人牙周膜干细胞球体在前7 d直径迅速减小，然后在第7-10天适度减小。结合后续Live/Dead活性及细胞骨架染色结果来看，球体直径的初始减小是由于细胞聚集，但随后的减小似乎是由于营养和氧气受限所致。

在该研究中，Live/Dead染色结果显示，球体中心的死细胞数量随时间延长而增加，这与其他3D培养干细胞球的结果是类似的[29-30]。缺氧和坏死是肿瘤球体的基本现象，这也可能发生在体外球体培养中。研究表明，通常球形可以显示3个同心区域：高度增殖和迁移细胞的外部区域，静止细胞的中间区域和坏死细胞的内部区域[31]。大多数小分子(如氧)在细胞球体中的扩散限制距离为150-200 µm，超出扩散极限，代谢废物会在细胞球体中的内层积累，导致核心坏死[32]。因此，缺氧和内层细胞死亡是当前球体培养的局限[33]。但从另一方面来说，缺氧区或静止区很重要，因为一定的缺氧环境会刺激细胞分泌血管生成相关因子[34]。从干细胞移植的实际应用来看，与高灌注器官相比，干细胞移植的骨缺损处是相对缺氧的。在培养过程中，低水平的氧气将能通过模拟生理条件为干细胞移植提供有利的体外环境[35]。因此，选择一个恰当合适时机进行体内移植很重要。

细胞骨架在干细胞球体形成中也起着重要作用。该研究发现，随着培养时间的增加，绿色染色部分逐渐增多，紧密包裹在外，保持细胞结构的稳定性。干细胞球体的形成可分为3个步骤：首先分散的细胞被拉近形成松散的聚集体，细胞间直接接触导致钙黏蛋白表达上调；然后钙黏蛋白在膜表面积累；最后由于钙黏蛋白的结合和肌动蛋白马达的作用，细胞被压实成球形聚集体[36]。细胞膜的生物物理特性决定了单个细胞的机械特性，而多细胞聚集体的材料特性是细胞骨架和细胞外基质通过细胞黏附分子彼此复杂结合而产生的[37]。因此，在坚硬的2D基底上生长的细胞与球体中的细胞之间的特性是存在差异的[38]。形态流变学分析表明，与塑料黏附的间充质干细胞相比，源自球体的间充质干细胞的尺寸更小，刚度更低，可有效改善微循环[39]。 

由于其特殊的干细胞生长环境，3D培养与2D培养相比的好处之一是它可以改善成骨分化[40-41]。成骨细胞的分化始于间充质干细胞，首先分化为未成熟的成骨细胞，其特征在于COL1、ALP[42]。该研究结果证明了人牙周膜干细胞球体通过增加成骨基因的表达和碱性磷酸酶活性来增强成骨潜能。成骨诱导3 d的细胞球体碱性磷酸酶活性和ALP基因表达明显高于2D培养的细胞，这与其他3D培养方式培养干细胞得到的结果是一致的[43]。成骨诱导7 d的细胞球体碱性磷酸酶活性稍低于2D培养的细胞，这与成骨诱导7 d ALP基因表达趋势是一致的。RUNX2 蛋白是确定成骨细胞谱系所需的第一个转录因子[44]，从结果中可以看出，在成骨诱导第4天，RUNX2基因表达水平远高于2D培养组。而OCN是由成骨细胞合成的非胶原蛋白，是成骨分化的晚期标志物[45]。与2D培养组相比，在成骨诱导第3，4，7天，3D培养组的OCN表达水平一直表现为增高。结合前面早期成骨标志ALP前期增高后期表达降低的结果，推测3D培养组成骨进程可能快于2D培养组。在上述几个时间点，3D培养组COL1基因的表达一直低于2D培养组，可能与细胞球体处于缺氧环境有关。有实验证明，在低氧条件下，COL1表达降低[46]。因此，从成骨分化和活性等多方面分析，对于人牙周膜干细胞来说，成骨诱导7 d可能是合适的体内移植时机。

迄今为止，已经确定了多种功能不同的基于Wnt的信号通路，其中最具代表性的是Wnt/β-catenin 通路。该程序主要指导干细胞更新、增殖和分化[47]。研究表明，人牙周膜干细胞的成骨分化与Wnt/β-catenin通路的激活有关[48]。近期更有研究表明，间充质干细胞球体通过激活干性和 Wnt/β-catenin促进成骨[49]。因此，该研究检测了3D培养技术对人牙周膜干细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响。在第3，4，7天时3D培养组β-catenin表达显著增强，提示3D培养对人牙周膜干细胞成骨分化的促进作用可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。

综上所述，经3D培养形成的人牙周膜干细胞球体形态及活性呈时间依赖性变化，发现了3D培养组成骨诱导前3 d碱性磷酸酶活性及成骨诱导第3，4，7天成骨相关基因的表达部分增加。这些结果阐明了人牙周膜干细胞球体作为牙周组织中成体干细胞的新方向，为干细胞研究领域提供了新的信息。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
三维培养技术：是一种特殊培养细胞的方式，能够模拟细胞与细胞在空间上的交流，一定程度上还原了细胞在体内的生理环境，维持干细胞的干性并且提高其成骨分化潜能，是目前组织工程的研究趋势之一。
牙周膜干细胞：来源于牙周膜中未分化的间充质干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，有着容易获取、致瘤风险低以及无伦理争议等优点，是牙周组织和骨组织再生最具潜力的细胞之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

在不同类型的干细胞中，间充质干细胞因其有着容易获取、致瘤风险低等优点，成为干细胞应用研究的主要对象。目前关于组织工程干研究的策略包括基于体外材料和细胞培养的改进或体内通过细胞材料相互作用促进细胞募集和归巢。三维培养是是一种特殊培养细胞的方式，与传统平面细胞培养方式不同，三维培养能够模拟细胞在体内的生理环境，保护细胞在移植过程中的活性。该实验研究了三维培养形成的细胞球体活性及形态特征，并通过相关成骨分化检测手段证实了三维培养方式较传统平面培养能够一定程度提高牙周膜干细胞的成骨分化潜能，为提升牙周骨再生提供新的研究思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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