M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化

doi:10.12307/2023.243

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (6): 840-845.doi: 10.12307/2023.243

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化

刘文涛1，冯兴超2，杨毅2，白生宾1

1新疆医科大学基础医学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；2新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011

收稿日期:2022-02-08 接受日期:2022-04-18 出版日期:2023-02-28 发布日期:2022-08-09
通讯作者: 白生宾，博士，教授，新疆医科大学基础医学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054 杨毅，硕士，副主任医师，新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
作者简介:刘文涛，男，1995年生，新疆维吾尔自治区玛纳斯县人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事骨力学与骨代谢研究。
基金资助:
自治区科技支疆项目：骨力学生物学协同创新平台(2020E0285)，项目负责人：杨毅

Effect of M2 macrophage-derived exosomes on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Liu Wentao1, Feng Xingchao2, Yang Yi2, Bai Shengbin1

1School of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2022-02-08 Accepted:2022-04-18 Online:2023-02-28 Published:2022-08-09
Contact: Bai Shengbin, MD, Professor, School of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Yang Yi, Master, Associate chief physician, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Liu Wentao, Master candidate, School of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Autonomous Region Science and Technology Support Project: Bone Mechanobiology Collaborative Innovation Platform, No. 2020E0285 (to YY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
外泌体：是纳米大小的囊泡，由细胞以受控方式释放并介导细胞外和细胞间活动。外泌体作为巨噬细胞与骨髓间充质干细胞之间沟通的“使者”，可通过传递miRNA、脂质、蛋白质等多种活性分子实现细胞间信息传递，其中miRNA作为外泌体的重要组成部分，受到外泌体脂质双分子层的包裹不易降解，从而更有利于miRNA的传递及进入目标细胞行使其调控功能。
M2型巨噬细胞：主要起抗炎作用，被募集到损伤部位并分泌组织修复信号，在炎症后期启动抗炎反应，M2型巨噬细胞来源外泌体可明显增强骨髓间充质干细胞的归巢效应，且能够调控骨髓间充质干细胞向成骨方向分化，并促进血管生成。

背景：目前研究表明，M2型巨噬细胞能够促进成骨分化并呈网络状调控，外泌体可携带大量信息参与细胞间的信号传导，M2型巨噬细胞来源外泌体是否能促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，有待研究。
目的：探究M2型巨噬细胞来源外泌体对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。
方法：培养鼠源性巨噬细胞系RAW264.7与鼠骨髓间充质细胞系CP-M131，培养至第3代，应用白细胞介素4诱导巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞，从M2型巨噬细胞培养上清中提取外泌体，然后用终质量浓度为0，30，60，90 mg/L的外泌体与骨髓间充质干细胞共培养72 h后收集样本，以及60 mg/L M2型巨噬细胞来源外泌体与骨髓间充质干细胞共培养24，48，72 h后收集样本，Western blot检测骨髓间充质干细胞中成骨相关因子RUNX2和碱性磷酸酶蛋白表达，茜素红染色检测矿物质沉积情况。
结果与结论：①成骨相关因子RUNX2及碱性磷酸酶的表达水平与巨噬细胞外泌体质量浓度密切相关，与空白对照组比较，60 mg/L外泌体组RUNX2、碱性磷酸酶表达明显升高(P < 0.05)，干预72 h RUNX2、碱性磷酸酶表达明显升高(P < 0.05)；②茜素红实验结果表明，与空白对照组比较，60 mg/L外泌体组钙结节含量较高(P < 0.05)，干预72 h钙结节含量较高(P < 0.05)；③结果表明，M2型巨噬细胞分泌的外泌体能够诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。

https://orcid.org/0000-0002-4719-0214 (刘文涛)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 外泌体, M2型巨噬细胞, 成骨细胞, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: At present, studies have shown that M2 macrophages can promote osteogenic differentiation and regulate it in a network, and exosomes can carry a lot of information to participate in intercellular signal transduction. Whether M2 macrophage-derived exosomes can promote the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells remains to be studied.
OBJECTIVE: To investigate the effect of M2 macrophage-derived exosomes on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Rat derived macrophage line RAW264.7 was cultured with rat bone marrow mesenchymal cell line CP-M131 to the third generation. Interleukin 4 was used to induce macrophages to polarize into M2 macrophages. Exosomes were extracted from M2 macrophage culture supernatant. Exosomes at the final mass concentration of 0, 30, 60, 90 mg/L were cocultured with bone marrow mesenchymal stem cells for 72 hours, and 60 mg/L M2 macrophage-derived exosomes were cocultured with bone marrow mesenchymal stem cells for 24, 48 and 72 hours. The expression levels of osteogenic related factors RUNX2 and alkaline phosphatase protein in bone marrow mesenchymal stem cells were detected by western blot assay and the mineral deposition was detected by alizarin red staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The expression levels of osteogenic related factors RUNX2 and alkaline phosphatase were closely related to the mass concentration of macrophage exosomes. Compared with the blank control group, the expression of RUNX2 and alkaline phosphatase in 60 mg/L exosome group increased significantly (P < 0.05), and the expression of RUNX2 and alkaline phosphatase after 72 hours of intervention increased significantly (P < 0.05). (2) The results of alizarin red experiment showed that compared with the blank control group, the content of calcium ion in 60 mg/L exosome group was higher (P < 0.05), and the content of calcium ion after 72 hours of intervention was higher (P < 0.05). (3) The results showed that the exosomes secreted by M2 macrophages in vitro could induce the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts.

Key words: exosome, M2 macrophage, osteoblast, bone marrow mesenchymal stem cell, osteogenic differentiation

中图分类号:

刘文涛, 冯兴超, 杨毅, 白生宾. M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 840-845.

Liu Wentao, Feng Xingchao, Yang Yi, Bai Shengbin. Effect of M2 macrophage-derived exosomes on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(6): 840-845.

图/表（结果） 8

2.1 RAW264.7及CP-M131细胞形态观察复苏后的RAW264.7及CP-M131细胞培养24 h后均转为贴壁细胞，绿色为细胞骨架，蓝色为细胞核，见图1。

2.2 白细胞介素4诱导RAW264.7细胞极化为M2型巨噬细胞收集1，10，100 μg/L白细胞介素4诱导后的巨噬细胞，RT-qPCR结果表明，与空白组相比，10 μg/L白细胞介素4组巨噬细胞Arg-1、CD206表达显著上调(P < 0.05)，见图2，结果表明 RAW264.7细胞在用白细胞介素4处理后成功向M2型极化，且10 μg/L白细胞介素4诱导的效果最佳。

2.3 外泌体表征通过聚合物沉淀法提取M2型巨噬细胞外泌体，并通过透射电子显微镜、Western blot分析进行鉴定，透射电子显微镜观察样品中存在尺寸范围为30-200 nm的颗粒，并显示这些颗粒具有杯状或球状形态，见图3A。 Western blot分析进一步证明提取出的颗粒对外泌体表面标志物呈阳性，包括CD63、TSG101、Alix，见图3B，上述结果证明上清液中提取的颗粒物质为外泌体。

2.4 骨髓间充质干细胞摄取M2型巨噬细胞来源外泌体为检测M2型巨噬细胞分泌的外泌体被骨髓间充质干细胞摄取，首先使用白细胞介素4诱导RAW264.7细胞分化为M2型巨噬细胞，培养24 h后分离培养上清液中的外泌体。然后用DiI标记M2型巨噬细胞来源外泌体，进一步与骨髓间充质干细胞共培养。DiI标记的外泌体位于骨髓间充质干细胞内，并聚集在细胞核附近，见图4。最后对0，30，60，90 mg/L外泌体被骨髓间充质干细胞摄取效率进行半定量分析，结果显示60 mg/L外泌体是骨髓间充质干细胞摄取的最佳质量浓度(P < 0.05)，见图5。

2.5 M2型巨噬细胞来源外泌体促进骨髓间充质干细胞成骨骨髓间充质干细胞与30，60，90 mg/L M2型巨噬细胞来源外泌体共培养72 h后，其中60 mg/L M2型巨噬细胞来源外泌体组成骨分化相关蛋白RUNX2最高(P < 0.05)，与M2型巨噬细胞来源外泌体摄取效率结果一致，见图6A。而且发现骨髓间充质干细胞与60 mg/L M2型巨噬细胞来源外泌体共培养24，48，72 h，成骨分化相关蛋白RUNX2、碱性磷酸酶表达随时间变化逐渐上调(P < 0.05)，见图6B。茜素红染色结果显示，随着共培养时间增加，矿物质沉积染色逐渐增强，表明骨髓间充质干细胞向成骨分化，见图7。此外，60 mg/L M2型巨噬细胞来源外泌体组矿物质沉积染色显著大于其余组(P < 0.05)，与M2型巨噬细胞来源外泌体摄取效率及蛋白质印迹结果一致，见图8。这些结果均表明M2型巨噬细胞来源外泌体可以促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，多组样本比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年3月至2022年3月在新疆医科大学协同实验室完成。
1.3 材料鼠源性巨噬细胞系RAW264.7与鼠骨髓间充质干细胞系CP-M131均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；DMEM/F12、0.25%胰蛋白酶(美国Hyclon公司)；胎牛血清、青链霉素混合液(100 U/mL) (武汉博士德生物工程有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒(美国Abcam公司)；Trizol、反转录试剂盒、外泌体提取试剂盒、RNA/蛋白提取试剂盒(上海华盈生物公司)；SYBR Green Real-time PCR(上海索莱宝生物公司)；兔抗Alix、CD63、TSG101、RUNX2、GAPDH单克隆抗体(美国Abcam公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金桥生物有限公司)；细胞质染色试剂盒、白细胞介素4(上海贝博生物科技有限公司)；PCR引物合成(上海生工)；DiI染色剂[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养及处理常规复苏RAW264.7细胞后使用含体积分数10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基于37 ℃、体积分数5%CO2恒温培养箱进行培养。待细胞生长融合至75%-85%时用0.25%胰酶消化，室温下1 000×g离心5 min，弃上清，DMEM重悬细胞后进行传代。取第3代处于对数生长期的RAW264.7细胞，接种于6孔板中，调整细胞数至1×106/孔，向6孔板中分别加入质量浓度为1，10，100 μg/L白细胞介素4，12 h后可诱导为M2型巨噬细胞。
1.4.2 细胞染色取复苏后的1×106个骨髓间充质干细胞及巨噬细胞分别放入激光共聚焦专用皿中，置于37 ℃、体积分数为5% CO2恒温培养箱培养12 h，40 g/L多聚甲醛固定，PBS清洗细胞3次，加入鬼笔环肽200 μL避光孵育1 h，PBS清洗2次，加入DAPI染色试剂避光孵育5 min，PBS清洗3次，激光共聚焦显微镜进行观察。
1.4.3 外泌体的分离将上述诱导分化的3×105个M2型巨噬细胞接种于含体积分数为10%无外泌体胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、体积分数为5%CO2恒温培养箱培养24 h后，收集细胞培养上清液，4 ℃ 3 000×g离心15 min，转移上清于新的离心管中，将离心后的细胞上清与外泌体提取试剂按2∶1的比例混合，翻转混匀50次，4 ℃冰箱静置过夜约14 h，4 ℃ 3 500×g离心50 min，离心后弃上清，用1 mL PBS重悬，4 ℃ 10 000×g离心10 min，弃上清，再用 200 μL PBS重悬，4 ℃ 10 000×g离心10 min，上清即为外泌体稀释液。
1.4.4 外泌体的观察取外泌体10 μL滴加到碳覆膜铜网上，滴加时呈水滴样，样品吸附3 min，用滤纸吸去多余液体后晾干，向铜网上滴加磷钨酸染色液10 μL，避光染色2 min，用滤纸吸去多余液体，晾干后透射电子显微镜下观察并拍照。
1.4.5 外泌体示踪取0，30，60，90 mg/L M2型巨噬细胞来源外泌体各200 μL，根据DiI试剂说明书进行标记后将其与1×105/孔骨髓间充质干细胞在激光共聚焦专用皿中共培养，置于37 ℃、体积分数为5% CO2恒温培养箱培养24 h，用40 g/L多聚甲醛固定骨髓间充质干细胞，分别用鬼笔环肽及DAPI染色骨髓间充质干细胞，荧光共聚焦显微镜进行观察。
1.4.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 按照Trizol法提取M2型巨噬细胞中的总RNA，分光光度计检测RNA纯度与浓度。利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。根据SYBR Green Real-time PCR试剂说明书及预实验确定的反应时间与温度进行实时定量PCR。RT-qPCR引物序列5’-3’如下：GAPDH Forward：CAA CTG GGA CGA TAT GGA GAA G；GAPDH Reverse：CTC GAA GTC TAG GGC AAC ATA G。CD206 Forward：GTT CAC CTG GAG TGA TGG TTC TC；CD206 Reverse：AGG ACA TGC CAG GGT CAC CTT T。Arg-1 Forward：CAA GAC AGG GCT CCT TTC AG；Arg-1 Reverse：GTA GTC AGT CCC TGG CTT ATG G。以GAPDH为内参，采用2-∆∆Ct方法分析待测基因的mRNA相对表达水平。
1.4.7 茜素红染色将3×105/孔骨髓间充质干细胞接种于6孔板中，培养基为含体积分数为10%胎牛血清、1%青链霉素及90%DMEM，于37 ℃、体积分数为5%CO2恒温培养箱培养24 h，加入60 mg/L M2型巨噬细胞来源外泌体，共培养24，48，72 h后，PBS洗涤6孔板2次，然后加入40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min。随后，用1 mL 1%茜素红染色液室温染色细胞15 min，用蒸馏水冲洗5 min后，通过显微镜分析红色矿化结节，然后用酶标仪在570 nm处测量吸光度。同样，30，60，90 mg/L M2型巨噬细胞来源外泌体与骨髓间充质干细胞共培养72 h进行茜素红染色。
1.4.8 Western blot实验向200 μL M2型巨噬细胞来源外泌体中加入200 μL冷的蛋白提取液，吹打混匀，4 ℃振荡30 min，结束后4 ℃ 12 000×g离心15 min，上清即为外泌体总蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，电转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭 1 h，加入TSG101、CD63、Alix一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜后，加辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1 h，ECL发光试剂显影，凝胶成像系统曝光拍照。同样，60 mg/L M2型巨噬细胞来源外泌体与骨髓间充质干细胞共培养24，48，72 h后，以及30，60，90 mg/L M2型巨噬细胞来源外泌体与骨髓间充质干细胞共培养72 h后，按上述方法提取细胞蛋白后，检测RUNX2、碱性磷酸酶成骨相关因子的表达。
1.5 主要观察指标成骨相关蛋白RUNX2、碱性磷酸酶的表达，茜素红矿化结节吸光度。
1.6 统计学分析文章统计学方法已经通过新疆医科大学统计教研室孙勇教授审核。采用 Graphpad prism 8.0软件进行统计分析，计量资料采用x±s表示，多组样本比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

早期无菌炎症微环境对于促进骨折愈合至关重要，骨髓间充质干细胞已被证实在这个连续的过程中扮演着不可或缺的角色[19-22]。最近，已有研究证明，骨愈合过程中骨髓间充质干细胞成骨分化与炎症微环境中巨噬细胞的作用密不可分[23-24]。因此，探索骨髓间充质干细胞与巨噬细胞相互作用的具体机制可能有利于进一步指导临床医生治疗骨折。该研究通过M2型巨噬细胞来源外泌体与骨髓间充质干细胞共培养，证实了M2型巨噬细胞来源外泌体具有诱导骨髓间充质干细胞向成骨分化的作用。

巨噬细胞是一种细胞类型，可以根据局部细胞和分泌信号轻松分化为一系列效应亚型[25-27]，M2型巨噬细胞可以通过白细胞介素4、白细胞介素13、白细胞介素17等来诱导激活，也可以通过刺激免疫复合物、间充质干细胞、糖皮质激素、巨噬细胞刺激因子来分化[27-30]。M2型巨噬细胞高度表达受体分子Arg-1和CD206、清道夫受体、Toll样受体等，并分泌抗炎因子转化生长因子β、白细胞介素10、干扰素γ等，在促进组织修复和伤口愈合中发挥抗炎和血管生成作用[23-24，28]。该研究通过白细胞介素4成功诱导巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞。

早在20年前，CHAMPAGNE等[29]研究表明巨噬细胞可能为骨创伤愈合环境提供骨诱导和成骨细胞因子而促进骨愈合。10年前，PIRRACO等[30]在单核细胞/巨噬细胞对骨髓间充质干细胞早期成骨分化的影响中证实了外周血单核细胞/巨噬细胞能够影响骨髓间充质干细胞的代谢，其作用机制可能是通过单核细胞/巨噬细胞产生骨形态发生蛋白2参与其中并促进骨髓间充质干细胞增殖，使其更利于向成骨细胞分化而促进成骨。现有研究报道骨愈合过程中M2型巨噬细胞的阳性调控作用[31]，然而，这种阳性作用的潜在机制仍然难以捉摸。

外泌体作为主要的旁分泌成分已被证明通过包装和递送RNA、蛋白质在组织修复中发挥重要作用，其主要是体内多种细胞类型分泌到循环系统中的小囊泡，因此它们可以被近端或远端细胞内化，并且这种内化具有靶向性[32-33]。这些外泌体中的小分子(包括蛋白质和核酸)可以在内化后调节受体细胞的功能，从而在各种细胞和器官之间进行通讯[32，34]。近年来，M2型巨噬细胞来源外泌体在骨代谢中的作用已被逐渐认识[35-37]。在该研究中，DiI染色表明 M2型巨噬细胞来源外泌体可以被骨髓间充质干细胞内化。M2型巨噬细胞来源外泌体处理的骨髓间充质干细胞具有更强的成骨分化能力。这一结果与XIONG等[38]的研究结果一致，表明外泌体是M2型巨噬细胞诱导骨髓间充质干细胞成骨过程中的重要递质，其能够促进骨髓间充质干细胞成骨分化。该研究进一步了探索M2型巨噬细胞来源外泌体对骨髓间充质干细胞的成骨作用是否受作用质量浓度及时间的影响，结果表明骨髓间充质干细胞的成骨分化效应与M2型巨噬细胞来源外泌体的质量浓度和作用时间相关。

通过M2型巨噬细胞外泌体对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化效应的研究，进一步阐述了局部微环境在骨折中的重要作用，为骨组织工程治疗骨折及促进骨愈合方面提供了更多的可能及思路，但该研究仍具有一定的局限性，此次研究采用的细胞均为鼠源性巨噬细胞RAW264.7，并非初级巨噬细胞，在外泌体的提取中，目前仍未有明确的精准及高效提取方法，对外泌体的纯度及浓度需要更进一步的研究证实。另外，未从基因靶点等方面对结果进行更深层次的研究。接下来，更需要从分子机制、基因靶点等方面及M2型巨噬细胞外泌体在动物模型中的积极作用进行验证。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化

Effect of M2 macrophage-derived exosomes on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

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