2.1   骨髓间充质干细胞的鉴定结果   原代细胞最初大小、形态不均，24-48 h后细胞呈放射状，聚集为多个细胞集落，伸出长短不一的突起，未出现融合生长，六七天时长梭形细胞集落呈漩涡状或放射状排列，最后用1∶3的比例传至第3代时获得较为单一的间充质干细胞，见图2A。流式细胞分析显示，第3代骨髓间充质干细胞的表面标志物CD73和CD105呈现高表达，CD45呈现低表达，见图2B。上述结果可以证明培养的第3代形态均一的细胞绝大部分为骨髓间充质干细胞。



2.2   外泌体的鉴定结果   外泌体提取后，透射电镜下观察显示外泌体呈圆形或椭圆形，见图3A。纳米粒子跟踪分析显示外泌体的峰直径为91.8 nm，在所有颗粒中所占比例为98.4%，颗粒浓度为3.3×106 particles /mL，见图3B。Western blot显示，外泌体显著表达特异性的外泌体表面蛋白CD9和CD63，见图3C。以上结果表明成功提取了来自骨髓间充质干细胞的外泌体。



2.3   各组肺功能指标的变化    为验证大鼠慢阻肺模型是否建立成功，以及确定雾化形式的外泌体对肺功能的影响。使用小动物肺功能仪测试肺功能指标，与对照组比较，模型组FEV0.2、FEV0.3、FEV0.2/FVC、FEV0.3/FVC、FEF25%、FEF50%、FEF25_75%、PEF均显著性降低(P < 0.05)，表明模型组肺功能出现严重损伤；与模型组比较，外泌体雾化低、中、高剂量组FEV0.2、FEV0.3、FEV0.2/FVC、FEV0.3/FVC、FEF25%、FEF50%、FEF25_75%均显著性升高(P < 0.05)及尾静脉注射组FEV0.3、FEV0.3/FVC、FEF25%、FEF50%、FEF25_75%均显著性升高(P < 0.05)，表明外泌体治疗可以改善慢阻肺的肺功能；与外泌体尾静脉注射组相比，外泌体雾化低、中、高剂量组FEV0.2、FEV0.3、FEV0.2/FVC、FEV0.3/FVC均显著性升高(P < 0.05)，表明雾化吸入外泌体对肺功能的改善程度强于尾静脉注射外泌体治疗，见表1。



2.4   各组大鼠血清及支气管肺泡灌洗液中炎症因子水平   为明确雾化外泌体是否影响慢阻肺的炎症水平，通过ELISA实验对各组大鼠血清及肺泡灌洗液中的白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α进行定量分析。结果显示，模型组大鼠血清和支气管肺泡灌洗液中白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α水平明显高于对照组(P < 0.05)。与模型组相比，外泌体雾化低、中、高剂量组及外泌体尾静脉注射组大鼠血清和肺泡灌洗液中两种炎症因子水平均降低(P < 0.05)。低剂量外泌体雾化组大鼠血清和肺泡灌洗液中两种炎症因子水平显著低于外泌体雾化中、高剂量组和外泌体尾静脉注射组(P < 0.05)，可见雾化形式的外泌体可减轻慢阻肺炎症反应，其中以低剂量外泌体雾化作用最为显著，见图4。



2.5   各组肺组织病理学变化   为明确雾化外泌体对慢阻肺模型大鼠肺组织病理学的影响，进行了苏木精-伊红染色和Masson染色。苏木精-伊红染色结果显示，与对照组相比，经过反复的脂多糖和香烟烟雾刺激后的慢阻肺模型组大鼠存在明显的炎症细胞浸润，且炎症细胞多聚集在血管及支气管周围，支气管管腔内可见黏液性血栓，此外，还可观察到肺泡壁变薄过度扩张，部分可见肺泡融合。然而，与模型组相比，经低、中和高剂量外泌体雾化治疗后显著降低了气道炎症和肺泡结构的破坏，其中在低剂量外泌体雾化组中，大鼠肺组织的血管及支气管周围有少量的炎症细胞浸润，未见明显的支气管黏液栓，肺泡壁轻度扩张，且有少量的肺泡融合。尾静脉注射外泌体的治疗效果并不显著，见图5A。根据各组苏木精-伊红染色结果进行了大鼠肺组织炎症评分，见图5B。与对照组相比，模型组大鼠炎症评分明显升高(P < 0.05)。与模型组相比，外泌体雾化组炎症评分显著降低(P < 0.05)，其中低剂量外泌体雾化组炎症评分明显低于外泌体尾静脉注射组(P < 0.05)。

为了验证外泌体对慢阻肺大鼠肺组织纤维化的保护作用，应用Masson染色评估胶原沉积情况，见图6。模型组大鼠肺组织的气道周围观察到明显的蓝色胶原纤维，外泌体治疗后显著减少模型大鼠肺内胶原沉积(P < 0.05)，其中低剂量外泌体雾化组气道周围胶原纤维明显减少，并且胶原纤维面积百分比明显低于其他治疗组(P < 0.05)。



2.6   生物相容性   大鼠慢阻肺模型建立后，严格按照振动筛网雾化器使用说明操作，大鼠雾化过程中出现深慢呼吸，眼目不挣，躯体蜷缩，基本无活动。雾化结束离开雾化箱后数分钟，大鼠呼吸恢复正常节律，反应灵敏，活动增多，大便正常，无其他不良反应。在尾静脉穿刺过程中，大鼠明显躁动不安，穿刺后恢复平稳，无术后不良反应。实验过程中未出现大鼠死亡情况。

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慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD，以下简称慢阻肺)是一种慢性气道炎症性疾病，主要是由于持续的慢性炎症反应导致肺泡壁破坏和肺泡囊变薄，进而引起呼吸困难和肺功能降低[1]。香烟烟雾是慢阻肺发生的主要危险因素，急性香烟烟雾暴露会引起肺部炎症和一些细胞因子的变化，从而导致肺损伤[2]。慢阻肺具有显著的临床、生活和经济影响[3]。尽管全球COVID-19大流行正在进行，但慢阻肺仍然是世界范围内的主要死亡原因之一。自从1998年启动以来，慢阻肺全球倡议(GOLD)对慢阻肺管理的建议侧重于减轻现有症状负担、降低未来恶化的风险和改善生活质量[4]。基于最新的指导原则和当前的临床证据，慢阻肺全球倡议支持支气管扩张剂作为慢阻肺的治疗基础，吸入性糖皮质激素+长效β2受体激动剂(ICS+LABA)应保留用于慢阻肺急性加重或血液中嗜酸性粒细胞计数增加的患者[5]。尽管有这些倡议，慢阻肺临床实践数据仍显示仍存在高度的治疗不足[6]。

近年来，干细胞特别是间充质干细胞在慢阻肺中的保护和损伤修复作用逐渐成为热点。间充质干细胞能够恢复组织损伤，促进再生，调节免疫反应，并维持组织稳态[7]。越来越多的证据表明，间充质干细胞的治疗益处部分取决于其衍生的细胞外囊泡[8]。间充质干细胞来源细胞外囊泡以旁分泌和内分泌的方式向免疫细胞、内皮细胞和肺泡上皮细胞传递蛋白质、脂质、DNA、mRNA和细胞器，发挥其调节作用[9]。细胞外囊泡通过改善呼吸功能、减少炎症细胞因子的产生和降低活化的巨噬细胞水平显示了其独特的优势[10]。外泌体作为细胞外囊泡的一种，已被证明可以治疗多种肺部疾病，包括支气管肺发育不良、急性呼吸窘迫综合征、哮喘、肺纤维化和肺动脉高压等[11-15]。在慢阻肺的发生发展中外泌体也发挥了不可替代的作用，包括肺部炎症、肺气肿和气道重塑等方面[16]。迄今为止，大多数关于外泌体治疗肺部疾病的临床前及临床试验都是静脉途径给药。对于肺部疾病，吸入给药通常是最直接和微创的给药途径[17]。因此该实验通过雾化吸入途径对慢阻肺模型大鼠进行骨髓间充质干细胞来源外泌体干预，探究雾化吸入是否为外泌体作用于慢阻肺的最佳途径，并进一步明确外泌体雾化制剂在慢阻肺气道炎症及肺损伤中的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   体外细胞培养及体内移植实验，首先进行大鼠骨髓间充质干细胞源外泌体的提取及鉴定，然后建立大鼠慢阻肺模型，再将外泌体通过雾化方式作用于慢阻肺模型，验证其对模型的作用。两组数据间的差异比较采用非配对t检验，多组数据间的差异比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2020年9月至2021年11月在沈阳医学院附属中心医院完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   4周龄雄性SD大鼠50只，SPF级，体质量为80-120 g，其中42只用于动物体内实验，8只用于骨髓间充质干细胞原代培养。以上大鼠均购于辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK(辽)2020-0001。

实验方案经沈阳医学院动物实验伦理委员会批准。批准号为研伦审第2020(35)号。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2   实验试剂   胎牛血清、DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)；无外泌体血清(美国System Biosciences公司)；1%青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；外泌体纯化试剂盒(辽宁润基生物科技有限公司)；兔抗大鼠CD63抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；兔抗大鼠CD9单克隆抗体(英国Abcam公司)；白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒(华美生物工程有限公司)；Masson三色染色试剂盒(武汉Servicebio公司)。
1.3.3   实验仪器   恒温CO2细胞培养箱(美国赛默飞公司)；酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)；FACS CANTO II流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；光学显微镜与照相系统(美国赛默飞公司)；JEM-1200EX透射电子显微镜(日本JEOL公司)；NanoSight NS300纳米颗粒跟踪分析仪(英国Malvern有限公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   骨髓间充质干细胞的提取及鉴定   应用全骨髓贴壁法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞[18]。麻醉剂采用3%戊巴比妥钠，过量腹腔注射处死大鼠后，立即放入体积分数为75%乙醇中浸泡15 min。在无菌条件下，用剪刀将大鼠的股骨、胫骨与肌肉组织完全分离，放入培养皿中，然后转至超净台中操作，培养皿中加入10 mL完全培养基(低糖DMEM/F12培养基中加入体积分数为10%胎牛血清及1%青/链霉素)，暴露骨髓腔，用无菌注射器吸取适量的培养基，从股骨和胫骨干骺端轻轻吹打骨髓腔，反复几次直至骨髓完全冲出，过滤后移至15 mL离心管中离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清，离心管中加入10 mL完全培养基，充分混匀后，将其接种至10 cm2培养皿中，并在37 ℃体积分数为CO2培养箱中常规培养。培养48 h后半量更换完全培养基，72 h后全量更换完全培养基，以去除非贴壁细胞。每次换液后在显微镜下观察细胞的生长状态。待细胞生长融合至约90%时，以1∶3的比例进行传代。

选用第3代骨髓间充质干细胞进行表面抗原检测，加入0.25%胰酶进行消化，将细胞悬液分装至EP管中，分别加入FITC-CD105，FITC-CD45和PE-CD73荧光标记的单克隆抗体，同时设立同型对照组和阴性对照组，4 ℃下避光反应20 min，PBS清洗，在流式细胞仪上进行检测分析。 

1.4.2   外泌体的提取   根据制造商的说明使用纯化试剂盒分离纯化外泌体，原理为分子排阻色谱纯化与亲和色谱浓缩相结合。选取第3代骨髓间充质干细胞用含无外泌体血清的培养基培养48 h，待细胞密度为2×106个细胞/10 cm培养皿时，收集细胞上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤并收集滤液，除去细胞碎片，以10 000×g离心30 min，上清液转移至10 kb超滤管中浓缩，在4 ℃下3 000×g超滤离心15 min，取1 mL细胞上清浓缩液加入SuperEV1.0超纯柱，用PBS洗脱柱子并在下方用离心管收集含有外泌体的馏分；向收集的外泌体馏分中加入1/10体积的结合缓冲液，颠倒摇匀后，继续加入200 μL结合树脂，1 500×g离心3 min，留取0.5 mL上清液混匀树脂；混匀后的树脂转移至纯化柱中，3 000×g离心2 min，弃去滤液，加入洗脱液洗脱外泌体，得到纯化浓缩后的外泌体悬液，用于后续检测。使用LABCONCO FreeZone 2.5 L冷冻干燥系统将冷冻的外泌体脱水至冻干粉，外泌体冻干粉可长期保存在4 ℃下，且生物活性不受影响，可用于后期动物实验干预治疗。
1.4.3   外泌体的鉴定

(1)透射电子显微镜观察外泌体的形态及大小：将20 μL外泌体悬液滴加在碳膜铜网上，并在室温下保持3-5 min，然后将多余的液体用滤纸条吸去；将2%磷钨酸滴加到碳膜铜网上负染，保持一两分钟，负染液用滤纸从侧面轻轻吸干，并在室温下干燥。将铜网转移到透射电子显微镜下观察和分析图像。

(2)纳米粒子跟踪分析仪检测外泌体的粒径分布：采用Nanosight NS300纳米粒径跟踪仪进行分析，用PBS将分离纯化后的外泌体沉淀进行1∶200稀释，用无菌注射器将稀释后的外泌体悬液上样至检测槽中，根据仪器记录的外泌体颗粒数再次调整外泌体的稀释倍数，待NTA软件自动分析计算。

(3)Western blot验证外泌体表面蛋白的表达：取50 μL外泌体悬液，加入适量的RIPA裂解液混匀，待充分裂解后，获得外泌体蛋白悬液，分装标记后冻存于-80 ℃备用。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒对外泌体蛋白进行定量检测。按照20 μL/孔进行上样，并加入5 μL预染蛋白Marker，先从100 V的电压试跑，观察跑胶速度和条带移动程度，调整电压大小，浓缩胶以80 V的电压电泳30 min，分离胶以100 V的电压电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底边缘；300 mA恒定电流转膜90 min，将目标蛋白转移至PVDF膜；室温下用5%TBST脱脂牛奶封闭1 h，然后将膜置于一抗稀释液中(CD9，CD63，均1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜；TBST漂洗PVDF膜3次，每次10 min；然后加入已稀释好的HRP标记的二抗，PVDF膜置于二抗中室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；将高敏ECL发光液A、B液等比例混匀，适量覆盖PVDF膜，曝光并采集图像。
1.4.4   动物模型建立   采用气道内滴注脂多糖联合熏烟的双重方式构建大鼠慢阻肺模型[19-20]，在第1天和第14天时滴注脂多糖，用3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠固定在操作台上，应用改装后的一次性静脉留置针在光源下行气管插管，尽量减少咽部黏膜损伤，沿着静脉留置针注入预先用PBS溶解的脂多糖(200 μL/200 μg)，然后将大鼠左右摇晃，使脂多糖充分作用于肺部。在第2-13天和第15-28天时进行熏烟，将盛放大鼠的鼠笼放入烟熏箱内(6只/箱)，燃烧10支香烟(焦油25 mg；一氧化碳13 mg；尼古丁1.1 mg)，每次大鼠在箱内停留时间约30 min，2次/d，2次熏烟间隔时间≥6 h。对照组大鼠气管内注射等量PBS。
1.4.5   实验分组   42只4周龄SD大鼠随机分为6组，每组7只。①低剂量外泌体雾化组：脂多糖滴注联合熏烟造模，第28天最后一次熏烟后的第2天开始雾化，雾化吸入外泌体悬液1 mL(0.5×108 particles/kg)；②中剂量外泌体雾化组：大鼠造模，第28天最后一次熏烟后的第2天开始雾化，雾化吸入外泌体悬液1 mL(1.0×108 particles/kg)；③高剂量外泌体雾化组：大鼠造模，第28天最后一次熏烟后的第2天开始雾化，雾化吸入外泌体悬液1 mL(1.5×108 particles/kg)；④外泌体尾静脉注射组：大鼠造模，第28天最后一次熏烟后的第2天开始注射，尾静脉注射外泌体悬液1 mL(1.5×108 particles/kg)；⑤模型组：脂多糖滴注联合熏烟造模，第28天最后一次熏烟后的第2天开始雾化，雾化1 mL PBS；⑥对照组：气管内滴注PBS和雾化1 mL PBS。各组连续干预5 d，每次雾化30 min。

外泌体的雾化装置选用振动筛孔雾化器，见图1。在造模第28天最后一次熏烟后的第2天开始雾化，将大鼠放入雾化箱内，将PBS(1 mL)或不同量的外泌体(0.5×108，1.0×108，1.5×108 particles/kg)在PBS中稀释(1 mL)，加至振动筛孔雾化器中雾化，持续30 min，并观察大鼠在雾化过程中有无不良反应，且持续观察大鼠的存活率。

1.4.6   肺功能检测   实验大鼠最后一次雾化或注射后的第2天开始检测，用小动物肺功能测定仪测定各组大鼠0.2 s用力呼气容积(FEV0.2)、0.3 s用力呼气容积(FEV0.3)、0.2 s用力呼气容积/用力肺活量(FEV0.2/FVC)、0.3 s用力呼气容积/用力肺活量(FEV0.3/FVC)、呼出25%用力肺活量时呼气流速(FEF25%)、呼出50%用力肺活量时呼气流速(FEF50%)、用力中期呼气流速(FEF25_75%)和用力最大呼气流速(PEF)。

采用3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，颈部正中皮肤剪开一小口，快速分离气管，在3，4软骨环处进行气管切开，插入匹配的气管插管，插入深度为5-10 cm，用手术缝线将气管插管与气管结扎，使待测大鼠的肺与体描箱隔离阻止肺内气体进入体描箱。注意每只大鼠气管切开的位置和气管插管都保持一致。将插管后的大鼠放在体描箱的支撑板上，然后将气管插管与体描箱的气体通路相连；关闭体描箱的封口，设置仪器的参数，并采集呼吸曲线和数据。
1.4.7   血清及支气管肺泡灌洗液中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平   肺功能检测完毕后暴露出大鼠腹腔脏器，分离出腹主动脉，采用2.5 mL注射器穿刺此动脉进行采血，缓慢注射至生化促凝管中并标记，室温静置0.5 h后，在4 ℃下3 000 r/min离心10 min，用巴氏管转移离心后的血上清至1.5 mL离心管中，标记后保存于-80 ℃冰箱中备用。血液标本采集完成后，将大鼠腹部切口延长至下颌部分，充分暴露并分离大鼠两侧肺组织及气管，右主支气管用止血钳夹住，用5 mL注射器抽取5 mL无菌4 ℃ 生理盐水缓慢经气管中下部注入左肺，每次注入结束后停留约10 s再回抽收集灌洗液，反复3次，回收率约为90%，在4 ℃下3 000 r/min离心10 min，离心后分离上清液，收集上清液至15 mL离心管中，保存于-80 ℃冰箱中备用。采用ELISA试剂盒检测大鼠血清及支气管肺泡灌洗液中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平。按照试剂盒详细步骤进行操作。
1.4.8   苏木精-伊红染色和Masson染色   分离大鼠右肺组织，将肺组织用刀片切成1 cm的薄片，经体积分数为4%甲醛溶液固定24 h后，按照标准组织学程序脱水、石蜡包埋后，连续切片，厚度为4 μm，然后切片用苏木精-伊红染色进行组织病理学评估，并且进行炎症评分：在双盲状态下，2名病理科医师在100倍光镜下观察各组织切片并评价肺血管炎症程度。炎症评分标准如下：0分，未见炎性细胞浸润；1分，少量炎性细胞浸润；2分，炎性细胞浸润较多，但少于视野1/2；炎性细胞浸润多，超过视野1/2(3分)；4分，大量炎性细胞浸润并聚集成团，几乎满视野。对评估结果进行统计分析。用Masson染色评估肺组织胶原沉积，并通过Image-pro plus 6.0软件分析图像，随机选取5个视野测量肺组织胶原纤维面积百分比。
1.5   主要观察指标   ①大鼠骨髓间充质干细胞及其外泌体的鉴定结果；②各组大鼠肺功能；③各组大鼠血清及支气管肺泡灌洗液中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平；④各组大鼠肺组织炎症改变及胶原沉积情况。
1.6   统计学分析   采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。数据以x±s表示。两组数据比较采用非配对t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过沈阳医学院生物统计学专家审核。

在空气污染、吸烟、饮食结构变化和高龄等多种危险因素的存在下，慢阻肺作为一种慢性气道炎症性疾病，其发病率和死亡率逐年增长，造成了巨大的社会影响和经济负担。探索一种安全有效的减轻肺部炎症损伤的治疗策略是慢阻肺研究领域迫切需要解决的重大课题。多项研究表明，间充质干细胞可以作为慢阻肺潜在的治疗策略。大量的临床前研究显示，间充质干细胞在抑制慢阻肺炎症反应[21-22]、纠正蛋白酶-抗蛋白酶失衡[23-24]、抗细胞凋亡[25-26]、抑制氧化应激等方面具有显著疗效[27-28]，大量临床试验已证实自体或同种异体间充质干细胞输入治疗肺部疾病的初步可行性和安全性[29-32]。不过值得警惕的是，近年来，有研究提出了一些与间充质干细胞治疗相关的安全问题[33]。移植间充质干细胞后不必要的分化及其可能的恶性转化已被确定为最重要的安全问题[33]。此外，炎症性肠病和特发性肺纤维化患者在其他免疫抑制剂治疗后注射间充质干细胞出现了严重的呼吸道感染和胃肠道感染[34-36]。同种异体间充质干细胞移植可能导致炎症恶化，因为间充质干细胞表达主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子，但在几个MHC-Ⅰ不匹配的受体中诱导了免疫反应的激活[37]，因此推测间充质干细胞移植在临床环境中仍然存在安全问题。

绝大多数基于间充质干细胞的有益作用依赖于间充质干细胞衍生的分泌物的免疫抑制、血管调节和营养因子活性[38]。此外，在接受间充质干细胞衍生分泌物治疗的动物和患者中未观察到与间充质干细胞临床应用相关的不良反应[33]。因此，间充质干细胞来源分泌物在临床应用上目前被认为是间充质干细胞的潜在替代品[38]。研究报告显示间充质干细胞的免疫调节功能和再生能力可被其所分泌的细胞外囊泡所模拟[39]。已有研究证明尾静脉注射间充质干细胞源外泌体可有效减少模型鼠的肺部炎症[14]、减轻肺气肿[40]、缓解气道重塑[41]、恢复受损的肺功能[40]。另外，在KIM等[24]的一项研究中发现人脂肪干细胞来源外泌体通过抑制肺泡巨噬细胞焦亡，有效减轻香烟烟雾诱导的气道黏液过度产生、肺部炎症和损伤。间充质干细胞源外泌体可能是香烟烟雾诱导的肺部炎症和损伤的一种有前途的无细胞治疗候选药物。

近年来，人们对使用更安全、更有效的给药途径治疗呼吸系统疾病越来越感兴趣[42]。关于干细胞雾化在治疗呼吸系统疾病中收获颇丰。雾化形式的干细胞在肺部可保持高有效性和高分布[43-44]，将通过静脉给药可能发生的细胞丢失和形态学改变的风险降至最低。目前关于雾化外泌体的研究甚少，但确有一些研究取得了成效，例如DINH等[45]采用肺球体细胞分泌体和外泌体雾化吸入途径，治疗不同肺损伤及纤维化模型。在疾病模型的纤维化阶段，开始以10 mg/kg分泌蛋白(10×109 particles/kg)或等体积的PBS雾化吸入对模型小鼠进行干预，疗程为7 d，每次约30 min，结果显示，肺球体细胞分泌体和外泌体具有优于间充质干细胞来源外泌体及细胞本身的保护和再生能力；雾化肺球体细胞分泌体和外泌体可以通过保留肺泡上皮结构、减少胶原沉积和纤维化来减轻博来霉素和二氧化硅诱导的肺纤维化。BARI等[46]首次提出间充质干细胞分泌体可以配制成吸入雾化药物应用于COVID-19肺炎患者。在一项临床试验(NCT04276987 )中[47]，将异体脂肪间充质干细胞源外泌体用作吸入气雾剂治疗COVID-19肺炎重症患者，24例受试者在接受基础治疗后，5次气溶胶吸入间充质干细胞源外泌体(第1，2，3，4，5天2×108纳米囊泡)，但试验结果尚未公布。以上研究表明临床相关的雾化器系统可能适用于未来的外泌体制剂。

在很多研究中，尽管外泌体已被大胆尝试应用于临床试验中，但其最佳作用途径及最低有效剂量仍然不明确，仍需要大量的临床前研究进一步探索及验证。该研究探讨了慢阻肺大鼠模型尾静脉注射和雾化吸入骨髓间充质干细胞源外泌体对气道炎症及肺损伤的影响，且进一步明确雾化途径的最佳给药剂量，结果显示，雾化吸入的骨髓间充质干细胞源外泌体显著改善了慢阻肺模型大鼠的肺功能减退、肺组织的胶原沉积及炎性损伤，减少了血清及肺泡灌洗液中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α表达，且总体治疗效果优于静脉途径应用的外泌体。该研究选择雾化吸入作为主要给药途径，允许低剂量外泌体直达肺部快速吸收，并可能防止这些生物分子在受损微循环中的聚集[48]。相比之下，静脉途径给药，其靶点通常不在血液或血浆中，药物必须分布到靶器官起效。但血液及肺组织之间无明确的药物结合转运蛋白或相关屏障，而且大多数静脉注射的外泌体会在单核吞噬细胞系统活跃的肝脏、脾脏和肺部积聚[49]，这意味着药物的血浆浓度不能保证肺浓度，在肺部损伤部位的实际作用量远小于给药量。最佳吸入药物与良好的雾化装置相结合，可使药物充分发挥作用。

目前临床常用雾化器有3种类型：喷射雾化器、振动筛孔雾化器和超声波雾化器。喷射雾化器具有几个局限性，例如药物溶解度差、无法提供准确和一致的药物，且对药物具有一定的破坏性[50]。振动筛孔式雾化器不具有相同的技术局限性，可能是外泌体最合适的选择。此外，目前关于气溶胶间充质干细胞及间充质干细胞源外泌体的大多数文献都使用振动筛孔雾化器[51]，在此次实验中也选择了振动筛孔雾化器，尽可能保证外泌体的稳定性和有效性。关于雾化剂量方面，采用3种剂量对比观察外泌体治疗慢阻肺的效果，结果显示，较低剂量(0.5×108 particles/kg)的应用对于改善大鼠肺功能、减轻炎症反应和减少胶原沉积方面效果更佳，而应用中剂量(1×108 particles/kg)和高剂量(1.5×108 particles/kg)的效果较弱，这一发现与SHI等[52]观点大体一致，表明适当的剂量是间充质干细胞源外泌体发挥作用的必备条件。不同剂量外泌体影响治疗效果的药物因素可能包括外泌体的药代动力学、与受体结合情况、肺部蓄积程度等多种因素。当然非药物因素的影响并不能排除，例如大鼠不同个体间肺细胞转运蛋白的表达存在差异；不同的呼吸形式影响气溶胶沉积，呼吸频率快且吸气容积小时，肺内沉积较少；不同大鼠的呼吸系统特征可影响气溶胶在呼吸道的输送，当气道的炎症损伤程度不同时，吸入的气溶胶在呼吸系统的分布不均一，从而使临床疗效下降。因此外泌体雾化吸入的药代动力学、在肺内的分布及作用方式等问题还未明晰，可想而知，在干细胞来源外泌体可以广泛用于临床实践之前，还有很多实验工作要做。

综上所述，该研究表明雾化间充质干细胞源外泌体可以有效治疗脂多糖及香烟烟雾诱导的慢阻肺大鼠模型，使模型大鼠的肺功能、肺局部和全身的炎症反应、肺组织病理损伤及胶原沉积明显缓解。此次实验结果为促进雾化间充质干细胞源外泌体在慢阻肺中的未来临床应用提供了初步证据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
外泌体：是各种类型细胞分泌的纳米级(40-100 nm)膜囊泡。作为一种细胞间通讯工具，可将其内容物从供体细胞转移到受体细胞来传递信息。
慢性阻塞性肺疾病：是一种复杂的高度异质性呼吸系统疾病，特征为慢性气道炎症、不可逆的气流受限和肺功能严重受损。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

慢性阻塞性肺疾病(以下简称慢阻肺)是全世界死亡和发病的主要原因，其特征是不完全可逆的气流受限、失调的慢性炎症和肺气肿性破坏，尽管慢阻肺是一个稳步增长的全球医疗保健问题，但传统的药物疗法仍然是姑息性的。近年来，外泌体在呼吸系统疾病中的作用受到越来越多的关注，有研究表明通过尾静脉注射外泌体减少了中性粒细胞等肺中炎症细胞的积累，从而减轻了肺气肿，另一项研究发现雾化吸入间充质干细胞外泌体可降低肺部炎症反应并减轻肺组织病理损伤。尽管目前已开展许多外泌体治疗肺疾病的相关研究，但外泌体最佳作用途径及最低有效剂量仍然不明确。该研究旨在探索雾化间充质干细胞外泌体在慢阻肺大鼠模型中的炎性损伤修复作用及最佳剂量，且明确与静脉途径相比治疗慢阻肺的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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