跟腱全切断联合皮肤烫伤与单纯跟腱全切断诱导小鼠创伤性异位骨化的比较

doi:10.12307/2023.432

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (17): 2664-2668.doi: 10.12307/2023.432

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇

跟腱全切断联合皮肤烫伤与单纯跟腱全切断诱导小鼠创伤性异位骨化的比较

王正1，陈泓书2，易新泽宇1，李宗焕1

1武汉大学中南医院创伤与显微骨科，湖北省武汉市 430071；2黄州总医院骨科，湖北省黄冈市 438000

收稿日期:2022-06-17 接受日期:2022-07-21 出版日期:2023-06-18 发布日期:2022-10-24
通讯作者: 李宗焕，博士，副主任医师，武汉大学中南医院创伤与显微骨科，湖北省武汉市 430071
作者简介:王正，男，1994年生，河南省信阳市人，汉族，武汉大学中南医院创伤与显微骨科在读博士，主要从事创伤与显微修复研究。
基金资助:
武汉大学中南医院优势学科项目(XKJS202006)，项目负责人：李宗焕

Comparative study of traumatic heterotopic ossification in mice induced by Achilles tenotomy combined with skin burn injury and single Achilles tenotomy

Wang Zheng1, Chen Hongshu2, Yi Xinzeyu1, Li Zonghuan1

1Department of Orthopedics Trauma and Microsurgery, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei Province, China; 2Department of Orthopedics, Huangzhou General Hospital, Huanggang 438000, Hubei Province, China

Received:2022-06-17 Accepted:2022-07-21 Online:2023-06-18 Published:2022-10-24
Contact: Li Zonghuan, MD, Associate chief physician, Department of Orthopedics Trauma and Microsurgery, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei Province, China
About author:Wang Zheng, MD candidate, Department of Orthopedics Trauma and Microsurgery, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei Province, China
Supported by:
the Superior Discipline Project of Zhongnan Hospital of Wuhan University, No. XKJS202006 (to LZH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
异位骨化：是指在肌肉、肌腱、韧带等软组织内形成骨组织的一种病理现象，多发生于骨折、关节置换、脊髓损伤、脑损伤等之后，好发于髋、肘和膝关节周围。
跟腱：哺乳动物小腿腓肠肌和比目鱼肌的肌腹下端移行的腱性结构，止于跟骨结节，是人体最粗大的肌腱，对机体行走、站立和维持平衡有着重要的意义。

背景：目前创伤性异位骨化动物模型主要为跟腱全切断模型，但异位骨形成时间较长、体积较小，并且无法准确地再现临床中大多数创伤性异位骨化病例的全身炎症状态。
目的：验证跟腱全切断联合皮肤烫伤建立创伤性异位骨化动物模型的有效性，并将其与单纯跟腱全切断对比，评价两种方法的实用性。
方法：利用随机数字表法，将40只雄性C57BL/6小鼠随机分为2组，对照组(n=20)进行单纯跟腱全切断手术，实验组(n=20)进行跟腱全切断手术+背部30%皮肤烫伤处理。记录两组小鼠存活率和跟腱部位手术伤口愈合情况，以及实验组小鼠背部烫伤皮肤恢复情况。术后8周行跟腱micro-CT检查及Masson 染色，观察手术部位异位骨形成情况。
结果与结论：①术后两组小鼠均无死亡，伤口愈合良好，实验组小鼠烫伤皮肤恢复良好；②micro-CT显示，实验组小鼠全部出现创伤性异位骨化，跟腱部位可见明显的类圆形高密度影，异位骨体积为(2.72±0.04) mm3；对照组仅17只小鼠跟腱部位出现创伤性异位骨化，异位骨体积为(0.65±0.08) mm3；两组小鼠异位骨体积比较差异有显著性意义(P < 0.05)；③Masson 染色显示，两组小鼠形成的异位骨均具有骨小梁和骨髓结构，实验组异位骨面积大于对照组(P < 0.05)；④结果表明，跟腱全切断联合皮肤烫伤能有效建立小鼠创伤性异位骨化模型，与单纯跟健全切断相比，该方法不仅能较早诱导小鼠创伤性异位骨化，且成功率更高，所形成的异位骨体积更大，是动物创伤性异位骨化模型建立的理想方法。
https://orcid.org/0000-0002-1176-7659(王正)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 创伤性异位骨化, 动物模型, 跟腱切断, 皮肤烫伤, 炎症

Abstract: BACKGROUND: At present, Achilles tenotomy model is an animal model mainly used for traumatic heterotopic ossification. However, this method requires a long time to form ectopic bone, and the size of the formed ectopic bone is always small. In addition, this method cannot accurately reproduce the systemic inflammatory state of most traumatic heterotopic ossification cases in clinic practice.
OBJECTIVE: To verify the validity of the animal model of traumatic heterotopic ossification induced by Achilles tenotomy combined with skin burn injury, to compare this approach with single Achilles tenotomy, and to evaluate the practicability of the two methods.
METHODS: Forty male C57BL/6 mice were randomly divided into two groups: Achilles tenotomy group (control group, n=20) and Achilles tenotomy+30% skin scald on the back group (experimental group, n=20). The survival rate and healing of surgical incisions of the mice in the two groups were recorded. Survival rate and wound healing in the two groups as well as skin recovery of burn injury in the experimental group were recorded. Micro-CT examination and Masson staining of the Achilles tendon was performed 8 weeks after surgery to observe the ectopic bone at the surgical site. Formation of ectopic bone was also observed in the two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no death and wound infection in the two groups. The skin burn injury in the experimental group recovered well without ulceration. Micro-CT findings indicated that all mice in the experimental group developed traumatic heterotopic ossification, with obvious circular high-density shadow at the surgical site, and the volume of ectopic bone was (2.72±0.04) mm3. In contrast, only 17 mice developed traumatic heterotopic ossification in the control group, and the volume of ectopic bone was (0.65±0.08) mm3. There was a significant difference in the volume of ectopic bone between the two groups (P < 0.05). Masson staining showed that ectopic bone in both groups had bone trabecular and bone marrow structures, but the area of ectopic bone in the experimental group was significantly larger than that in the control group (P < 0.05). To conclude, Achilles tenotomy combined with skin burn injury can effectively induce traumatic heterotopic ossification earlier than single Achilles tenotomy in mice. This combination method has a higher successful rate and can produce larger size of ectopic bone, which can be an ideal method to establish an animal model of traumatic heterotopic ossification.

Key words: traumatic heterotopic ossification, animal model, Achilles tenotomy, burn injury, inflammation

中图分类号:

王正, 陈泓书, 易新泽宇, 李宗焕. 跟腱全切断联合皮肤烫伤与单纯跟腱全切断诱导小鼠创伤性异位骨化的比较[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(17): 2664-2668.

Wang Zheng, Chen Hongshu, Yi Xinzeyu, Li Zonghuan. Comparative study of traumatic heterotopic ossification in mice induced by Achilles tenotomy combined with skin burn injury and single Achilles tenotomy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(17): 2664-2668.

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引言

创伤性异位骨化指在创伤后正常情况下不具有骨化性质的组织中，出现具有成熟板层骨结构的骨组织[1]，是获得性异位骨化中最常见的类型。创伤性异位骨化发生率较高，软组织的运动损伤、中枢神经系统损伤、全髋关节置换、肘部损伤及烧伤均可能导致创伤性异位骨化[2]。创伤性异位骨化会引起肢体局部疼痛、肿胀，甚至侵犯神经，并对肌肉结构及功能产生影响，导致关节活动受限[3]。目前，由于创伤性异位骨化的病理生理机制尚未完全阐明，因此其预防和治疗措施相对有限，包括非类固醇抗炎药物、放疗或手术切除已经形成的骨等，但效果均不甚满意[4]。
动物模型是研究骨形态结构及生长代谢特点的有利工具，通过动物模型模拟异位骨化的发生发展过程，对于研究疾病的机制及诊疗手段至关重要。跟腱全切断是目前最常用的诱导创伤性异位骨化的方法，但此方法异位骨形成时间较长且体积较小[5]。此外，创伤性异位骨化的形成是全身炎症和局部创伤反应共同作用于机体的结果[6-7]，而单纯跟腱全切断模型尚不能准确地再现临床中大多数创伤性异位骨化病例的全身炎症状态。近期有学者在单纯跟腱全切断模型的基础上，建立了跟腱全切断联合皮肤烫伤诱导创伤性异位骨化的方法，为创伤性异位骨化的发生创造了2个关键条件：局部创伤和全身炎症，更加接近创伤性异位骨化患者体内的病理生理状态[8-9]。然而，该方法与单纯跟腱全切断法的比较性研究仍较少。因此，此次实验旨在对比跟腱全切断联合皮肤烫伤与单纯跟腱全切断诱导小鼠创伤性异位骨化的效果，为创伤性异位骨化动物模型的选择提供理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，统计方法为独立样本t 检验。
1.2 时间及地点实验于2018年8月在武汉大学动物实验中心及中南医院医学科学研究中心开展。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 40只雄性C57BL/6小鼠，6-8周龄，SPF 级，体质量18-21 g，平均20 g，由武汉大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK(鄂)2020-0025。每笼饲养3只，饲养室温度为 20-25 ℃，湿度30%-70%，光照昼夜交替12 h。所有实验方案均通过武汉大学中南医院动物伦理委员会批准通过后实施，批准号：ZN2021153。
1.3.2 试剂及仪器戊巴比妥钠(美国Sigma公司)，临用前用生理盐水配制成1%戊巴比妥钠溶液；水浴锅(常州越新仪器制造公司)；注射用青霉素钠(华北制药)；注射用美洛昔康(德国勃林格殷格翰公司)；小动物micro-CT(德国布鲁克公司)；多聚甲醛(合肥兰杰柯科技有限公司)；Masson染色试剂盒(武汉佰仟度公司)。
1.4 方法
1.4.1 实验分组及创伤性异位骨化造模利用随机数字表法将40只小鼠随机分为2组：对照组(n=20)进行单纯跟腱全切断手术，实验组(n=20)进行跟腱全切断手术+背部30%皮肤烫伤处理。跟腱切断均在左小腿实施。用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(5 mL/kg)。麻醉成功后俯卧位固定，对照组小鼠左小腿脱毛，实验组小鼠左小腿及背部脱毛，暴露手术部位和背部拟烫伤皮肤。
对照组：无菌条件下，于踝关节后侧跟腱处皮肤做一纵行切口，长约0.5 cm，暴露并钝性分离跟腱，于跟腱中部将其剪断，同时避免损伤周围软组织。跟腱不予缝合，伤口止血后缝合皮肤(图1A)。

实验组：跟健全切断手术步骤同对照组，完成后行背部皮肤烫伤处理。将一2 cm×2 cm×3 cm 金属铝块置于60 ℃水浴中加热10 min，于小鼠背部面积约2 cm×3 cm 的皮肤处接触17 s(图1B)。为了实现所有小鼠皮肤烫伤深度的一致性，确保整个铝块的最大表面接触小鼠；同时避免施加额外压力，铝块保持无额外加压状态。该步骤将在6-8周龄的C57BL/6小鼠身上造成大约30%的全身表面烫伤[10]。

术后处理：术后连续3 d肌肉注射青霉素(2×105 U)预防感染，肌肉注射美洛昔康(0.2 mg/kg)预防疼痛，常规饲养、观察。

1.4.2 两组小鼠一般情况观察术后记录两组小鼠的存活率和跟腱部位手术伤口愈合情况。此外，观察实验组小鼠背部烫伤皮肤的恢复情况。

1.5 主要观察指标
1.5.1 跟腱损伤部位micro-CT 扫描术后8 周小鼠麻醉后行手术部位micro-CT检查，观察有无创伤性异位骨化形成。打开micro-CT 扫描软件，使用以下参数获取图像：扫描电压80 kV，电流500 μA，曝光时间1.3 s，扫描层面为48 μm。由专业影像学技术人员对micro-CT 图像进行解析，使用软件将单个标本分离，以包含创伤性异位骨化域的阈值重建创伤性异位骨化部分，并计算异位骨体积。
1.5.2 跟腱损伤部位组织学检查术后8周麻醉后断颈法处死小鼠，离断膝关节后小腿以下肢体取材。然后用体积分数10%的中性甲醛固定24 h，15%的EDTA脱钙1周，脱钙完全后梯度乙醇脱水，透明石蜡包埋，制成5 μm厚切片。Masson染色步骤：将石蜡切片于Bonin液中脱水包埋后脱蜡至蒸馏水中，用Weigert 铁苏木精染色10 min 后用蒸馏水冲洗，再用1%的盐酸乙醇分化后冲洗，丽春红酸性品红溶液染色10 min后冲洗，1%的磷钼酸溶液染色10 min，再用2%醋酸苯胺蓝溶液染色5 min，1%冰醋酸处理2 min，再用Ⅰ、Ⅱ无水乙醇脱水3次，每次2 min，Ⅰ、Ⅱ二甲苯透明3 min，封固干燥后光镜观察。采用Image-J 1.8 图像分析软件计算异位骨面积。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 7.0 统计软件进行处理。统计数据用x±s表示，采用独立样本t检验对采集的数据进行分析。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经武汉大学中南医院生物统计学专家审核。

讨论

由于创伤性异位骨化形成机制不明，而可靠的、标准化的动物模型是探讨创伤性异位骨化形成机制的有效工具，为此，众多学者提出了多种建模方法。目前，有关创伤性异位骨化动物模型主要分为以下几类：关节固定模型[11]；异位植入骨基质或骨形成发生蛋白模型[12]；肌肉损伤联合局部骨形成发生蛋白植入模型；髋关节损伤模型[13-14]；肢体爆炸性截肢模型[15]；单纯跟腱全切断模型等[16]。除了跟腱全切断模型，其他几种造模方法被认为缺少客观可控性、可靠性和重复性，结果变化大，因此尚未被广泛应用[17]。虽然创伤性异位骨化的金标准模型尚未达成共识，但在动物研究中，跟腱全切断仍是一种最为常用的诱导创伤性异位骨化的方法，这主要是因为动物模型中跟腱全切断术后诱导的异位骨化和骨科患者创伤后的异位骨化均由急性创伤诱发，且软骨内骨化是二者的共同病理特征[18]。此次实验比较了一种新的创伤性异位骨化造模方法——跟腱全切断联合皮肤烫伤与单纯跟腱全切断诱导小鼠创伤性异位骨化的模型结局，最终发现跟腱全切断联合皮肤烫伤能够较早通过软骨内骨化诱导小鼠创伤性异位骨化，并且成功率更高，模型所形成的异位骨质体积更大。
跟腱全切断模型最早由BUCK[19]于1953年提出，是目前针对创伤性异位骨化机制及相关治疗性实验研究最常应用的方法。1983年MCCLURE [20]重复此项实验结果显示，术后5周创伤性异位骨化发生率仅为60%，至术后10周才能100%发展为创伤性异位骨化。因此，跟腱全切断诱导创伤性异位骨化时间较长，短期内造模成功率较低。在此次实验中，实验组小鼠术后8周即可100%诱导创伤性异位骨化，而对照组发生创伤性异位骨化的概率仅为85%，并且实验组形成的异位骨体积明显大于对照组。对于动物研究，少量的骨质可能无法满足某些实验的要求，因为较小的骨质易包裹于软组织中，取材过程中难以发现，甚至取下的骨质量不足以满足实验指标的检测。而通过跟腱全切断联合皮肤烫伤诱导的创伤性异位骨化体积较大，这使得研究者能够在动物数量较少的情况下得到较多的创伤性异位骨化标本，可显著减少实验所需的动物样本量。既往研究表明创伤性异位骨化形成经历骨形成和骨重塑阶段，与骨痂形成的组织学过程一致，但与肌肉等软组织因出血导致钙化成骨的骨化性肌炎有显著差异[21]。此次实验中，实验组和对照组所形成的异位骨均具有骨小梁和骨髓结构，表明其均为软骨内成骨形成，证明背部皮肤烫伤在促进异位骨形成的过程中并未改变骨形成方式。此外，此次实验选择30%的皮肤烫伤面积并不影响小鼠的存活率，实验过程中无小鼠死亡，烫伤部位皮肤无破溃，造模后1周内皮肤恢复正常并有新毛长出，表明通过跟腱全切断术联合皮肤烫伤诱导创伤性异位骨化是安全有效的。
炎症反应在创伤性异位骨化形成中具有至关重要的作
用[6，22]。骨折、软组织损伤以及出血均会促发局部性和全身性的炎症反应，而炎症反应同时又诱导巨噬细胞分泌属于转化生长因子β家族成员的骨形成发生蛋白，骨形成发生蛋白聚集到受损的软组织处后激活骨形成发生蛋白信号通路，诱发创伤性异位骨化的形成[5，23-24]。此外，研究证实内皮前体细胞能够响应周围炎性反应，通过软骨内途径分化在创伤性异位骨化形成过程中的每个阶段都发挥作用[25-26]。由此可见，创伤性异位骨化的形成是全身炎症和局部创伤反应共同作用于机体的结果，而单纯跟腱全切断模型尚不能准确地再现临床中大多数创伤性异位骨化病例的全身炎症状态。已有研究表明，烧伤导致的炎症反应对全基因组表达谱分析和远离烧伤部位的器官(如心脏)均有影响[27-28]。临床上，虽然异位骨化在所有烧伤患者中总发生率低于5%，但在严重烧伤中这一发生率超过50%[29-30]。因此，烧伤引起的炎症也会对跟腱损伤部位的间充质干细胞成骨分化产生作用，进而加速异位骨化的发生。通过动物实验也发现，烧伤能够促进皮下含细胞的成骨支架的异位骨形成，并且体表烧伤面积超过30%后并发异位骨化的概率明显增大[7]。研究表明烧伤后的炎症反应会导致血液中转化生长因子β的升高，转化生长因子β在间充质干细胞和骨祖细胞的早期成骨分化中发挥重要的促进作用[30-31]。因此，通过跟腱全切断术联合30%皮肤烫伤为异位骨化的发生创造了2个关键条件：局部创伤和全身炎症。烫伤导致的全身炎症反应显著增加了跟腱损伤部位异位骨化的形成，并加速了其发展进程。因此，跟腱全切断联合皮肤烫伤也更能模拟临床创伤性异位骨化病例的病理生理特点，有利于创伤性异位骨化的机制研究。
综上，跟腱全切断联合皮肤烫伤相比传统的单纯跟腱全切断能够较早诱导小鼠创伤性异位骨化，并且成功率更高，模型所形成的异位骨体积更大，对早期诊断，尤其是为判断骨化的活动程度奠定了基础。此外，此模型更能模拟临床中创伤性异位骨化患者的病理生理状态，有利于对创伤性异位骨化的发病机制以及治疗手段研究。
实验的不足：由于雄性动物发生烧伤后异位骨化的概率远高于雌性动物[32]，为了避免性别对实验造成误差，仅选用了雄性小鼠，有必要验证在雌性小鼠模型中是否能够得出相同的结论；此外，仅选择8周时间节点进行micro-CT和组织病理学检查，未进行每周检测，因此尚不能精确地监测异位骨形成过程。后续实验将扩大动物样本量并设置更多的检测时间点，丰富实验数据，使得结论更加可靠。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

跟腱全切断联合皮肤烫伤与单纯跟腱全切断诱导小鼠创伤性异位骨化的比较

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