2.1   人牙周膜干细胞的形态   原代培养5-10 d，可见人牙周膜细胞从牙周膜组织周围爬出，呈放射状生长，见图1A。传代后，人牙周膜干细胞表现为成纤维细胞样，呈长梭形或纺锤形，漩涡状生长，见图1B。



2.2   人牙周膜干细胞的鉴定结果   
2.2.1   流式细胞术分析细胞表面标志物   细胞阳性表达间充质干细胞特异性标志物CD73(99.92%)、CD90(99.68%)和CD105(99.99%)，阴性表达造血细胞标志物CD34(0.46%)和泛白细胞标志物CD45(0.09%)，见图2，证实培养细胞为间充质来源。




2.2.2   多向分化能力   成骨诱导21 d后，茜素红S染色可见红色矿化结节，见图3A，证实培养细胞具有成骨分化能力。成脂诱导21 d后，油红O染色可见红色脂滴，见图3B，证实培养细胞具有成脂分化能力。



2.3   大麻二酚对人牙周膜干细胞增殖能力的影响    培养前5 d所有浓度的大麻二酚对牙周膜干细胞增殖均无明显影响(P > 0.05)；在第7天，0.5 μmol/L和2.5 μmol/L大麻二酚显著增强了人牙周膜干细胞增殖活性(P < 0.05)，且促进作用随大麻二酚浓度升高而增强，并在2.5 μmol/L达到高峰，而12.5 μmol/L大麻二酚对细胞增殖具有明显抑制作用(P < 0.05)，见图4。




2.4   大麻二酚对人牙周膜干细胞成骨分化的影响   
2.4.1   碱性磷酸酶活性   成骨诱导14 d后对细胞碱性磷酸酶活性进行测定。与对照组相比，大麻二酚组碱性磷酸酶活性均显著增强(P < 0.05)。该增强作用表现出浓度依赖性，2.5 μmol/L大麻二酚处理后细胞碱性磷酸酶活性增强了约0.8倍，明显强于0.1，0.5 μmol/L大麻二酚组(P < 0.05)，见图5。



2.4.2   茜素红染色及半定量分析   成骨诱导21 d后进行茜素红S染色，随着大麻二酚浓度增高，染色面积逐渐加大、颜色逐渐加深加厚，红色矿化结节数量逐渐增多，表明钙盐沉积量逐渐增多，见图6A。脱色后对钙盐沉积量进行半定量分析，与对照组相比，0.1，0.5，2.5 μmol/L大麻二酚组钙盐含量均显著增多(P < 0.05)，其中2.5 μmol/L大麻二酚作用效果最为显著(P < 0.05)，矿物沉积量较对照组增加了约0.4倍，见图6B。



2.4.3   成骨相关基因表达   成骨诱导7 d后，通过qPCR检测成骨相关基因COL1、OCN和RUNX2的mRNA表达。与对照组相比，所有大麻二酚组COL1、OCN和RUNX2的mRNA表达水平均显著上调(P < 0.05)。对于COL1基因，0.5 μmol/L大麻二酚组mRNA表达水平升高至对照组的(1.791±0.026)倍，明显高于0.1，2.5 μmol/L大麻二酚组(P < 0.05)。对于OCN基因，2.5 μmol/L大麻二酚组mRNA表达水平升高至对照组的(2.504±0.280)倍，明显高于0.1 μmol/L大麻二酚组(P < 0.05)，但与0.5 μmol/L大麻二酚组无明显差异(P > 0.05)。对于RUNX2基因，2.5 μmol/L大麻二酚组mRNA表达水平升高至对照组的(1.830±0.052)倍，明显高于0.1 μmol/L大麻二酚组(P < 0.05)，但与0.5 μmol/L大麻二酚组无明显差异(P > 0.05)。此外，还分析了β-catenin的mRNA表达水平以评估大麻二酚对Wnt/β-catenin信号通路的影响，大麻二酚显著上调了β-catenin的mRNA表达水平(P < 0.05)，2.5 μmol/L大麻二酚组mRNA表达水平升高至对照组的(1.300±0.045)倍，明显高于0.1，0.5 μmol/L大麻二酚组(P < 0.05)，见图7。

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牙周炎是一种以牙周支持组织破坏为特征的慢性炎症性疾病，其中重度牙周炎被认为是全球第六大流行病[1]。随着牙周炎病情进展，可导致牙齿松动、移位甚至脱落，对患者的咀嚼、发音和美观产生负面影响。目前常用的治疗方法虽然可以控制炎症进展，防止牙槽骨进一步吸收，但不能有效修复已造成的牙槽骨缺损[2]，而以种子细胞为核心的干细胞疗法和组织工程方法为缺损组织修复提供了新的治疗策略[3]。牙周膜干细胞是牙周膜细胞群中一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，具有较强的增殖和抗凋亡能力，被认为是牙周组织再生和骨组织再生中最具潜力的种子细胞[4-5]。但在牙周组织修复过程中，由于干细胞数量不足以及受到炎症的影响，牙周组织再生能力往往无法满足治疗的需要[6]。因此，如何增加牙周膜干细胞数量并提升其增殖与成骨能力是牙周组织再生目前需要解决的重要问题。

近年来，植物提取物、药物和生长因子等对细胞增殖和骨质代谢具有调节作用的生物活性分子受到越来越多学者的关注，这些生物活性分子将内源细胞引导到缺损部位并增强内外源细胞的活力，为其创造有利的成骨微环境，可有效促进骨组织再生[7]。大麻二酚是大麻的主要活性成分之一，与精神活性成分Δ9-四氢大麻酚不同，它不对人的精神或心理功能产生影响[8]；此外，大麻二酚具有抗炎、抗氧化等药理活性[9]，在炎症、神经退行性疾病、自身免疫性疾病、癫痫、癌症等疾病模型中表现出治疗潜力，已被FDA批准用于治疗顽固性癫痫[10-11]。最近研究发现，大麻二酚还能促进骨骼损伤的愈合与修复[12-13]，减轻疾病状态下的骨质流失[14-15]，对多种细胞具有成骨促进作用。KANG等[16]发现大麻二酚通过激活p38 MAPK通路，能有效促进前成骨细胞U2OS和MG-63成骨分化。SCHMUHL等[17]研究表明大麻二酚通过激活细胞中CB2受体、抑制GPR55受体，进而激活p42/44 MAPK通路，促进脂肪间充质干细胞迁移并诱导其成骨分化。在另一项研究中，大麻二酚明显增强了人牙髓细胞的增殖活性和成牙、成骨分化能力[18]。由于大麻二酚具有抗炎、抗氧化和促进骨愈合的多重特性，在骨组织工程中展现出巨大的应用潜力，但其对人牙周膜干细胞的影响尚不明确。该实验探讨不同浓度大麻二酚对人牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响，以期为大麻二酚应用于牙周组织和骨组织再生提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   人牙周膜干细胞在不同浓度大麻二酚作用下增殖和成骨分化能力的体外观察实验，采用方差分析进行组间比较。
1.2   时间及地点   实验于2020年12月至2021年9月在吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室完成。
1.3   材料   α-MEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青霉素-链霉素、磷酸盐缓冲液(Hyclone，美国)；抗坏血酸、地塞米松、吲哚美辛、大麻二酚(Sigma，美国)；β-甘油磷酸钠、1%茜素红S染液、油红O染液(索莱宝，中国)；氯化十六烷吡啶单水合物(阿拉丁，中国)；胰岛素(酷来搏，中国)；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(普西唐，中国)；小鼠抗人CD45-PE(BioLegend，美国)；小鼠抗人CD34-PE、小鼠抗人CD73-PE、小鼠抗人CD90-PE、小鼠抗人CD105-PE、小鼠IgG1同型对照-PE(eBioscience，美国)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液(碧云天，中国)；碱性磷酸酶测定试剂盒(南京建成，中国)；总RNA提取试剂盒(成都福际，中国)；CCK-8试剂盒、Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)、Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(翌圣，中国)；引物(生工，中国)；CO2恒温细胞培养箱(SANYO，日本)；qPCR仪(Bio-Rad，美国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；酶标仪(Bio-TEK，美国)；分光光度计(Thermo Scientific，美国)；流式细胞仪(BD，美 国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   人牙周膜干细胞的分离培养   牙周膜样本取自就诊于吉林大学口腔医院的12-18岁正畸拔牙患者的健康前磨牙，患者及监护人同意参与研究项目并签署知情同意书，该研究所有实验程序均经吉林大学口腔医院医学伦理委员会批准，批准号(2021年临审第65号)。
拔出的牙齿储存在含5%青霉素-链霉素的α-MEM培养基中，4 ℃保存并于2 h内取材。在超净工作台中用大量生理盐水冲洗牙根，无菌刀片刮取根中1/3的牙周膜组织，切成小块平铺于培养瓶中，倒置培养瓶并加入4 mL完全培养基(含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的α-MEM培养基)，在37 ℃、体积分数为5% CO2饱和湿度培养箱中培养，3 h后翻转培养瓶使培养基浸没组织块，每三四天换液1次。原代细胞培养15-20 d后，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化传代，此后细胞融合度达到80%-90%时按1∶3比例传代。后续实验使用第3-6代细胞。
1.4.2   人牙周膜干细胞的鉴定  
(1)流式细胞术分析细胞表面标志物：取第3代人牙周膜干细胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化并用PBS洗涤2次，调整细胞浓度为5×109 L-1。将细胞分为6组，每组100 μL细胞悬液，分别加入5 μL与PE荧光偶联的单克隆抗体(小鼠抗人CD34、小鼠抗人CD45、小鼠抗人CD73、小鼠抗人CD90、小鼠抗人CD105和小鼠IgG1同型对照)，冰上避光孵育15 min，PBS洗涤2次后加入300 μL PBS重悬，流式细胞仪分析细胞表面标志物。
(2)成骨分化能力检测：将第3代细胞以8×104个/孔的密度接种在6孔板中，待细胞融合至80%，更换为成骨诱导培养基(含10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸和10 nmol/L地塞米松的完全培养基)，每3 d换液1次，诱导21 d后，PBS洗涤2次，40 g/L多聚甲醛固定20 min，双蒸水洗涤2次，每孔加入1 mL 1%茜素红S染液室温染色20 min，双蒸水洗涤5次，加入双蒸水覆盖细胞并于倒置显微镜下观察矿化结节形成情况。
(3)成脂分化能力检测：将第3代细胞以8×104个/孔的密度接种在6孔板中，待细胞融合至50%，更换为成脂诱导培养基(含200 μmol/L吲哚美辛、10 mg/L胰岛素、1 μmol/L地塞米松和500 μmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的完全培养基)，每3 d换液1次，诱导21 d后，PBS洗涤2次，40 g/L多聚甲醛固定20 min，双蒸水洗涤2次，每孔加入1 mL油红O染液室温染色20 min，双蒸水洗涤5次，加入双蒸水覆盖细胞并于倒置显微镜下观察脂滴形成情况。

1.4.3   CCK-8法测定细胞增殖能力   将第3-6代人牙周膜干细胞以1.5×103个/孔的密度接种在96孔板中，24 h后更换为含不同浓度大麻二酚(0，0.1，0.5，2.5，12.5 µmol/L)的完全培养基，每2 d换液1次，每组设5个复孔。药物干预 1，3，5，7 d后，吸弃培养基，每孔加入100 μL α-MEM培养基和10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育1.5 h，酶标仪测定450 nm波长处吸光度值。
1.4.4   碱性磷酸酶活性测定   将第3-6代人牙周膜干细胞以8×104个/孔的密度接种在6孔板中，待细胞融合至80%，更换为含不同浓度大麻二酚(0，0.1，0.5，2.5 µmol/L)的成骨诱导培养基，每3 d换液1次，诱导14 d后，PBS洗涤2次，RIPA裂解液裂解细胞并收集细胞裂解物，根据说明书分别使用BCA蛋白浓度测定试剂盒和碱性磷酸酶活性测定试剂盒检测蛋白浓度与碱性磷酸酶活性。
1.4.5   茜素红染色及半定量分析   将第3-6代人牙周膜干细胞以8×104个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞融合至80%，更换为含不同浓度大麻二酚(0，0.1，0.5，2.5 µmol/L)的成骨诱导培养基，每3 d换液1次，诱导21 d后，PBS洗涤2次，40 g/L多聚甲醛固定20 min，双蒸水洗涤2次，每孔加入1 mL 1%茜素红S染液室温染色20 min，双蒸水洗涤5次，加入双蒸水覆盖细胞并于倒置显微镜下观察矿化结节形成情况。半定量分析：吸净双蒸水后每孔加入1 mL 10%氯化十六烷吡啶溶液，室温放置15 min后吸出洗脱液，稀释10倍加入96孔板中，每组设3个复孔，酶标仪测定562 nm波长处吸光度值。
1.4.6   qPCR检测成骨相关基因表达   将第3-6代人牙周膜干细胞以8×104个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞融合至80%，更换为含不同浓度大麻二酚(0，0.1，0.5，2.5 µmol/L)的成骨诱导培养基，每3 d换液1次，诱导7 d后，根据明书使用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，分光光度计检测mRNA浓度及纯度。然后，使用Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)试剂盒去除基因组DNA并反转录1 μg mRNA，使用Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix进行qPCR，每个反应使用同一cDNA样品进行3次重复。扩增程序为：预变性95 ℃ 5 min，1个循环；变性95 ℃ 10 s，退火/延伸60 ℃ 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt方法计算目标基因相对于内参基因GAPDH表达量。引物序列，见表1。

1.5   主要观察指标   ①人牙周膜干细胞的形态、表面标志物及多向分化能力；②不同浓度大麻二酚处理后人牙周膜干细胞的增殖能力；③不同浓度大麻二酚处理后人牙周膜干细胞的碱性磷酸酶活性、茜素红染色及半定量结果、成骨相关基因表达水平。
1.6   统计学分析   采用SPSS 18.0软件进行数据分析，所有数据进行正态性检验并表示为x±s，采用单因素或多因素方差分析Tukey法比较多样本计量资料，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过吉林大学生物统计学专家审核。

人牙周膜干细胞的多向分化潜能和高牙周相关性使其成为牙周组织再生最可靠的种子细胞[4]，但干细胞的功能常受到衰老和炎症等疾病的影响，如何增强牙周膜干细胞的活力和成骨能力成为学者研究的热点[19-20]。大麻二酚是大麻中最主要的非精神活性植物大麻素，除抗炎、抗氧化应激作用外，还具有促进成骨作用[21]。在先前的一项研究中，大麻二酚有效抑制了大鼠实验性牙周炎的促炎细胞因子产生和RANK/RANKL表达，明显减轻了炎症进展过程中的骨吸收[15]，然而，大麻二酚对人牙周膜干细胞增殖和成骨分化能力的影响目前鲜有报道。 

有研究表明，低浓度大麻二酚不具有细胞毒性，高浓度大麻二酚会抑制细胞的增殖活力，对口腔细胞的抑制浓度可能高于10 μmol/L[22]。MILLER等[23]实验发现0.3-3 μmol/L大麻二酚能增强人骨髓间充质干细胞活力；QI等[18]发现1-5 μmol/L大麻二酚明显促进了人牙髓细胞增殖。还有研究表明，浓度低于3 μmol/L的大麻二酚对人脂肪间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的增殖无明显影响[13，23]。因此，该实验采用0.1-12.5 μmol/L浓度范围的大麻二酚分别培养人牙周膜干细胞1，3，5，7 d，CCK-8检测结果表明，大麻二酚以时间和浓度依赖性方式调节人牙周膜干细胞的增殖活性，0.5，2.5 μmol/L大麻二酚作用7 d后可显著增强细胞的增殖能力，而浓度达到12.5 μmol/L时大麻二酚表现出明显的细胞毒性。因此，在后续实验中仅评估0.1-2.5 μmol/L浓度范围的大麻二酚对人牙周膜干细胞成骨分化的影响。值得注意的是，在前5 d所有浓度的大麻二酚对人牙周膜干细胞增殖活性均无明显影响，可能与大麻二酚对口腔细胞增殖活性影响较小有关。该实验结果与先前研究相一致，大麻二酚以剂量和时间依赖性方式对人体细胞发挥生物学效应，且对口腔细胞群产生影响所需的浓度较其他人类正常细胞更高[22]。

碱性磷酸酶活性增强和钙盐沉积是细胞成骨分化的重要标志。碱性磷酸酶出现在成骨细胞分化的早期阶段，可以加速骨基质的矿化[24]。细胞外钙盐沉积是成骨晚期的重要表现，通过茜素红S染色及半定量分析可以直观地评估细胞矿化能力[25]。该实验发现，0.1-2.5 μmol/L大麻二酚均可显著增强人牙周膜干细胞的碱性磷酸酶活性，并促进钙盐沉积，且作用随大麻二酚浓度的升高而增强，其中2.5 µmol/L大麻二酚具有最强的促进作用。

成骨相关基因的表达也是检测细胞成骨分化能力的指标。COL1是成骨分化的早期标志物，可促进细胞黏附和成骨细胞表型形成，并为矿物质沉积提供框架[26]。RUNX2是一种特异性转录因子，可诱导细胞成骨分化，进而调控成骨细胞的成熟[27]。OCN是由成骨细胞合成的非胶原蛋白，是成骨分化的晚期标志物[28]。该研究选择COL1、RUNX2和OCN 3个成骨相关基因进行了qPCR实验，结果表明，0.1-2.5 μmol/L大麻二酚处理明显增强了人牙周膜干细胞COL1、RUNX2和OCN的表达，其中RUNX2和OCN表达水平随大麻二酚浓度升高而升高。该结果与碱性磷酸酶活性以及茜素红染色结果相一致，进一步证实了大麻二酚对人牙周膜干细胞成骨分化的促进作用。

β-catenin是经典Wnt信号通路激活的标志[29]，实验评估了大麻二酚对β-catenin基因表达的影响。Wnt/β-catenin信号通路在调节细胞增殖、成骨分化和骨形成中起着重要作用，被认为是骨骼疾病治疗的关键[30]。多项研究表明，Wnt/β-catenin通路的激活介导了牙周膜干细胞的成骨分化[31-33]。此外，大麻二酚可下调Wnt/β-catenin通路的主要抑制因子GSK-3β，进而激活Wnt/β-catenin通路，这可能与大麻二酚的抗炎与抗氧化应激特性有关[34-35]。在一项针对大鼠脊髓损伤所致骨质疏松的研究中，大麻二酚有效减少了松质骨流失，上调股骨中Wnt/β-catenin通路相关基因表达并增强股骨的机械性能[14]。该研究中，0.1-2.5 μmol/L大麻二酚显著增强了β-catenin表达，且2.5 μmol/L大麻二酚组增强作用最明显，提示大麻二酚对人牙周膜干细胞成骨分化的促进作用可能与Wnt/β-catenin信号通路上调有关。

综上所述，大麻二酚呈浓度依赖性地调节人牙周膜干细胞的生物学特性，0.5，2.5 μmol/L大麻二酚可明显促进人牙周膜干细胞增殖和成骨分化，上调成骨相关基因COL1、RUNX2、OCN和β-catenin表达，其中2.5 μmol/L大麻二酚促进作用最为显著；低浓度(0.1 μmol/L)大麻二酚不影响细胞增殖，但可促进其成骨分化；高浓度(12.5 μmol/L)大麻二酚则对细胞增殖起到抑制作用。利用大麻二酚促进人牙周膜干细胞增殖与成骨分化，可能是促进骨组织再生和牙周组织再生的潜在方法，但其作用机制及体内成骨效果有待进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
大麻二酚：是大麻中最主要的非精神活性成分，具有抗炎、抗氧化等药理活性，在炎症、神经退行性疾病、自身免疫性疾病、癫痫、癌症等疾病治疗中表现出良好的效果。
牙周膜干细胞：是一种存在于牙周膜中未分化的间充质干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，在一定培养条件下可以形成牙槽骨、牙骨质和牙周膜样组织，是促进牙周组织和骨组织再生最具潜力的细胞之一。

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细胞球、细胞片技术和组织工程支架等基于间充质干细胞的疗法是具有潜力的骨缺损修复方法，干细胞来源、生物活性分子选择和支架设计成为目前研究的热点。牙周膜干细胞是一种存在于牙周膜中未分化的间充质干细胞，被认为是牙周组织和骨组织再生中最佳的种子细胞之一。该实验证实大麻的主要非精神活性成分大麻二酚能促进人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化，使其作为生物活性分子用于牙周组织和骨组织再生成为可能，为骨缺损修复提供新思路和选择。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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