环磷酸腺苷反应元件结合蛋白调控耐药性癫痫大鼠海马内脑源性神经营养因子的表达

doi:10.12307/2023.847

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (35): 5659-5664.doi: 10.12307/2023.847

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环磷酸腺苷反应元件结合蛋白调控耐药性癫痫大鼠海马内脑源性神经营养因子的表达

李婧萱1，时黛1，伍国锋2

1贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004；2贵州医科大学附属医院，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2022-10-20 接受日期:2022-11-30 出版日期:2023-12-18 发布日期:2023-06-02
通讯作者: 伍国锋，博士，教授，主任医师，贵州医科大学附属医院，贵州省贵阳市 550004
作者简介:李婧萱，女，1998年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事癫痫病研究。
基金资助:
贵州医科大学附属医院国家自然科学基金(NSFC)面上基金培育计划项目(gyfynsfc-2021-8)，项目负责人：伍国锋

Regulatory effects of cAMP response element-binding protein on hippocampal brain-derived neurotrophic factor level in a rat model of drug-resistant epilepsy

Li Jingxuan1, Shi Dai1, Wu Guofeng2

1Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2022-10-20 Accepted:2022-11-30 Online:2023-12-18 Published:2023-06-02
Contact: Wu Guofeng, MD, Professor, Chief physician, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Li Jingxuan, Master candidate, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Program), No. gyfynsfc-2021-8 (to WGF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

耐药性癫痫：癫痫发作是指由于脑神经元超极化放电造成一过性大脑功能紊乱症状，由已知或未知病因所引起，以反复癫痫发作的倾向性和易感性为特点。癫痫患者经2种及2种以上规范的抗癫痫治疗方案后仍不能有效地控制癫痫发作，被称为耐药性癫痫。
脑源性神经营养因子：由1982 年德国生物学家从猪脑提取液中获得，是神经营养因子家族的一员。脑源性神经营养因子在脑组织中广泛存在，但以海马组织和皮质含量最高。近年来研究发现，脑源性神经营养因子与癫痫发病机制有密切的关系，颞叶癫痫患者癫痫发作会导致脑源性神经营养因子表达增加，可能促进海马齿状回苔藓纤维出芽，构建了多突触环路，导致神经元异常放电。

背景：耐药性癫痫的形成机制尚不清楚，其中环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)及脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)在耐药性癫痫形成过程中的作用已被广泛研究。
目的：使用慢病毒转染法调控正常大鼠海马CREB表达水平，探究其对耐药性癫痫形成过程及海马内BDNF表达的影响。
方法：使用过表达慢病毒或干扰慢病毒调控大鼠海马中CREB表达水平，检测病毒转染结果；大鼠注射病毒7 d后构建氯化锂-匹罗卡品癫痫模型，随后使用苯妥英钠和苯巴比妥进行耐药性筛选，筛选出耐药性癫痫大鼠，分为过表达组、过表达对照组、干扰组、干扰对照组，观察筛药过程中大鼠癫痫发作次数变化，使用蛋白质免疫印迹法及实时荧光定量PCR法检测大鼠海马中CREB及BDNF表达水平。

结果与结论：①病毒转染后14 d，大鼠海马区满布绿色荧光，病毒转染水平较好；②药筛前过表达组大鼠癫痫发作次数多于过表达对照组，干扰组大鼠癫痫发作次数少于干扰对照组；药筛后过表达组大鼠癫痫发作次数多于过表达对照组，干扰组大鼠癫痫发作次数少于干扰对照组；③过表达组大鼠CREB、BDNF表达水平高于过表达对照组，同样干扰组大鼠CREB、BDNF水平低于干扰对照组；④结果表明，调控大鼠海马内CREB表达水平会影响大鼠癫痫发作及耐药性癫痫的形成，通过调控CREB表达可能会对耐药性颞叶癫痫大鼠海马内BDNF表达水平产生影响。

https://orcid.org/0000-0002-2586-7861(李婧萱)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 耐药性癫痫, 脑源性神经营养因子, 环磷酸腺苷反应元件结合蛋白, CREB-BDNF-TrkB信号通路

Abstract: BACKGROUND: The formation mechanism of drug-resistant epilepsy is still unclear, and the role of cAMP response element-binding protein (CREB) and (brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the formation of drug-resistant epilepsy has been widely studied.
OBJECTIVE: To regulate the expression of CREB in the hippocampus of normal rats by lentivirus transfection and to explore its effect on the formation of drug-resistant epilepsy and the expression of BDNF in the hippocampus of rats.
METHODS: Lentivirus overexpression or interfering was used to regulate the expression level of CREB in the hippocampus of rats and detect the virus transfection results. Lithium-pilocarpine induced epilepsy models were established in rats 7 days after lentivirus injection. Sodium phenytoin and phenobarbital were then used for resistance selection. Drug-resistant epileptic rats were screened and divided into overexpression group, overexpression control group, interference group and interference control group. The frequency of epileptic seizures during the screening process was observed and the expression levels of CREB and BDNF in the hippocampus of rats were measured by western blot and real-time fluorescence quantitative PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Fourteen days after virus transfection, the hippocampus of rats was covered with green fluorescence, indicating that the virus transfection level was good. The frequency of epileptic seizures in the overexpression group was higher than that in the overexpression control group and the frequency of epileptic seizures in the interference group was lower than that in the interference control group. The expression levels of CREB and BDNF in the overexpression group were higher than those in the overexpression control group, while the expression levels of CREB and BDNF in the interference group were lower than those in the interference control group. These results indicate that the regulation of CREB expression level in the hippocampus of rats can affect epileptic seizures and formation of drug-resistant epilepsy in rats, and regulating CREB expression may affect the expression level of BDNF in the hippocampus of rats with drug-resistant temporal lobe epilepsy.

Key words: drug-resistant epilepsy, brain-derived neurotrophic factor, cAMP response element-binding protein, CREB-BDNF-TrkB signaling pathway

中图分类号:

李婧萱, 时黛, 伍国锋. 环磷酸腺苷反应元件结合蛋白调控耐药性癫痫大鼠海马内脑源性神经营养因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(35): 5659-5664.

Li Jingxuan, Shi Dai, Wu Guofeng. Regulatory effects of cAMP response element-binding protein on hippocampal brain-derived neurotrophic factor level in a rat model of drug-resistant epilepsy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(35): 5659-5664.

图/表（结果） 6

2.1 急性癫痫模型建立选取120只健康雄性SD大鼠，其中12只作为对照组，其余108只大鼠进行慢病毒转染，注射过表达慢病毒18只，注射干扰慢病毒54只，注射过表达对照慢病毒18只，注射干扰对照慢病毒18只。经点燃后共有59只大鼠进入慢性癫痫期，视为造模成功并统计每组大鼠诱导成功率(诱导成功数/每组总数)。结果显示，注射过表达慢病毒的大鼠诱导成功率高于过表达对照组，而注射干扰慢病毒的大鼠相比于干扰对照组更难诱导为急性癫痫模型，见表2。

2.2 耐药性癫痫模型建立注射过表达慢病毒的大鼠共有10只成为慢性癫痫模型，最终筛选出 5只耐药性癫痫大鼠，5只药物敏感性癫痫大鼠；注射过表达对照慢病毒的大鼠共9只成为慢性癫痫模型，最终筛选出3只耐药性癫痫大鼠，6只药物敏感性癫痫大鼠；注射干扰慢病毒的大鼠共14只成为慢性癫痫模型，最终筛选出3只耐药性癫痫大鼠，11只药物敏感性癫痫大鼠；注射干扰对照慢病毒的大鼠共10只成为慢性癫痫模型，最终筛选出3只耐药性癫痫大鼠，7只药物敏感性癫痫大鼠。结果分析，注射过表达慢病毒的大鼠耐药比率高于过表达对照组，而注射干扰慢病毒的大鼠耐药比率低于干扰对照组，见表2。
2.3 病毒注射结果慢病毒转染后，镜下观察注射不同慢病毒大鼠的海马组织表达绿色荧光，提示各组大鼠慢病毒转染大鼠海马组织成功，慢病毒转染有效调控大鼠海马组织CREB表达，见图2。

2.4 耐药性癫痫大鼠药筛前后癫痫发作次数药筛前及药筛后过表达组大鼠Ⅲ级及以上癫痫发作次数均较过表达对照组明显增加；药筛前干扰组大鼠Ⅲ级及以上癫痫发作次数较干扰对照组明显减少；药筛后干扰组大鼠Ⅲ级及以上癫痫发作次数较干扰对照组明显减少；以上结果提示上调大鼠海马组织CREB表达水平可增加癫痫发作频率，干扰CREB表达可降低癫痫发作频率，见表3。

2.5 RT-qPCR 检测各组耐药性癫痫大鼠CREB、BDNF mRNA 表达过表达组大鼠CREB、BDNF mRNA 的相对表达量均高于过表达对照组，同时干扰组大鼠CREB、BDNF mRNA 的相对表达量均低于干扰对照组，差异均有显著性意义(P < 0.01)。这表明增高大鼠海马CREB表达后，BDNF mRNA表达水平也相应增高；干扰大鼠海马CREB表达后，BDNF mRNA表达水平可能降低，见表4。

2.6 Western blot检测各组耐药性癫痫大鼠CREB、BDNF 蛋白表达水平与PCR结果一致，过表达组大鼠海马组织CREB、BDNF蛋白水平高于过表达对照组，而干扰组大鼠海马组织CREB、BDNF蛋白表达量低于干扰对照组，见表5，图3。

参考文献

[1] FALCO-WALTER JJ, SCHEFFER IE, FISHER RS. The new definition and classification of seizures and epilepsy. Epilepsy Res. 2018;139:73-79.
[2] FISHER RS, ACEVEDO C, ARZIMANOGLOU A, et al. ILAE official report: a practical clinical definition of epilepsy. Epilepsia. 2014;55(4):475-482.
[3] BERETTA S, CARONE D, ZANCHI C, et al. Long-term applicability of the new ILAE definition of epilepsy. Results from the PRO-LONG study. Epilepsia. 2017;58(9):1518-1523.
[4] 陈佳,吴逊.难治性癫痫诊疗新思路[J].中华医学杂志,2010,90(9): 643-645.
[5] CHOW J, JENSEN M, AMINI H, et al. Dissecting the genetic basis of comorbid epilepsy phenotypes in neurodevelopmental disorders. Genome Med. 2019;11(1):65.
[6] KALILANI L, SUN X, PELGRIMS B, et al. The epidemiology of drug-resistant epilepsy: A systematic review and meta-analysis. Epilepsia. 2018;59(12):2179-2193.
[7] KATYAYAN A, DIAZ-MEDINA G. Epilepsy: Epileptic Syndromes and Treatment. Neurol Clin. 2021;39(3):779-795.
[8] YU J, SWIETEK B, PRODDUTUR A, et al. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 2016;89: 23-35.
[9] BALESTRINI S, SISODIYA SM. Pharmacogenomics in epilepsy. Neurosci Lett. 2018;667:27-39.
[10] ARAIN FM, BOYD KL, GALLAGHER MJ. Decreased viability and absence-like epilepsy in mice lacking or deficient in the GABAA receptor α1 subunit. Epilepsia. 2012;53(8):e161-e165.
[11] RAOL YH, LUND IV, BANDYOPADHYAY S, et al. Enhancing GABA(A) receptor alpha 1 subunit levels in hippocampal dentate gyrus inhibits epilepsy development in an animal model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci. 2006;26(44):11342-11346.
[12] SAURA CA, CARDINAUX JR. Emerging Roles of CREB-Regulated Transcription Coactivators in Brain Physiology and Pathology. Trends Neurosci. 2017;40(12):720-733.
[13] GUO J, WANG H, WANG Q, et al. Expression of p-CREB and activity-dependent miR-132 in temporal lobe epilepsy. Int J Clin Exp Med. 2014;7(5):1297-1306.
[14] PULIMOOD NS, RODRIGUES WDS JUNIOR, ATKINSON DA, et al. The Role of CREB, SRF, and MEF2 in Activity-Dependent Neuronal Plasticity in the Visual Cortex. J Neurosci. 2017;37(28):6628-6637.
[15] ZHU X, DUBEY D, BERMUDEZ C, et al. Suppressing cAMP response element-binding protein transcription shortens the duration of status epilepticus and decreases the number of spontaneous seizures in the pilocarpine model of epilepsy. Epilepsia. 2015;56(12):1870-1878.
[16] IUGHETTI L, LUCACCIONI L, FUGETTO F, et al. Brain-derived neurotrophic factor and epilepsy: a systematic review. Neuropeptides. 2018;72:23-29.
[17] SONG M, MARTINOWICH K, LEE FS. BDNF at the synapse: why location matters. Mol Psychiatry. 2017;22(10):1370-1375.
[18] DIENI CV, PANICHI R, AIMONE JB, et al. Low excitatory innervation balances high intrinsic excitability of immature dentate neurons. Nat Commun. 2016;7:11313.
[19] HEINRICH C, LÄHTEINEN S, SUZUKI F, et al. Increase in BDNF-mediated TrkB signaling promotes epileptogenesis in a mouse model of mesial temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis. 2011;42(1):35-47.
[20] SHARMA P, KUMAR A, SINGH D. Dietary Flavonoids Interaction with CREB-BDNF Pathway: An Unconventional Approach for Comprehensive Management of Epilepsy. Curr Neuropharmacol. 2019;17(12):1158-1175.
[21] RACINE RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation: cortical areas. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 1975;38(1):1-12.
[22] SUTULA T, CASCINO G, CAVAZOS J, et al. Mossy fiber synaptic reorganization in the epileptic human temporal lobe. Ann Neurol. 1989;26(3):321-330.
[23] LÖSCHER W, BRANDT C. High seizure frequency prior to antiepileptic treatment is a predictor of pharmacoresistant epilepsy in a rat model of temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 2010;51(1):89-97.
[24] ZHU X, HAN X, BLENDY JA, et al. Decreased CREB levels suppress epilepsy. Neurobiol Dis. 2012;45(1):253-263.
[25] YU Y, JIANG J. COX-2/PGE2 axis regulates hippocampal BDNF/TrkB signaling via EP2 receptor after prolonged seizures. Epilepsia Open. 2020;5(3):418-431.
[26] ZHANG H, KONG Q, WANG J, et al. Complex roles of cAMP-PKA-CREB signaling in cancer. Exp Hematol Oncol. 2020;9(1):32.
[27] MCTAGUE A, HOWELL KB, CROSS JH, et al. The genetic landscape of the epileptic encephalopathies of infancy and childhood. Lancet Neurol. 2016;15(3):304-316.
[28] WU G, LIU Z, WANG L, et al. Hippocampal Low-Frequency Stimulation Decreased cAMP Response Element-Binding Protein and Increased GABAA Receptor Subunit α1 in Amygdala-Kindled Pharmacoresistant Epileptic Rats. Neuropsychiatry. 2017;7(6):983-993.
[29] MERTZ C, KRARUP S, JENSEN CD, et al. Aspects of cAMP Signaling in Epileptogenesis and Seizures and Its Potential as Drug Target. Neurochem Res. 2020;45(6):1247-1255.
[30] LIN TW, HARWARD SC, HUANG YZ, et al. Targeting BDNF/TrkB pathways for preventing or suppressingbepilepsy. Neuropharmacology. 2020; 167:107734107734.
[31] HU Y, RUSSEK SJ. BDNF and the diseased nervous system: a delicate balance between adaptive and pathological processes of gene regulation. Neurochem. 2008;105(1):1-17.
[32] BINDER DK. The role of BDNF in epilepsy and other diseases of the mature nervous system. Adv Exp Med Biol. 2004;548:34-56.
[33] BINDER DK, SCHARFMAN HE. Brain-derived neurotrophic factor. Growth Factors. 2004;22(3):123-131.
[34] ESVALD EE, TUVIKENE J, SIRP A, et al. CREB Family Transcription Factors Are Major Mediators of BDNF Transcriptional Autoregulation in Cortical Neurons. Neurosci. 2020;40(7):1405-1426.
[35] RAFA-ZABŁOCKA K, KREINER G, BAGIŃSKA M, et al. Selective Depletion of CREB in Serotonergic Neurons Affects the Upregulation of Brain-Derived Neurotrophic Factor Evoked by Chronic Fluoxetine Treatments. Front Neurosci. 2018;9(12):637-637.
[36] FALCICCHIA C, PAOLONE G, EMERICH DF, et al. Seizure-Suppressant and Neuroprotective Effects of Encapsulated BDNF-Producing Cells in a Rat Model of Temporal Lobe Epilepsy. Mol Ther Methods Clin Dev. 2018;5(9):211-224.
[37] LAI HC, CHANG QY, HSIEH CL. Signal Transduction Pathways of Acupuncture for Treating Some Nervous System Diseases. Evid Based Complement Alternat Med. 2019;2019:2909632.
[38] YEH CM, HUANG CC, HSU KS. Prenatal stress alters hippocampal synaptic plasticity in young rat offspring through preventing the proteolytic conversion of pro-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) to mature BDNF. J Physiol. 2012;590(4):991-1010.
[39] KLEIN KM, PENDZIWIAT M, COHEN R, et al. Autosomal dominant epilepsy with auditory features: a new LGI1 family including a phenocopy with cortical dysplasia. Neurol. 2016;263(1):11-16.
[40] GORSKI JA, ZEILER SR, TAMOWSKI S, et al. Brain-derived neurotrophic factor is required for the maintenance of cortical dendrites. J Neurosci. 2003;23(17):6856-6865.
[41] LUCARINI N, VERROTTI A, NAPOLIONI V, et al. Genetic polymorphisms and idiopathic generalized epilepsies. Pediatr Neurol. 2007;37:157-164.

引言

癫痫是神经系统最常见疾病之一，以大脑神经元异常过度放电导致的短暂大脑功能障碍为特征。世界范围内有 7 000多万癫痫患者，癫痫已成为继头痛之后的神经系统第二大疾病[1]。癫痫是一种复杂的神经系统综合征，其发生机制是脑神经元过度兴奋和异常放电，临床主要表现为突发性意识障碍暨抽搐 [2-3]。虽然许多癫痫患者经过目前的抗癫痫药物正规治疗可以获得缓解，但依然有20%-30%的癫痫患者对药物治疗不敏感，发展为耐药性癫痫[4]。耐药性癫痫定义为癫痫患者对2种可以耐受、适当选择的抗癫痫药物方案(无论是单一治疗还是联合治疗)进行充分治疗仍然失败，不能实现癫痫发作停止12个月以上的目标(所有类型的癫痫发作)，或无癫痫发作的时间未能超过治疗开始前间歇期的3倍[5]。随着时间推移，耐药性癫痫的发病率逐年升高，耐药性癫痫患者过早死亡、受伤、心理社会功能障碍和生活质量降低的风险增加[6-7]，临床上迫切需要找到新的抗癫痫药物作用靶点[8-9]。
目前γ-氨基丁酸能传递受损被认为是耐药性癫痫产生机制之一，人们希望探究其受损机制继而找到治疗耐药性癫痫的新途径[10-11]。在耐药性癫痫患者及动物模型中均检测到其上游转录因子环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)的靶基因表达水平明显增强[12-13]。迄今为止，多种CREB靶基因已被证明与耐药性癫痫密切相关[14]，包括γ-氨基丁酸、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、环氧化酶2和NMDA受体2B亚基(NMDA receptor 2B，NR2B) [15]。虽然现今γ-氨基丁酸被研究者们广泛认为是癫痫患者产生耐药性的主要机制，但也有不少研究表明BDNF在耐药性癫痫中的作用不可忽视[16-18]。研究认为CREB-BDNF-TrkB信号通路可能在耐药性癫痫发生发展中起重要作用[19-20]。
该研究为进一步探讨CREB与BDNF在耐药性癫痫发生发展中的作用，通过注射CREB过表达及CREB干扰慢病毒调控大鼠海马组织CREB表达水平，探究CREB-BDNF-TrkB信号通路对耐药性癫痫形成过程的影响，为耐药性癫痫的临床治疗及药物开发提供新思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机分组对照动物学体内实验，组间均数比较方差齐时采用成组t检验，方差不齐时采用校正t检验；不符合正态分布的计量资料采用Wilcoxon秩和检验。
1.2 时间及地点实验于2021年6月至2022年6月在贵州医科大学临床医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选取SPF级成年雄性健康SD大鼠共120只，6-8周龄，体质量200-250 g，由贵州医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(黔)2018-0001。实验方案经贵州医科大学动物实验伦理委员会批准(No.2101479)。将动物置于实验室1周适应环境，单笼喂养，自由进食和饮水，室温21-25 ℃，自然采光，大鼠实验前禁食10 h。实验均在上午9时开始，实验时保持安静。
1.3.2 主要试剂及仪器氯化锂(美国Sigma 公司)；匹罗卡品(国药集团化学试剂有限公司)；苯妥英钠(新亚药业有限公司)；苯巴比妥钠(新亚药业有限公司)；CREB过表达慢病毒(吉凯基因公司)；CREB干扰慢病毒(吉凯基因公司)；CREB一抗(武汉Proteintech公司)；BDNF一抗(武汉Proteintech公司)；GAPDH一抗(武汉Proteintech公司)；羊抗兔IgG HRP二抗(武汉Proteintech公司)；十二烷基硫酸钠(美国Sigma公司)；PVDF 转移膜(美国Millipore公司)；化学发光试剂(美国Millipore公司)；Trizol 试剂盒(美国Invitrogen公司)；SYBR Green PCR试剂盒(KM4101美国KAPA Biosystems公司)；反转录试剂盒(日本TAKARA公司)。超净工作台(苏州金净净化设备公司)；-80 ℃冰箱(德国Eppendorf公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)；荧光 PCR 仪(美国Bio-Rad公司)；微量加样器(Thermo Fisher)。
1.4 实验方法
1.4.1 CREB调控慢病毒构建及包装 CREB过表达慢病毒、CREB ShRNA干扰慢病毒及其相应对照病毒均由上海吉凯基因公司构建、包装及鉴定。CREB过表达慢病毒为使用引物(序列：5’-GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTC GCC ACC ATG ACC ATG GAC TCT GGA GCA G-3’和5’-TCC TTG TAG TCC ATA CCA TCT GAC TTG TGG CAG TAA AGG-3’)克隆出大鼠CREB1基因cDNA序列插入到GV358载体中构建、扩增、包装而成，CREB过表达对照慢病毒为使用GV358空载体包装而成。CREB干扰慢病毒以GV248载体为基础，使用ShRNA序列5’-GGG CCT GCA GAC ATT AAC CAT-3’、5’-GTG CCC AGC AAC CAA GTT GTT-3’、5’-CAA AAC ATT GAT TGA GGA GCT-3’，对照插入序列为5’-TTC TCC GAA CGT GTC ACG T-3’。
1.4.2 双侧海马CA3区注入调控CREB的慢病毒腹腔注射乌拉坦(6 mL/kg)麻醉至大鼠角膜反射消失后固定于脑立体定位仪上，使用体积分数为75%乙醇消毒局部皮肤，正中切口1 cm，暴露颅骨及前囱，剥离骨面，止血清创。注射位置：右侧海马CA3区坐标为前囟向后2.64 mm、矢状缝线向右侧2.0 mm和硬膜向下4.0 mm；左侧海马CA3区坐标为前囟向后2.64 mm、矢状缝线向左侧2.0 mm和硬膜向下4.0 mm。使用微量注射器抽取5 μL过表达CREB慢病毒或过表达CREB对照慢病毒或干扰CREB慢病毒或干扰CREB对照慢病毒，注射到大鼠双侧海马CA3区，针头垂直进入，缓慢推注，速度为0.1 μL/min，注射完毕后留针6 min。术后给予皮下补液10-15 mL生理盐水，连续3 d腹腔注射青霉素4×104 U/kg预防感染，恢复7 d后进行后续实验。

1.4.3 氯化锂-匹罗卡品化学点燃模型的制备上述大鼠注射4种病毒7 d后，给予125 mg/kg氯化锂腹腔注射，18-24 h后给予1 mg/kg阿托品腹腔注射，30 min后再给予20 mg/kg匹罗卡品腹腔注射。匹罗卡品给药后30 min内观察大鼠是否出现凝视、点头、前肢阵挛、站立和跌倒等癫痫发作表现。根据Racines分级法对大鼠癫痫发作程度进行分级[21]，将出现Ⅳ级及Ⅳ级以上癫痫发作视为出现癫痫持续状态。若30 min后无癫痫发作则追加5 mg/kg匹罗卡品，直至大鼠出现Ⅳ级及Ⅳ级以上癫痫发作，视为急性癫痫模型造模成功。待癫痫持续状态60 min后给予10%水合氯醛350 mg/kg终止发作。

1.4.4 筛选耐药性癫痫大鼠
(1) 2周后大鼠癫痫模型进入慢性期。慢性期开始对大鼠进行2周24 h不间断视频监控，记录大鼠癫痫发作情况。
(2)2周记录结束后，若记录期间未出现3次Ⅲ级及Ⅲ级以上自发性癫痫发作则认为造模失败，弃去不用。对记录期间有3次Ⅲ级以上癫痫发作的大鼠进行耐药性筛选。选用苯巴比妥及苯妥英钠2种药物对大鼠进行耐药性筛选[23]。首剂给予苯巴比妥25 mg/kg腹腔注射，此后每次腹腔注射苯巴比妥30 mg/kg，每日1次，连续注射2周。
(3)记录注射苯巴比妥2周期间大鼠的癫痫发作次数，将每只大鼠注射苯巴比妥期间平均每周发作频率与第3，4周平均每周发作频率进行比较。若苯巴比妥用药后大鼠每周发作频率减少≥50%则为对苯巴比妥敏感，即药敏性癫痫大鼠；若发作频率减少< 50%，则继续给予苯妥英钠治疗。首剂予苯妥英钠75 mg/kg腹腔注射，此后每次腹腔注射50 mg/kg，每日2次，连续注射2周。
(4)将每只大鼠注射苯妥英钠期间平均每周发作频率与第5，6周平均每周发作频率进行比较。若苯妥英钠用药后每周发作频率减少≥50%为对苯妥英钠敏感，也同样归为药敏性癫痫大鼠。若发作减少仍≤50%，则视为对2种药物耐药，即为耐药性癫痫大鼠。根据注射于海马组织中调控病毒种类，将筛选出的耐药性癫痫大鼠分为过表达组、过表达对照组、干扰组及干扰对照组。

造模时间流程见图1。

1.4.5 取材造模成功大鼠腹腔注射麻醉处死后取出大鼠海马组织，千分之一天平称质量后切取海马组织，将样本保存于-80 ℃超低温冰箱中备用。
1.4.6 病毒注射结果检测病毒注射2周后取出大鼠大脑组织，每组3只，经快速冰冻切片后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达水平。

1.4.7 实时荧光定量 PCR 验证相关基因表达标本于-80 ℃冰箱中保存，取约100 mg组织于冰上，在1 mL预冷的Trizol中充分研磨，匀浆液小心倒入1.5 mL EP管中，加入250 μL三氯甲烷，充分混匀，冰上静置5 min。将混合液置于离心机中4 ℃，10 000×g离心10 min，加入20 μL DEPC处理水，充分溶解RNA。将提取后RNA置于-80 ℃冰箱中保存。将制备好的cDNA样本进行PCR扩增。反应条件为预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 10 s，联合退火/延伸 60 ℃ 30 s，40个循环。引物由四维加生物科技(武汉)有限公司合成，引物序列见表1。将结果标准化为内参GAPDH的表达，采用2-ΔΔCt法计算CERB，BDNF mRNA相对表达量。

1.4.8 蛋白质免疫印迹实验将提取出的海马组织蛋白用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白样品，然后转移到PVDF膜上，加入CREB(1∶1 000)，BDNF(1∶1 000)，GAPDH(1∶500)一抗孵育后，将膜暴露于二抗(1∶10 000)中，以GAPDH作为内参，计算CREB、BDNF的相对灰度值。
1.5 主要观察指标 ①大鼠点燃比例；②药筛前后大鼠癫痫发作次数；③慢病毒转染效率；④大鼠海马组织CREB、BDNF mRNA 的表达水平。
1.6 统计学分析所有实验数据采用 SPSS 23.0 软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以x±s表示，组间均数比较方差齐时采用成组t检验，方差不齐时采用校正t检验；不符合正态分布的计量资料采用Wilcoxon 秩和检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过贵州医科大学公共卫生学院生物统计学专家审核。

讨论

有实验将CREB基因敲除小鼠诱导成为癫痫持续状态后，与野生型小鼠相比，其在毛果芸香碱诱导癫痫持续状态后自发癫痫发作减少约50%，需要更多电刺激才能点燃使其出现Ⅴ级发作，同时发现CREB基因敲除小鼠海马和皮质中BDNF mRNA差异上调，这可能导致了癫痫严重程度的差异[24-25]。当CREB活动抑制时会缩短癫痫持续状态的持续时间，并降低慢性癫痫患者的癫痫发作率。CREB作为关键转录因子，研究者们将其用于肿瘤靶向治疗中，可靶向抑制肿瘤生长，但尚未有研究将其用于治疗耐药性癫痫，原因在于目前耐药性癫痫机制尚不完全清楚，调控CREB对于耐药性癫痫形成机制的研究较少，基础资料尚不完全[26-27]。为探究CREB在耐药性癫痫中的作用，该实验预期使用慢病毒调控正常大鼠脑内过表达CREB或干扰CREB水平，从而研究其对耐药性癫痫形成过程的影响。
该研究选用慢病毒转染的方式调控大鼠脑内CREB的表达水平，使用慢病毒携带荧光目的基因检测慢病毒转染水平，注射慢病毒7 d后观察到大鼠海马组织满布绿色荧光，证明慢病毒转染成功。使用氯化锂-匹罗卡品化学点燃模型从而诱发癫痫的发生，利用此方法造模发作阶段性明显，行为学表现规律、造模稳定、死亡率低，适宜大规模造模。在癫痫发作急性期后，大鼠将转入慢性癫痫期，使用苯巴比妥和苯妥英钠2种药物筛选出耐药性癫痫模型。在筛选过程中记录大鼠癫痫发作次数，结果发现过表达组大鼠癫痫发作次数及频率高于过表达对照组，而干扰组大鼠癫痫发作次数及频率低于干扰对照组。这表明在耐药性癫痫形成过程中，过表达脑内CREB水平会增加耐药性癫痫大鼠癫痫发作次数及频率，干扰脑内CREB表达水平会减少耐药性癫痫大鼠癫痫发作次数及频率，这一发现可能为耐药性癫痫治疗开辟新道路。
课题组前期实验发现，耐药性癫痫大鼠海马组织CREB表达水平显著升高 [28]。有研究在啮齿动物癫痫模型和患有可治疗和耐药性癫痫的人类中均发现CREB磷酸化增加。在耐药性癫痫患者癫痫发作区域观察到CREB磷酸化增加和CREB调节转录增加，高于可治疗癫痫对照组[29]。这些结果提示CREB作为关键的转录因子，可能在耐药性癫痫的发生发展过程中起关键作用。
CREB家族转录因子与共激活因子CBP一起是BDNF-TrkB信号转导依赖的主要调控因子[30]。BDNF作为一种广泛表达的神经营养因子，其在癫痫发生和发展中的作用不可忽视[31-33]。在成人大脑中，BDNF的主要功能是促进突触传递、增强突触可塑性、促进突触生长，BDNF信号通过其跨膜受体TrkB在神经元存活、分化和突触可塑性中具有重要作用[34]。BDNF信号传导参与海马颗粒神经元的神经发生和树突形成，BDNF可以激活TrkB受体和下游MAPK信号通路来调节自身mRNA的表达，研究已证实CREB家族转录因子与共激活因子CBP/p300是TrkB信号转导后BDNF基因表达的主要调控因子，而CREB本身只与BDNF启动子Ⅳ直接结合，在响应BDNF-TrkB信号时被磷酸化，并通过招募CBP激活BDNF启动子Ⅳ的转录[35]。早期的研究表明，癫痫发作显著增加了与边缘癫痫相关大脑区域的BDNF表达[36]。TrkB在癫痫发作后也会增加，其模式类似BDNF水平的变化，放大的BDNF水平导致进一步的高兴奋性和癫痫活动，继而导致耐药性癫痫的产生[37-38]。BDNF在成人大脑中过度激活TrkB受体被认为是长时间癫痫发作后癫痫发生的必要条件。实验动物和颞叶癫痫患者癫痫发作后BDNF和TrkB均上调[39-40]。还有研究表明，体内输注BDNF可增加兴奋性，可能诱发癫痫发作。BDNF还可导致γ-氨基丁酸能传递和钾(K+)/氯(Cl-)共体的减少[41]。
该研究使用脑立体定位微量注射慢病毒的方法调控大鼠海马组织CREB，过表达慢病毒使大鼠脑内CREB表达水平增高和干扰慢病毒干扰CREB表达后，进一步研究耐药性癫痫大鼠海马组织中CREB及BDNF蛋白表达水平的变化，过表达组耐药性癫痫大鼠海马组织CREB表达量增多，多于过表达对照组，而干扰组耐药性癫痫大鼠海马组织CREB表达量减少，低于干扰对照组，在阻断CREB表达后，BDNF表达量有所减少，过表达CREB后，BDNF表达量也相应升高。这说明阻断CREB表达后，可导致BDNF表达受抑制，可以推断在耐药性癫痫发生过程中CREB-BDNF-TrkB信号通路可能发挥一些关键作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

环磷酸腺苷反应元件结合蛋白调控耐药性癫痫大鼠海马内脑源性神经营养因子的表达

Regulatory effects of cAMP response element-binding protein on hippocampal brain-derived neurotrophic factor level in a rat model of drug-resistant epilepsy

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[1]	刘鑫鑫, 耿治中, 陈建. 不同干预周期的高强度间歇性训练对老年人认知能力影响的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(14): 2282-2289.
[2]	马瑞鑫, 刘槃, 张琼, 曾高峰, 宗少晖. 山楂叶总黄酮调控星形胶质细胞治疗脊髓损伤的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5327-5333.
[3]	杨雅竹, 杜鹃, 屈海峰, 李建民, 张宇新, 刘俊杰. 人参皂苷Rg1对D-半乳糖诱导脑老化小鼠学习记忆功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4487-4493.
[4]	安河朋, 刘振腾, 李立新, 许雅芳, 樊国峰. 脑源性神经营养因子干预腰椎管狭窄症大鼠神经元活性、疼痛及相关因子的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4120-4125.
[5]	税晓平, 李春莹, 李明娟, 李顺昌, 孙君志, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病模型大鼠海马抗氧化应激指标和脑源性神经营养因子表达的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 264-269.
[6]	税晓平, 李春莹, 李顺昌, 孙君志, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病大鼠骨骼肌脑源性神经营养因子、核因子κB及炎症指标的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 669-675.
[7]	黄传俊, 邹煜, 周晓婷, 朱扬清, 钱伟, 张卫, 刘星. 携带脐带间充质干细胞的RADA16-BDNF水凝胶支架定向移植促进脑出血大鼠神经功能恢复[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 510-515.
[8]	杨椅, 王坤, 刘恒旭, 张庭然, 卢文云, 陈佩杰, 罗炯. 有氧运动对老年轻度认知障碍患者认知功能的改善[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(29): 4716-4722.
[9]	王玉香, 崔传举, 李彦玲, 李艾帆. 脑源性神经营养因子修饰人羊膜间充质干细胞移植改善阿尔茨海默病大鼠认知功能[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 2045-2049.
[10]	路毅, 邓文冲. 不同运动方式对大脑结构及认知功能的调节作用及差异[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3252-3258.
[11]	史正亮, 张华, 范志勇, 马维, 袁鹤, 杨冰. 几丁糖/聚乙烯醇导管联合脑源性神经营养因子缓释微球修复大鼠周围神经缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1555-1559.
[12]	张健, 陈淼, 李伟鑫, 叶益超, 徐会友, 马珂, 陈旭义, 孙洪涛, 张赛. 负载脑源性神经营养因子胶原/肝素硫酸支架促进颅脑创伤大鼠神经运动功能的恢复 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(34): 5538-5544.
[13]	杜晓文, 林大鹏, 屠冠军. S100A4促进脑源性神经营养因子表达影响神经干细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(19): 3029-3034.
[14]	郭晓征, 王兴. 基于近红外光谱分析技术评价运动对老年人认知功能改善的作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(11): 1790-1796.
[15]	王倩，刘羿，张雨，杨印祥，汪兆艳，张乐平，栾佐. 低氧条件下人脂肪间充质干细胞分泌多种细胞因子的水平[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(29): 4681-4687.