人参皂苷Rg1对D-半乳糖诱导脑老化小鼠学习记忆功能的影响

doi:10.12307/2023.556

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (28): 4487-4493.doi: 10.12307/2023.556

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人参皂苷Rg1对D-半乳糖诱导脑老化小鼠学习记忆功能的影响

杨雅竹1，2，杜鹃3，屈海峰1，李建民1，2，张宇新3，刘俊杰1，2

华北理工大学，1临床医学院，3基础医学院，河北省唐山市 063000；2华北理工大学附属医院神经外科，河北省唐山市 063000

收稿日期:2022-06-23 接受日期:2022-08-08 出版日期:2023-10-08 发布日期:2023-01-29
通讯作者: 刘俊杰，讲师，硕士，主治医师，华北理工大学临床医学院，河北省唐山市 063000；华北理工大学附属医院神经外科，河北省唐山市 063000
作者简介:杨雅竹，女，2000年生，四川省德阳市人，汉族，主要从事脑老化损伤机制及保护策略研究。
基金资助:
脑老化及综合干预研究人才培养项目(381094)，项目负责人：李建民

Effect of ginsenoside Rg1 on learning and memory ability of brain aging mice induced by D-galactose

Yang Yazhu1, 2, Du Juan3, Qu Haifeng1, Li Jianmin1, 2, Zhang Yuxin3, Liu Junjie1, 2

1Department of Clinical Medicine, 3Department of Basic Medicine, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China; 2Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China

Received:2022-06-23 Accepted:2022-08-08 Online:2023-10-08 Published:2023-01-29
Contact: Liu Junjie, Master, Lecturer, Attending physician, Department of Clinical Medicine, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China; Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China
About author:Yang Yazhu, Department of Clinical Medicine, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China; Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China
Supported by:
Brain Aging and Comprehensive Intervention Research Talent Training Project, No. 381094 (to LJM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

突触后密度蛋白95：是突触后致密区接受和整合突触信号并将其传导给突触后细胞的主要蛋白之一，也是一种重要的细胞脚手架蛋白，对突触的生物学功能及其可塑性发挥重要作用，与认知、学习和记忆功能密切相关，成为近年来脑老化领域的研究热点。
人参皂苷Rg1：是人参重要的抗衰老成分之一，具有抗氧化、抗炎、保护神经功能等作用。已有研究证明其能有效延缓脑衰老，但其具体机制尚不清楚。人参皂苷Rg1是目前脑老化领域研究比较多、也比较具代表性的成分之一，但目前关于Rg1改善脑老化的分子机制仍尚未统一，亟待深入研究。
脑源性神经营养因子：是一种小型的、碱性的分泌蛋白，是神经营养因子家族的成员之一，也是哺乳动物脑内最丰富的神经营养因子，主要作用是调节活性依赖的神经元的功能及突触可塑性，它及其相关蛋白的信号通路(如脑源性神经营养因子/TrkB信号通路)与学习和记忆力密切相关，在树突和轴突结构发育、细胞增殖和生存等方面发挥重要作用。

背景：脑老化可导致学习记忆功能减退，其机制并不明确。近年研究发现，人参皂苷Rg1可提高阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆能力，其机制可能与其改善突触后密度蛋白95的表达相关。
目的：探讨人参皂苷Rg1能否通过脑源性神经营养因子/TrkB 信号通路改善D-半乳糖诱导衰老小鼠的学习记忆功能与海马区突触后密度蛋白95的表达。
方法：取50只雄性昆仑种小鼠，采用随机数字表法分为5组，每组10只：A组不进行任何处理；B组皮下注射D-半乳糖溶液300 mg/(kg·d)建立脑老化模型；C组造模1 h后每天灌胃给予盐酸多奈哌齐；D组造模1 h后每天灌胃给予人参皂苷Rg1 ；E组造模1 h后每天灌胃给予人参皂苷Rg1，并且腹腔注射选择性TrkB阻断剂ANA-12(每2 d一次)。持续给药6周后，进行学习记忆能力(旷场实验、新物体识别实验、Morris水迷宫实验)测试、脑组织形态学观察及小鼠海马区突触后密度蛋白95、脑源性神经营养因子的蛋白表达检测。

结果与结论：①行为学结果显示：B组小鼠学习记忆能力低于A组(P < 0.05)；C、D组小鼠学习记忆能力高于B组(P < 0.05)；D组小鼠学习记忆能力低于C组(P < 0.05)；E组小鼠学习记忆能力低于D组(P < 0.05)；②苏木精-伊红、Nissl染色显示，与A组相比，B组小鼠海马CA1区正常神经元数量减少，尼氏体表达明显减少；与B组相比，C、D组正常神经元数量增多，尼氏小体颗粒明显增加；与D组相比，E组正常神经元数量减少，尼氏小体颗粒明显减少；③Western blot检测显示，与A组相比，B组脑源性神经营养因子、突触后密度蛋白95的蛋白表达降低(P < 0.05)；与B组相比，C、D组脑源性神经营养因子、突触后密度蛋白95的蛋白表达升高(P < 0.05)；D组小鼠海马脑源性神经营养因子、突触后密度蛋白95的蛋白表达低于C组(P < 0.05)；与D组相比，E组突触后密度蛋白95的蛋白表达降低(P < 0.05)，脑源性神经营养因子蛋白表达无明显变化(P > 0.05)；④结果表明，人参皂苷Rg1可改善D-半乳糖诱导的脑老化小鼠神经元损伤与学习记忆能力，并促进海马中突触后密度蛋白95的表达，而脑源性神经营养因/TrkB信号通路可能为其调控机制之一。

https://orcid.org/0000-0002-3196-1731(杨雅竹)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脑老化, D-半乳糖, 人参皂苷Rg1, 脑源性神经营养因子, TrkB信号通路, 突触后密度蛋白95

Abstract: BACKGROUND: Brain aging can decline learning and memory functions, and the mechanism is not clear. Recent studies have found that ginsenoside Rb1 can improve the learning and memory ability of Alzheimer’s disease model mice, and its mechanism may be related to the improvement of postsynaptic density protein 95 expression.
OBJECTIVE: To investigate whether ginsenoside Rg1 can improve the learning and memory function and postsynaptic density protein 95 expression in the hippocampus of D-galactose-induced aging mice through brain-derived neurotrophic factor/TrkB signaling pathway.
METHODS: Fifty male SPF Kunlun mice were randomly divided into five groups, A, B, C, D, and E, with 10 mice in each group. Group A: normal blank control group with no treatment; group B: brain aging model was established through subcutaneous injection of D-galactose solution 300 mg/kg per day; group C: at 1 hour after modeling, donepezil hydrochloride was intragastrically administered daily; group D: at 1 hour after modeling, ginsenoside Rg1 was intragastrically given; group E: at 1 hour after modeling, ginsenoside Rg1 (30 mg/kg per day) was intragastrically given and selective TrkB blocker ANA-12 was intraperitoneally injected every 2 days. Mice in each group were administered according to the corresponding dose and frequency for 6 weeks. The following contents were observed: learning and memory ability (open field test, novel object recognition test, and Morris water maze test); morphological observation of brain tissue using hematoxylin-eosin staining and Nissl staining; and western blot detection of postsynaptic density protein 95 and brain-derived neurotrophic factor protein expression in mouse hippocampus.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with group A, the learning and memory abilities of mice in group B were significantly decreased (P < 0.05); compared with group B, the learning and memory abilities of mice were significantly improved in groups C and D (P < 0.05); compared with group D, the learning and memory abilities of mice were significantly decreased in group E (P < 0.05). Results of hematoxylin-eosin staining and Nissl staining showed that: compared with group A, the number of normal neurons in the hippocampal CA1 region was reduced and the expression of Nissl bodies was significantly reduced in group B; compared with group B, the number of normal neurons increased and the number of Nissl corpuscle granules increased significantly in groups C and D; compared with group D, the number of normal neurons was reduced and the expression of Nissl bodies were significantly reduced in group E. Western blot results indicated that compared with group A, the expressions of postsynaptic density protein 95 and brain-derived neurotrophic factor in the hippocampus of mice were significantly decreased in group B (P < 0.05); compared with group B, the expressions of postsynaptic density protein 95 and brain-derived neurotrophic factor were significantly increased in groups C and D (P < 0.05); compared with group D, the expression of postsynaptic density protein 95 was significantly decreased in group E (P < 0.05), while the expression of brain-derived neurotrophic factor had no statistical difference (P > 0.05). To conclude, ginsenoside Rg1 can improve D-galactose-induced neuronal damage and learning and memory abilities in brain aging mice and promote the expression of postsynaptic density protein 95 in the hippocampus. The brain-derived neurotrophic factor/TrKB signaling pathway may be one of its mechanisms.

Key words: brain aging, D-galactose, ginsenoside Rg1, brain-derived neurotrophic factor, TrkB signaling pathway, postsynaptic density protein 95

中图分类号:

杨雅竹, 杜鹃, 屈海峰, 李建民, 张宇新, 刘俊杰. 人参皂苷Rg1对D-半乳糖诱导脑老化小鼠学习记忆功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4487-4493.

Yang Yazhu, Du Juan, Qu Haifeng, Li Jianmin, Zhang Yuxin, Liu Junjie. Effect of ginsenoside Rg1 on learning and memory ability of brain aging mice induced by D-galactose[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(28): 4487-4493.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 50只昆明种小鼠全部进入结果分析，无脱落。
2.2 造模小鼠一般状态 A组小鼠好动，反应敏捷，精神状态良好，体毛光滑有光泽；B组小鼠在注射D-半乳糖期间逐渐出现精神萎靡、体毛干枯易落、反应迟钝、自发活动减少等现象。
2.3 各组小鼠旷场实验测试结果与A组相比，B组小鼠旷场总路程、平均速度减少(P < 0.05)，说明其认知能力严重受损；与B组相比，C、D组小鼠旷场总路程、平均速度增加(P < 0.05)，说明给予盐酸多奈哌齐和人参皂苷Rg1治疗后，小鼠认知能力得到明显改善；D组小鼠旷场总路程、平均速度少于C组(P < 0.05)；与D组相比，E组旷场总路程、平均速度减少(P < 0.05)，表明ANA-12明显抑制了人参皂苷Rg1改善认知能力的作用，见图1。

2.4 各组小鼠新物体识别实验测试结果 B组小鼠新物体相对辨别指数明显低于A组(P < 0.05)，表明其认知能力明显受损；而给予人参皂苷Rg1和盐酸多奈哌齐治疗后，C、D组小鼠新物体识别指数与B组相比显著增加(P < 0.05)，表明认知能力得到明显改善；D组小鼠新物体识别指数显著低于C组(P < 0.05)；给予ANA-12后，E组小鼠新物体识别指数与D组相比显著下降(P < 0.05)，表明ANA-12明显抑制了人参皂苷Rg1改善认知能力的作用，见图2。

2.5 各组小鼠Morris水迷宫实验测试结果与A组相比，B组小鼠逃避潜伏期延长(P < 0.05)，穿越原平台次数和目标区域停留时间减少(P < 0.05)；与B组相比，C、D组逃避潜伏期明显缩短(P < 0.05)，穿越原平台次数和目标区域停留时间增加(P < 0.05)；与C组比较，D组小鼠逃避潜伏期明显延长、目标区域停留时间和穿越原平台次数减少(P < 0.05)；与D组相比，E组逃避潜伏期明显延长(P < 0.05)，穿越原平台次数和目标区域停留时间显著减少(P < 0.05)，见表1。

2.6 各组小鼠海马CA1区形态学观察
苏木精-伊红染色：A组小鼠海马CA1区神经细胞形态完整，整齐排列，数量多，细胞质染色均匀，细胞核完整；B组小鼠海马CA1区形态结构不完整，神经细胞数量明显减少，可见染色质深染和核固缩；给予盐酸多奈哌齐和人参皂苷Rg1治疗后，C、D组小鼠海马CA1区病变程度明显减轻，尤以C组明显；E组小鼠海马CA1区病变程度与D组相比明显加重，见图3、表2。

Nissl染色：A组小鼠海马CA1区神经元排列整齐、密集，胞浆中尼氏体丰富；与A组相比，B组神经元内尼氏小体消失或部分溶解，胞浆着色变浅且层次不清、神经元排列稀疏，尼氏体表达明显减少；而经过盐酸多奈哌齐和人参皂苷Rg1治疗后，C、D组小鼠脑组织Nissl染色阳性神经元数量明显增多，且神经元固缩程度减少，尤其是C组神经元清晰可见、排列较为整齐；经过TrkB 阻断剂ANA-12干预后，E组病变严重程度明显较D组加重，见图4、表2。

2.7 各组小鼠海马区脑源性神经营养因子、突触后密度蛋白95的蛋白表达与A组相比，B组小鼠海马区脑源性神经营养因子、突触后密度蛋白95的蛋白表达降低(P < 0.05)；与B组相比，C。D组小鼠海马区脑源性神经营养因子、突触后密度蛋白95的蛋白表达增加(P < 0.05)；D组小鼠海马区上述两种蛋白表达均低于C组(P < 0.05)；与D组相比，E组突触后密度蛋白95的蛋白表达降低(P < 0.05)，脑源性神经营养因子的蛋白表达无明显变化(P > 0.05)，见图5。

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引言

脑老化是生物老化过程的显著特点之一，出现正常神经组织的退化、减少以及病变，主要表现为学习、认知和记忆功能的下降。如今世界人口老龄化趋势不可避免，且脑老化相关疾病包括阿尔茨海默症、帕金森病、唐氏综合征、血管性痴呆等严重影响患者正常生理活动和社会行为的疾病，因此积极探索延缓脑老化的手段及作用机制具有重要意义。
突触后密度蛋白95可影响突触的成熟、调控其连接，在影响突触结构以及影响突触信号传递及可塑性中发挥重要作用[1-2]。付燕等[3]发现利用D-半乳糖诱导的脑衰老大鼠在出现学习记忆能力下降的同时，海马组织突触后密度蛋白95 mRNA和蛋白的表达均出现了明显下降，说明衰老时由于海马神经细胞突触后密度蛋白95基因转录和翻译水平的降低，使突触后密度蛋白95表达降低。突触后密度蛋白95与学习、认知和记忆功能相关，其发生改变与脑老化密切相关，因此促进突触后密度蛋白95相关转录、表达以及修饰是改善脑老化中学习记忆能力的一种思路。
脑源性神经营养因子作用于高亲和力受体TrkB，在细胞分化、细胞存活、突触可塑性以及中枢神经系统的胚胎和成人神经发生中具有关键作用[4]。王子礼等[5]发现头顶一颗珠提取物可能通过提高海马组织内脑源性神经营养因子和TrkB表达、增强抗氧化能力来改善衰老大鼠认知功能障碍。此外，有研究发现，脑源性神经营养因子可通过抑制寡聚体Aβ25-35所致突触后密度蛋白95的蛋白水平降低来发挥其突触修复及神经保护作用[6]。
有研究表明，人参皂苷是人参具有生物活性的成分之一[7]，
已发现大约有40多种，其中以Rg1和Rb1最具有代表性。最新研究报道，人参皂苷对中枢神经退行性疾病如阿尔茨海默病等认知功能障碍疾病均有一定治疗作用[8-11]。人参皂苷Rg1的来源是五加科植物人参(Panax ginseng C.A.Mey.)的根，被用作滋补药品或用于抗炎[12]、神经保护等[13]。有研究发现，人参皂苷Rg1可通过NOX2-NLRP1[14]、NOX4-
NLRP3[15]、mTOR[16]、Wnt/β-catenin等信号通路对延缓脑老化发挥重要作用[17]。许方方等[18]发现人参皂苷Rb1可以提高阿尔茨海默症模型小鼠肝叶部分切除术后的学习记忆能力，其机制可能与其改善突触后密度蛋白95及神经元尼氏体的表达相关。于是，作者提出人参皂苷Rg1可能通过调控突触后密度蛋白95表达、脑源性神经营养因子/TrkB信号通路，从而防治和改善脑老化的猜想。
此次实验拟建立D-半乳糖诱导的脑老化小鼠模型，给予人参皂苷Rg1和选择性TrkB阻断剂ANA-12干预，并通过检测小鼠海马区脑源性神经营养因子、突触后密度蛋白95表达情况，探讨人参皂苷Rg1对D-半乳糖诱导脑老化小鼠学习记忆能力与海马区突触后密度蛋白95表达的作用，以及其与脑源性神经营养因子/TrkB信号通路的关系，为临床治疗脑老化及其相关疾病提供一定的理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2021年4-12月在华北理工大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物与分组选取50只雄性昆明种小鼠，3月龄，SPF级，体质量(23±2) g，购买于北京维通利华生物科技有限公司。饲养于通风、干燥的SPF级环境中，室温为(23±2) ℃，相对湿度为50%-60%，12 h/12 h明暗交替。适应性饲养7 d 后，参考王冬慧等[19]研究中的方法，利用随机数字表法将小鼠分为5组：A组不进行任何处理；B组皮下注射D-半乳糖溶液建立脑老化模型；C组造模1 h后灌胃给予盐酸多奈哌齐；D组造模1 h后灌胃给予人参皂苷Rg1 30 mg/(kg·d)；E组造模1 h后灌胃给予人参皂苷Rg1 30 mg/(kg·d)，并且腹腔注射选择性TrkB阻断剂ANA-12 0.2 mg/kg(每2 d一次)。实验方案、操作已经过华北理工大学动物委员会批准。
1.3.2 主要试剂与仪器人参皂苷Rg1(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq19040208)；盐酸多奈哌齐片(中国卫材药业有限公司，5 mg/片，批号：1905030)；D-半乳糖溶液(美国，Sigma公司)；选择性TrkB阻断剂ANA-12(美国，Selleck公司)；戊巴比妥钠(北京索莱宝科技有限公司，批号：922L035)；兔抗脑源性神经营养因子抗体(美国，ABclonal公司，货号：A11028)；HRP标记山羊抗兔IgG (H+L)(中国，沈阳万类生物科技有限公司，货号：WLA023a)；兔单抗突触后密度蛋白95(英国，Abcam公司，批号：238135)；全自动石蜡包埋机Leica EG1150H型(德国，LEICA公司)；实时荧光定量PCR仪AG6325型(德国，Eppendorf公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 脑老化模型建立参考田勇等[20]的文献所述，除A组外，其余各组小鼠颈背部皮下注射灭菌D-半乳糖溶液300 mg/(kg·d)构建衰老模型，A组注射等体积的灭菌生理盐水，持续6周。该操作于每日8：00-9：00进行。

根据翟春梅等[21]的研究对小鼠进行一般状态观察，与A组小鼠比较，B组小鼠饮水、摄食减少，毛皮晦暗无光泽、不顺滑，精神状态不佳、活动不活跃，并出现掉毛等现象，提示经D-半乳糖诱导的小鼠出现一系列衰老现象，即为造模成功。

1.4.2 给药方案注射D-半乳糖1 h后，C组灌胃给予盐酸多奈哌齐2 mg/(kg·d)[22]，D、E组参考吕静薇[23]的文献所述灌胃给予人参皂苷Rg1 30 mg/(kg·d)，其剂量依据动物和人按体表面积折算的等效剂量比率表，A、B组小鼠灌胃给予无菌生理盐水，以10 mL/kg作为各组灌胃量，1次/d；此外，E组参考赵佳佳等[24]的文献所述腹腔注射ANA-12 0.2 mg/kg，其余各组小鼠腹腔注射相同体积的生理盐水，以10 mL/kg作为各组注射量，每2 d一次，时间为14：00-15：00；与造模同步，持续6周。
1.4.3 小鼠一般状态观察观察各组小鼠日常的状态，如摄食、饮水、活动度、毛皮光泽、粪便度变化等方面。
1.4.4 学习记忆能力测试
旷场实验：干预结束后，参考陈晓禾[25]文献所述方法，将底端由9 cm×9 cm的25个小方格组成的45 cm×45 cm×45 cm的正方形旷场分为角地区，即4个角落方格；中心地区，即9个中间方格；其他地区，即除上述两种以外的剩余12个方格。于14：00-17：00将小鼠置于旷场中央，系统自动统计小鼠5 min内的总路程和平均速度。实验结束后用乙醇清除每只小鼠残留的气体。
新物体识别实验：旷场实验结束后，参考吕静薇[23]的文献所述方法，在60 cm(长)×40 cm(宽)×80 cm(高)的封闭箱体内，两边安置照明灯，顶端安装摄像头，物体放于四角距侧壁10 cm处。①适应期：连续3 d，适应10 min，自由活动。②熟悉期：第4天，在对称位置放入相同圆柱状红色物体，记录小鼠5 min内自由活动和探索。③测试期：30 min后进入测试阶段，将其中之一的圆柱状红色物体替换为正方形蓝色物体，记录小鼠5 min内对旧物体和新物体的探索时间。于14：00-17：00进行。相对辨别指数为(新物体探索时间-旧物体探索时间)与(新物体探索时间+旧物体探索时间)之比。
Morris水迷宫实验：新物体识别实验结束后，参考LI等[26]的文献所述方法，进行Morris水迷宫实验。装置为一直径120 cm的圆柱，通过2条经过圆心的相互垂直线将其均匀分为4个象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，在Ⅱ象限中固定一直径10 cm的圆形平台，水平面高于平台1 cm，水温(23±2) ℃。前5 d进行定位航行训练，训练小鼠1 min内找到平台，如没有则引导至平台并允许停留20 s，每只每天训练5次，每次起始位置随机抽签决定；第6天进行空间探索实验，与平台所在象限相对的象限放入小鼠，自由探索1 min。以摄像机记录运动轨迹。记录各指标，逃避潜伏期为入水至找到平台的时间；目标象限停留时间为1 min内在第Ⅱ象限停留时间；穿越平台次数为1 min穿越圆形平台的次数。各项指标均取平均值。
1.4.5 脑组织形态学观察
脑组织采集、固定和切片：学习记忆能力测试实验结束后，腹腔注射戊巴比妥钠150-200 mg/kg麻醉各组小鼠，在心尖处灌注无菌生理盐水，待小鼠肝脏完全变白，同时右心耳流出的液体澄清后，断头处死；每组随机选取5只小鼠，取全脑后置于40 g/L多聚甲醛中固定；每组剩下5只处死后冰上分离海马，经液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。脑组织固定后常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，5 μm厚切片，于60 ℃下烘干备用。
苏木精-伊红染色：切片常规脱蜡至水，按苏木精-伊红染色试剂盒说明书进行操作，苏木精染液10 min，1%盐酸乙醇15 s，水洗反蓝10 min，伊红染液3 min，洁净蒸馏水冲洗15 s，按浓度梯度乙醇脱水，用二甲苯透明，中性树胶封固后观察。
Nissl染色：切片常规脱蜡至水，按Nissl染色试剂盒说明书操作，Nissl染液染5 min，洁净蒸馏水洗涤3次，每次5 s，按浓度梯度乙醇脱水，用二甲苯透明，中性树胶封固后观察。
1.4.6 Western Blot检测各组小鼠海马区相关蛋白表达取各组小鼠新鲜海马组织，称质量后按比例加入裂解缓冲液，冰上匀浆，冰上静置30 min，离心(4 ℃，12 000 r/min离心20 min)，取上清液，全部冰上操作。蛋白浓度测定按BCA检测试剂盒说明书操作。SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶电泳，转膜于PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭，然后加入一抗突触后密度蛋白95(1∶1 000)、脑源性神经营养因子(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)室温下孵育，4 ℃过夜，3次TBST洗膜，加入二抗(1∶1 000)室温下孵育1 h，3次TBST洗膜，加入ECL发光液，用Quantity one软件进行检测，结果用A目标蛋白值/A内参值表示。
1.5 主要观察指标各组小鼠学习记忆能力、海马CA1区苏木精-伊红与Nissl染色结果、海马区脑源性神经营养因子、突触后密度蛋白95的蛋白相对表达量。
1.6 统计学分析采用SPSS 26.0软件分析与处理实验数据，用Graphpad Prism 8.0绘制统计图，符合正态分布的计量资料表示为x±s，组间比较采用LSD-t检验，多组间比较使用单因素方差分析，当P < 0.05时为差异有显著性意义。该文统计学方法已经华北理工大学生物统计学专家审核。

讨论

脑老化过程中突出且严重影响患者生活质量的表现就是认知、学习记忆能力下降，其病理生理机制复杂，涉及众多信号通路，与炎症反应、氧化应激、能量代谢障碍、自噬失控、线粒体功能障碍等均有密切关系[27-28]。作者前期研究发现，脑老化是众多与年龄相关联疾病的发病基础，如果朝着恶性的方向进展有可能会演变成如阿尔茨海默症和帕金森等神经退行性疾病[29]，因此如何延缓脑老化成为相关领域的关注重点。
研究表明，家兔、小鼠、大鼠等啮齿类动物如果长期系统性接触剂量较高的D-半乳糖，会导致机体氧化应激水平增高而抗氧化防御系统功能下降，进而加速其脏器尤其是脑的退行性变化，出现类似于自然脑老化的表现[30]。因此，D-半乳糖诱导的脑老化模型被广泛用于脑衰老机制以及延缓脑衰老策略的相关研究中[31]。此次实验采用持续6周皮下注射D-半乳糖方法以此诱导脑老化小鼠模型。实验中，B组小鼠被持续给予D-半乳糖过程中逐渐出现反应迟钝、精神萎靡、自发性活动减少等相似于衰老的体征，结合6周后的Morris水迷宫、新物体识别测试等结果发现，不管是记忆功能力还是空间学习能，A组小鼠比B组小鼠表现出明显升高，因此说明实验脑老化小鼠模型已成功建立。
突触后密度蛋白95是一种主要存在与突触后致密区的支架蛋白，大量存在于树突棘中，可通过影响其成熟与稳定性进而影响信号传递和可塑性。海马内突触相关蛋白表达水平与学习记忆紧密相关，突触后密度蛋白95位于突触后膜，与F-actin骨架蛋白、信号蛋白分子和神经递质受体共同形成复合物参与突触后信号的整合和转导[32-33]。VANGUILDER等[34]通过对不同月龄(12月龄和24月龄)的大鼠研究后发现，海马突触后密度蛋白95蛋白等表达水平下降与年龄相关的学习记忆功能降低与有关。付燕等[3]发现有氧运动可通过提高突触后密度蛋白95的含量，可改善D-半乳糖诱导脑老化大鼠学习记忆功能。此次实验结果显示，D-半乳糖诱导后小鼠学习记忆功能明显下降，而海马区突触后密度蛋白95蛋白表达显著降低，表明突触后密度蛋白95蛋白与D-半乳糖所致学习记忆功能下降存在密切关系，与前人研究一致。
人参皂苷Rg1具有保护神经细胞的作用，且与突触后密度蛋白95关系密切。杨璐萌[16]研究发现，人参皂苷Rg1可通过作用于海马区mTOR/p70-S6K/4E-BP信号通路促进突触相关蛋白突触后密度蛋白95、SYN-38、CaMKIIα等的翻译合成，从而能改善C57BL/6J小鼠的认知功能。有研究发现，人参皂苷Rg1可减轻缺氧缺糖再复氧模型中神经突触结构性损伤，表现为促进突触后密度蛋白95和降低p-Tau的表达[35-37]。王娟等[36-40]研究发现，人参皂苷Rg1可通过促进突触相关蛋白——突触后密度蛋白95的表达等机制达到保护慢性温和不可预期应激模型小鼠的抑郁样行为。此次实验结果提示，人参皂苷Rg1可在一定程度上改善D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠的学习记忆功能以及脑组织神经元变性和坏死，同时突触后密度蛋白95蛋白表达上升，这提示人参皂苷Rg1可能通过上调突触后密度蛋白95的表达来改善脑老化。而对比TrkB阻断剂组(E组)和Rg1治疗组(D组)可发现，E组突触后密度蛋白95蛋白含量显著下降，这提示人参皂苷Rg1提高突触后密度蛋白95蛋白表达的机制可能与脑源性神经营养因子/TrkB通路相关，但具体机制仍需进一步探索。
脑源性神经营养因子/TrkB信号通路具有重要作用，脑源性神经营养因子可与TrkB结合引起TrkB自身磷酸化增加，进而调控神经元的生长、分化及突触的形成等过程[41-43]。脑源性神经营养因子/TrkB信号通路与认知功能密切相关。近年来多项研究表明，激活脑源性神经营养因子/TrkB 信号通路将有助于改善认知功能障碍[44-45]，该通道可能是引起导致认知功能异常的原因之一[46]。并且，脑源性神经营养因子/TrkB信号通路与突触后密度蛋白95之间存在密切联系，如在对脑源性神经营养因子/TrkB/CREB信号通路的研究中，何丽玲等[47]发现大补元煎可通过上调该信号通路改善APP/PS1双转基因痴呆小鼠的海马突触可塑性，表现为突触后密度蛋白95和突触素表达增加。此外，ZHONG等[48]研究认为，人参皂苷Rg1可通过恢复脑源性神经营养因子/TrkB等信号通路抑制细胞凋亡，改善D-半乳糖和AlCl3诱导衰老小鼠的认知功能障碍。此次实验结果提示，人参皂苷Rg1可上调脑老化小鼠海马区脑源性神经营养因子蛋白表达；进一步通过选择性TrkB阻断剂ANA-12对脑源性神经营养因子/TrkB信号通路进行干预后，值得注意的是，脑源性神经营养因子作为TrkB的上游分子，与人参皂苷Rg1治疗组相比其含量并未出现显著变化，这同预期结果一致；但观察到小鼠海马区突触后密度蛋白95蛋白表达显著降低，结合小鼠行为学实验以及形态学染色结果，发现ANA-12在一定程度上可抑制人参皂苷Rg1对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠的保护作用，表现为学习记忆能力下降、脑老化程度加重和抑制海马中突触后密度蛋白95的表达，这提示脑源性神经营养因子/TrkB信号通路可能作为人参皂苷Rg1改善脑老化损伤的重要机制之一。
综上所述，人参皂苷Rg1可能通过调控脑源性神经营养因子/TrkB信号通路提高突触后密度蛋白95蛋的白表达，从而改善D-半乳糖诱导的脑老化小鼠神经元损伤与学习记忆能力，延缓脑老化。但其具体调控机制较为复杂，人参皂苷Rg1能否通过其他机制延缓脑老化？选择性TrkB阻断剂ANA-12对脑源性神经营养因子/TrkB信号通路进行干预后，TrkB蛋白表达变化如何？这些问题有待后续进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

人参皂苷Rg1对D-半乳糖诱导脑老化小鼠学习记忆功能的影响

Effect of ginsenoside Rg1 on learning and memory ability of brain aging mice induced by D-galactose

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