携双抗体纳米微泡对卵巢癌细胞增殖活性的影响

doi:10.12307/2023.974

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (3): 341-346.doi: 10.12307/2023.974

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携双抗体纳米微泡对卵巢癌细胞增殖活性的影响

吴天，赵越，胡蓉

新疆医科大学第一附属医院妇产超声诊断科，新疆超声医学重点实验室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2022-11-30 接受日期:2023-01-10 出版日期:2024-01-28 发布日期:2023-07-08
通讯作者: 胡蓉，博士，副主任医师，硕士生导师，新疆医科大学第一附属医院妇产超声诊断科，新疆超声医学重点实验室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:吴天，女，1996年生，河南省商丘市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事妇产超声诊断研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81660288)，项目负责人：胡蓉；新疆医科大学研究生创新创业项目(CXCY2022008)，项目负责人：吴天

Effect of nanobubbles carrying double antibodies on the proliferation of ovarian cancer cells

Wu Tian, Zhao Yue, Hu Rong

Xinjiang Key Laboratory of Ultrasound Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology Ultrasound, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2022-11-30 Accepted:2023-01-10 Online:2024-01-28 Published:2023-07-08
Contact: Hu Rong, MD, Associate chief physician, Master’s supervisor, Xinjiang Key Laboratory of Ultrasound Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology Ultrasound, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Wu Tian, Master candidate, Xinjiang Key Laboratory of Ultrasound Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology Ultrasound, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81660288 (to HR); Innovation and Entrepreneurship Project for Postgraduates of Xinjiang Medical University, No. CXCY2022008 (to WT)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

趋化因子受体4：是一种具有7次跨膜结构的G蛋白偶联受体，与癌症微环境的纤维化和免疫抑制等方面有关。肿瘤微环境内的基质细胞衍生因子1与其结合后，通常促进肿瘤细胞的生存增殖以及肿瘤血管的生成，它们还招募免疫细胞并引导它们做出特定的免疫抑制反应。
程序性细胞死亡受体：是位于T细胞表面的抑制性受体，与其配体1结合后可以抑制T细胞的活化，减少抗肿瘤细胞因子的产生，降低杀伤活性，从而使免疫系统沉默。

背景：免疫治疗可通过多种途径增强抗肿瘤免疫反应，联合免疫治疗是一个更好的选择。超声靶向微泡破坏技术可将药物、基因、抗体和细胞因子直接输送到免疫细胞的细胞质中，进一步增强免疫应答。然而，通过超声靶向微泡破坏技术将携趋化因子受体4抗体和细胞程序性死亡配体1抗体双靶向纳米微泡应用于卵巢癌的治疗尚未见报道。

目的：探讨超声辐照携趋化因子受体4抗体和程序性死亡配体1抗体双靶向纳米微泡对卵巢癌细胞增殖、迁移的影响。
方法：对IOSE-80正常卵巢上皮细胞及SKOV3、CAOV3卵巢癌细胞进行培养及扩增，采用双标记荧光免疫法对3种细胞中的趋化因子受体4和细胞程序性死亡配体1蛋白进行共定位，蛋白质印迹法检测3种细胞中趋化因子受体4和程序性死亡配体1蛋白相对表达量，并筛选出实验细胞。制备携不同配体的靶向纳米微泡后，即单纯的纳米微泡、携趋化因子受体4抗体的纳米微泡、携趋化因子受体4和程序性死亡配体1抗体的纳米微泡。取对数生长期的SKOV3卵巢癌细胞，分6组处理：A组加入McCoy’s 5A培养基，B组加入含基质细胞衍生因子1的McCoy’s 5A培养基，C组加入单纯的纳米微泡溶液与含基质细胞衍生因子1的McCoy’s 5A培养基，D组加入携趋化因子受体4抗体的纳米微泡溶液与含基质细胞衍生因子1的McCoy’s 5A培养基，E组加入携趋化因子受体4和程序性死亡配体1抗体的纳米微泡溶液与含基质细胞衍生因子1的McCoy’s 5A培养基，F组加入单纯的纳米微泡溶液，超声辐照120 s，孵育48 h后，采用CCK-8法检测细胞存活率，通过伤口愈合实验检测B-E组细胞的愈合迁移能力。

结果与结论：①免疫荧光染色显示，3种细胞均可表达趋化因子受体4和程序性死亡配体1蛋白；蛋白质印迹法检测显示，SKOV3、CAOV3卵巢癌细胞中的趋化因子受体4和程序性死亡配体1蛋白表达量均高于IOSE-80正常卵巢上皮细胞(P < 0.05)；②CCK-8检测结果显示，B组细胞存活率高于A组(P < 0.05)，F组细胞存活率低于A组(P < 0.05)，B-E组细胞存活率逐渐降低，组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)；③伤口愈合实验显示，B-E组细胞愈合率逐渐降低，组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)；④结果表明，超声靶向微泡破坏技术联合携趋化因子受体4抗体和程序性死亡配体1抗体双靶向纳米微泡可显著抑制卵巢癌细胞的增殖迁移。

https://orcid.org/0000-0002-6916-8966(吴天)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 卵巢肿瘤, 增殖, 靶向纳米微泡, 超声靶向微泡破坏, 趋化因子受体4(CXCR4), 程序性死亡配体1(PD-L1)

Abstract: BACKGROUND: Immunotherapy enhances the anti-cancer immune response in many ways, so combined immunotherapy is a better choice. Ultrasound-targeted microbubble destruction technique delivers drugs, genes, antibodies and cytokines directly to the cytoplasm of immune cells and enhances the immune response. However, the application of ultrasound-targeted microbubble destruction technique in the treatment of ovarian cancer with both CXC chemokine receptor 4 antibody and programmed death-ligand 1 antibody has not been reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of ultrasound irradiation on the proliferation and migration of ovarian cancer cells with CXC chemokine receptor 4 antibody and programmed death-ligand 1 antibody double targeted nanobubbles.
METHODS: IOSE-80 normal ovarian epithelial cells, SKOV3 and CAOV3 ovarian cancer cells were cultured and expanded. Double labeling fluorescence immunoassay was used to co-locate CXC chemokine receptor 4 and programmed death-ligand 1 protein. Western blot assay was used to detect the relative expression of CXC chemokine receptor 4 and programmed death-ligand 1 protein in three kinds of cells and screen out the experimental cells, i.e., pure nanobubbles, nanobubbles carrying CXC chemokine receptor 4 antibody, nanobubbles carrying CXC chemokine receptor 4 and programmed death-ligand 1 antibody. SKOV3 ovarian cancer cells in the logarithmic growth phase were taken and divided into six groups for treatment. Group A was added with McCoy's 5A medium. Group B was added with McCoy's 5A medium containing stromal cell-derived factor-1. Group C was added with pure nanobubble solution and McCoy's 5A medium containing stromal cell-derived factor-1. Group D was added with nanobubble solution containing CXC chemokine receptor 4 antibody and McCoy's 5A medium containing stromal cell-derived factor-1. Group E was added with nanobubble solution containing CXC chemokine receptor 4 and programmed death-ligand 1 antibody and McCoy's 5A medium containing stromal cell-derived factor-1. Pure nanobubble solution was added in group F. After ultrasonic irradiation for 120 seconds and incubation for 48 hours, the survival rate of cells was measured by CCK-8 assay, and the healing and migration ability of cells in groups B-E were measured by wound healing test.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Immunofluorescence staining showed that CXC chemokine receptor 4 and programmed death-ligand 1 protein could be expressed in all three kinds of cells. Western blot assay showed that the expression levels of CXC chemokine receptor 4 and programmed death-ligand 1 in SKOV3 and CAOV3 ovarian cancer cells were significantly higher than those in IOSE-80 normal ovarian epithelial cells (P < 0.05). (2) CCK-8 assay results exhibited that the cell survival rate of group B was higher than that of group A (P < 0.05). The cell survival rate of group F was lower than that of group A (P < 0.05). The cell survival rate of groups B-E decreased gradually, and there were significant differences between the two groups (P < 0.05). (3) Wound healing test demonstrated that the cell healing rate of groups B-E decreased gradually, and there were significant differences between the two groups (P < 0.05). (4) The results show that the use of CXC chemokine receptor 4 antibody and programmed death-ligand 1 antibody double targeted nanobubbles under ultrasound-targeted microbubble destruction can significantly inhibit the proliferation and migration of ovarian cancer cells.

Key words: ovarian tumor, proliferation, targeted nanobubble, ultrasound-targeted microbubble destruction, CXC chemokine receptor 4, programmed death-ligand 1

中图分类号:

吴天, 赵越, 胡蓉. 携双抗体纳米微泡对卵巢癌细胞增殖活性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 341-346.

Wu Tian, Zhao Yue, Hu Rong. Effect of nanobubbles carrying double antibodies on the proliferation of ovarian cancer cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(3): 341-346.

图/表（结果） 7

2.1 CXCR4与PD-L1蛋白在3种细胞中的共定位激光共聚焦显微镜下观察可见，CXCR4与PD-L1蛋白均可共定位于3种细胞，其中SKOV3、CAOV3卵巢癌细胞中CXCR4蛋白与PD-L1蛋白荧光强度均明显高于IOSE-80细胞(P < 0.000 1)，SKOV3与CAOV3卵巢癌细胞的两种蛋白荧光强度比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图1，2。

2.2 CXCR4与PD-L1蛋白在3种细胞中的表达量蛋白质印迹法检测结果显示，SKOV3、CAOV3卵巢癌细胞中CXCR4的蛋白表达量均明显高于IOSE-80细胞(P < 0.01)，两种癌细胞中PD-L1的蛋白表达量均明显高于IOSE-80细胞(P < 0.05)。而SKOV3与CAOV3卵巢癌细胞的两种蛋白表达量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.3 靶向纳米微泡连接抗体的鉴定结果与Alexa Fluor?488或Alexa Fluor?594标记的二抗孵育后，荧光显微镜下纳米微泡形态表现为大小均匀的球体，分散良好。单靶向纳米微泡在荧光显微镜下呈现绿色荧光，而双靶向纳米微泡同时呈现红、绿色荧光，红色荧光与绿色荧光重合发出橙黄色荧光，说明生物素化的微泡以链霉亲和素为桥梁成功偶联生物素化的CXCR4及PDL-1抗体，见图4。

2.4 各组SKOV3卵巢癌细胞的增殖活性比较选择SKOV3卵巢癌细胞为实验细胞，将细胞与干预液共孵育48 h后，A-F组细胞存活率分别为(92.5±3.9)%，(135.1±4.0)%，(116.7±1.6)%，(51.3±5.5)%，(28.6±3.1)%，(74.7±2.1)%。B组细胞存活率显著高于A组(P < 0.000 1)，C组细胞存活率显著低于B组(P < 0.05)，F组细胞存活率显著低于A组(P < 0.05)，D组细胞存活率较C组下降更加显著(P < 0.000 1)，E组细胞存活率低于D组(P < 0.01)，见图5。

2.5 各组SKOV3卵巢癌细胞的愈合迁移能力比较划痕后，SKOV3卵巢癌细胞与干预液共孵育48 h，B-E组细胞愈合率分别为(97.7±1.1)%，(72.1±3.9)%，(37.7±3.1)%，(16.5±3.4)%；C组细胞愈合率显著低于B组(P < 0.01)，D组细胞愈合率较C组下降更加显著(P < 0.001)，E组细胞愈合率低于D组(P < 0.01)，见图6，7。

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引言

卵巢癌是一种具有隐匿性生长、转移频繁、耐药快等特点的恶性肿瘤，具有较高死亡率[1]。患者在接受传统化疗后的几年内往往出现耐药现象，因此免疫疗法成为卵巢癌治疗的新革命[2]。为了优化激活肿瘤免疫循环，除了T细胞和抗原提呈细胞之间的共刺激信号传递外，还可通过靶向T细胞的受体或配体来抵抗肿瘤微环境的免疫抑制作用[3]。抗程序性细胞死亡受体及程序性死亡配体1(programmed Death-
Ligand 1，PD-L1)的免疫疗法，可使由于程序性细胞死亡受体1及其配体信号抑制而失活的T细胞重新活跃起来，有效阻断肿瘤活性[4]。然而有证据显示，阻断程序性死亡受体1及其配体虽可显著提高不同癌症的抗肿瘤效果[5]，但只有一部分患者表现出临床反应[6]。因此，理想的治疗方法是在激活特异性靶向肿瘤细胞T细胞的同时，减少肿瘤微环境中的免疫抑制细胞[7]。孙敏捷教授团队证实了趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)拮抗剂可减少抗PD-L1耐药肿瘤中的肿瘤纤维化，增加细胞毒性T淋巴细胞的渗透，减轻免疫抑制，从而调节免疫过程，提高抗PD-L1免疫治疗的客观应答率[8]。然而将抗CXCR4与PD-L1的联合免疫治疗应用于卵巢癌的相关研究少见报道。
超声靶向微泡破坏是一种靶向性、非侵入性、高效、新颖的基因/药物递送系统，其中微泡是基因/药物递送载体[9]。在精准医疗和靶向治疗流行的背景下，超声靶向微泡破坏因其独特的优势而备受关注，该技术在打开血脑屏障方面是可重复的，而且微泡在体内循环系统中运动时保持良好的稳定性[10]。超声靶向微泡破坏具有高度的特异性和针对性，通过修饰微泡来赋予它们定位能力[11]。超声靶向微泡破坏通过将化疗药物包裹在微泡中，在药物和器官或组织之间形成一道屏障，从而降低了化疗药物的毒性作用。并且，该技术可以调节药物或分子的释放速度，精确杀死肿瘤区域的细胞，不干扰整个身体的免疫细胞水平，从而缓解化疗引起的免疫缺陷[12]。此外，提高肿瘤免疫治疗效果是超声靶向微泡破坏最具临床价值的方面之一。LI等[13]、ILOVITSH等[14]的研究发现，超声靶向微泡破坏可通过扩张血管、促进热休克蛋白表达、增加肿瘤抗原暴露和促进细胞因子分泌，增强CD8+ T细胞浸润和T细胞介导的适应性免疫应答。TAN等[15]的研究证实了超声靶向微泡破坏可减轻CD71+红系祖细胞对Lewis肺癌模型的免疫抑制并促进抗PD-L1的免疫治疗，增强抗肿瘤效果。对于妇科肿瘤，超声靶向微泡破坏联合贝伐珠单抗或抗PD-L1抗体，可通过增加CD8+ T细胞的迁移和浸润提高宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌的疗效[16-17]。
因此，超声靶向微泡破坏与联合免疫治疗结合将是一种有前途的肿瘤治疗策略。为追求最大的抗肿瘤效果，此次实验通过制备的携CXCR4抗体和PD-L1抗体双靶向纳米微泡联合超声靶向微泡破坏技术，在体外实验中探索其对卵巢癌细胞增殖活性的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学观察实验，多组间比较使用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD法。
1.2 时间及地点实验于2022年1-7月在新疆医科大学第一附属医院科技楼完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞 IOSE-80人正常卵巢上皮细胞(STR鉴定正确)购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司，SKOV3及CAOV3卵巢癌细胞(STR鉴定正确)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.3.2 实验试剂及仪器无血清McCoy’s 5A培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司)；二棕搁酰磷脂酰胆碱(瑞士Adamas)；生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、链酶亲和素(西安瑞禧生物科技有限公司)；氮气(新疆金红山气体检测有限责任公司)；全氟丙烷(武汉纽瑞德特种气体有限公司)；PD-L1/CD274 Polyclonal antibody、CXCR4 Monoclonal antibody(武汉三鹰生物技术有限公司)；山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa Fluor® 488)、山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor® 594)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(英国Abcam)；基质细胞衍生因子1重组蛋白(美国MedChemExpress)；SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物(美国Thermo Fisher)；beta-Actin抗体(北京义翘神州)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学)；激光共聚焦显微镜(上海卡尔蔡司)；化学发光成像仪系统(上海勤翔科学仪器有限公司)；Vivid 7 超声诊断仪、高频探头i13L 14 MHz(美国GE)。
1.4 实验方法
1.4.1 双标记荧光免疫法对CXCR4与PD-L1蛋白共定位取对数生长期的IOSE-80细胞及SKOV3、CAOV3卵巢癌细胞，分别以1×108 L-1的细胞浓度接种到含盖玻片的24孔培养板中，每孔200 μL，孵育过夜；40 g/L多聚甲醛固定细胞，以PBS洗涤；0.5%Triton X-100处理，以PBS洗涤；37 ℃下用1%牛血清白蛋白封闭40 min，清除残余封闭液；滴加1∶500比例稀释的一抗(CXCR4、PD-L1)，4 ℃孵育过夜，以PBS洗涤；滴加1∶500比例稀释的Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 594标记的二抗，室温下避光2 h，以PBS洗涤；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，避光孵育5 min，充分冲洗，激光共聚焦显微镜下观察。
1.4.2 蛋白质印迹法检测CXCR4与PD-L1蛋白表达量收集铺满T25培养瓶的IOSE-80细胞及SKOV3、CAOV3卵巢癌细胞，数量约5×106个，1 000 r/min离心5 min，去除上清液；以PBS洗涤后收集在EP管中，加入裂解液，冰上裂解；4 ℃下12 000 r/min离心15 min，收集上清液，使用二喹啉甲酸法检测蛋白质浓度；将蛋白样品与上样缓冲液混匀，加热使蛋白变性，冷却；用10%分离胶和5%浓缩胶电泳分离蛋白质并转膜；室温下用5%脱脂奶粉封闭膜1 h，以PBS洗涤；4 ℃下加入CXCR4抗体(1∶400)、PD-L1抗体(1∶400)、β-肌动蛋白(1∶1 000)孵育过夜，以PBS洗涤；室温下与稀释比例分别为1∶5 000、1∶5 000、1∶10 000的二抗孵育1 h，以PBS洗涤；通过增强化学发光法及化学发光成像仪显像，以β-肌动蛋白为内参。利用Image J软件量化条带强度。
1.4.3 靶向纳米微泡的制备采用薄膜水化法制备空纳米微泡[18]，生物素-亲和素桥接法制备靶向纳米微泡[19]。按一定比例将二棕搁酰磷脂酰胆碱与生物素化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000溶于氯仿，置于旋转蒸发仪，吹入氮气使其充分挥发，抽真空；加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液水化薄膜，形成均匀的脂质体膜混悬液；装入西林瓶，抽真空并注入全氟丙烷；置于银汞调合器振荡30 s，得到生物素化空纳米微泡，于冰上保存；向空纳米微泡中加入链霉亲和素，4 ℃孵育，分层后弃下清液；每1×107个微泡加入生物素化CXCR4抗体或(和)PD-L1抗体1.5 μg，分别制备携载CXCR4抗体的纳米微泡、携CXCR4抗体与PD-L1抗体的纳米微泡，4 ℃孵育，分层后收集上层乳白色微泡，得到靶向纳米微泡，4 ℃下保存。以上操作避光下进行。
抗体携载验证：取约5×106个携CXCR4抗体与PD-L1抗体的纳米微泡，加入10 μL稀释比例为1∶500的Alexa Fluor® 488或Alexa Fluor®594标记的二抗，4 ℃避光孵育30 min，置于倒置荧光显微镜下观察。
1.4.4 CCK-8实验检测细胞存活率取对数期生长的SKOV3卵巢癌细胞，以5×107 L-1的细胞浓度接种于96孔板中，每孔100 µL，分6组处理：A组加入无血清的McCoy’s 5A培养基200 μL；B组加入PBS 100 μL与含100 ng/mL基质细胞衍生因子1的McCoy’s 5A培养基100 μL；C组加入单纯的纳米微泡溶液100 μL与含100 ng/mL基质细胞衍生因子1的McCoy’s 5A培养基100 μL；D组加入携CXCR4抗体的纳米微泡溶液100 μL与含100 ng/mL基质细胞衍生因子1的McCoy’s 5A培养基100 μL；E组加入携CXCR4抗体与PD-L1抗体的纳米微泡溶液100 μL与含100 ng/mL基质细胞衍生因子1的McCoy’s 5A培养基100 μL；F组加入单纯的纳米微泡溶液100 μL与McCoy’s 5A培养基100 μL。然后采用GE Vivid 7 超声诊断仪进行超声处理，i13L 14 MHz高频探头，机械指数0.6，辐照120 s[20]。孵育48 h后，加CCK-8溶液，用酶标仪于450 nm处测定吸光度值，计算存活率。实验重复3次。
1.4.5 伤口愈合实验检测细胞愈合迁移能力取对数期生长的SKOV3卵巢癌细胞，以5×108 L-1的细胞浓度铺于6孔板中，每孔加入1 mL；细胞生长达到90%融合后，用200 μL的枪头尖端进行划痕，按照1.4.4中B-E组方法处理，仅干预液与培养基的体积改为500 μL。48 h后，显微镜下观察和拍摄伤口愈合情况。使用Image J软件，将图片设置“Type”为“8-bit”，多次进行“smooth”处理，以便识别划痕边界；视情况调整图像阈值，适当舍弃个别散在的细胞，以便勾勒出面积进行测量。愈合率=(0 h划痕面积-48 h后的划痕面积)/0 h划痕面积×100%。实验重复3次。
1.5 主要观察指标各组SKOV3卵巢癌细胞存活率与愈合迁移能力。
1.6 统计学分析所有实验平均重复3次，采用统计软件SPSS 26.0分析实验数据，Shapiro-Wilk法对数据进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以x±s描述，多组间比较使用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD法；当P < 0.05时差异有显著性意义。文章统计学方法已通过新疆医科大学公共卫生学院统计学专家审核。

讨论

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，临床表现隐匿，前哨症状少，缺乏有效的筛查策略。卵巢癌的5年生存率较低，主要是由于复发和对化疗药耐药[21]。免疫治疗在各种癌症类型中取得了令人鼓舞的进展，但由于肿瘤微环境的特殊性，如缺氧、肿瘤血管畸形和免疫逃逸，以及目前免疫治疗的局限性，如脱靶毒性、药物渗透和积累不足以及免疫细胞功能障碍，大部分患者受益有限[22]。而超声靶向微泡破坏治疗有助于减少免疫治疗相关的不良事件。超声靶向微泡破坏的生物物理机制主要是空化作用(或称为声孔效应)(图8)，诱导血管内皮细胞之间的间隙增加，细胞膜的渗透性增加[23]。曾宏兴等[24]在探讨超声靶向爆破载藤黄酸微泡对人结肠癌细胞增殖和凋亡的影响时发现，超声辐照组的细胞凋亡率(16.33±0.45)%显著高于对照组(3.33±0.09)%。SHI等[25]的细胞侵袭实验结果也显示，单独超声辐照组与对照组相比癌细胞迁移数目显著减少，而超声与微泡联合比单独的超声处理产生的抑癌作用更明显，这为开发新的超声介导的癌症治疗提供了可能。

超声靶向微泡破坏突破了血管的限制，与血管外组织或肿瘤的标记物结合，从而有利于早期诊断、临床分期和疾病治疗。通过双标记荧光免疫法，此次实验发现3种细胞均可表达CXCR4和PD-L1蛋白。SKOV3、CAOV3卵巢癌细胞中出现了较强的绿色及红色荧光信号，且两种癌细胞的荧光强度相似，而IOSE-80细胞的荧光强度则弱于两种癌细胞。此外，这也验证了CXCR4、PD-L1与其抗体的结合通路，从而可在体内免疫循环中使失活的T细胞重新活跃起来，增强抗肿瘤作用。DAASSI等[26]、SHI等[27]研究认为CXCR4主要位于细胞膜上，PD-L1主要位于细胞膜和细胞质中，此次实验双重染色结果与之相似。蛋白质印迹法检测结果显示，SKOV3、CAOV3卵巢癌细胞中CXCR4、PD-L1蛋白的表达量均显著高于IOSE-80细胞，而两种癌细胞之间无显著差异，这为CXCR4、PD-L1成为卵巢癌治疗的靶点提供了可能。此外，HAO等[28]证明了抗PD-L1/CXCR4双功能纳米体对肿瘤细胞的抑制作用与CXCR4的表达有关，因此筛选SKOV3癌细胞作为实验细胞。此次实验也发现，卵巢癌细胞过表达的CXCR4和PD-L1蛋白在正常卵巢上皮细胞表面也存在，因此在以其为靶点的治疗策略中，为避免对正常组织的影响以保证特异性，可利用超声靶向微泡破坏技术精确定位到肿瘤组织，仅局部释放药物以减少对正常组织的损害，实现更高的治疗效率。
目前市售的微泡仅用于增强成像，而与药物、基因和疫苗整合的“下一代”微泡需要在未来进行优化并适应临床应用。此外，超声靶向微泡破坏的最佳参数还在不断研究中，治疗效果不仅与频率、机械指数、占空比和照射时间等超声参数相关，还与微泡剂量、环境温度、空气湿度和组织类型等非超声要素相关。关丽娜等[20]的研究显示，以机械指数0.6、靶向微泡浓度109 L-1、辐照时间120 s为微泡爆破条件的较优组合，高机械指数可使纳米泡爆破，而适宜的辐照时间可保护细胞及细胞微环境。因此，此次实验参考该微泡爆破条件，通过薄膜水化法及生物素-亲和素桥接法制备双靶向纳米微泡进行干预，比较SKOV3卵巢癌细胞增殖受抑制的程度。细胞体外实验显示，单纯基质细胞衍生因子1组的细胞存活率明显高于细胞对照组，同时单靶向纳米微泡组的细胞增殖活性明显低于纳米微泡+基质细胞衍生因子1组。BIASCI等[29]的研究也同样说明了在无血清培养体外细胞条件下，基质细胞衍生因子1可刺激CXCR4阳性表达的癌细胞增殖，并被CXCR4抗体所抑制。空泡且无基质细胞衍生因子1组与细胞对照组相比、空泡组与基质细胞衍生因子1组相比，细胞活性明显降低，这可能与超声靶向微泡破坏可刺激细胞内产生具有肿瘤杀伤作用的活性氧有关[25]。PD-L1抗体既作为靶向分子也具有一定的免疫作用。体外免疫荧光结果验证了PD-L1与其抗体的结合通路，这将会抑制肿瘤免疫逃逸，从而发挥一定的治疗效果。联合免疫疗法可在不同的免疫调节途径之间产生协同和相加的效应[30]。SAXENA等[7]的研究发现，CXCR4拮抗剂具有显著的单药抗肿瘤活性，也可与抗PD-L1免疫治疗产生疗效叠加效应，为CXCR4拮抗剂既可作为单一疗法又可作为免疫检查点抑制剂的有效辅助治疗提供了证据。此次实验与SAXENA等[7]、LU等[31]的研究结果一致，辐照后双靶向纳米微泡组与单靶向纳米微泡组相比，卵巢癌细胞的增殖能力显著降低，说明CXCR4抗体与PD-L1抗体联合治疗可协助提高反应效果，这可能对卵巢癌有更好的治疗作用，这也证明了双靶向的优越性，有利于靶向材料到达靶区，从而提高治疗效果。LU等[31]研发了CXCR4靶向脂质体制剂(脂质体-普乐沙福)，与游离普乐沙福相比，前者能更有效地重塑肿瘤免疫微环境，提高治疗效果。此次实验的这些纳米微泡外层包裹脂质体，同样增加了生物相容性，从而可提高细胞吞噬效率和药物传递效率。微泡不仅可以保护生物活性分子在运输过程中不被内源性清除，还可以通过惯性空化作用在病灶区释放，实现靶向治疗，减少全身性毒副作用[32]。与声动力疗法类似，微泡通过引起微血管破裂和肿瘤细胞凋亡、阻碍肿瘤血管生成和增强免疫治疗效果来调节肿瘤免疫抑制微环境[33]。目前，大多数超声靶向微泡破坏实验仍在体外或动物身上进行，考虑到人类环境的复杂性和异质性，超声靶向微泡破坏结合肿瘤免疫治疗的应用有必要进行进一步的临床试验。
综上所述，此次实验发现该双靶向纳米微泡可更大程度抑制卵巢癌细胞的生长，为超声靶向微泡破坏技术下CXCR4抗体与PD-L1抗体联合能加大抗肿瘤的免疫疗效作了铺垫。鉴于CXCR4抗体不但可以通过直接靶向基质细胞衍生因子1/CXCR4生物轴来控制癌细胞的增殖与转移，还能作为一种有效的免疫调节剂来防止多方面免疫抑制性肿瘤微环境的发展，在今后的工作中将进一步验证该方案可用于其他CXCR4或基质细胞衍生因子1表达水平高或低的癌症提高抗PD-L1免疫治疗的效果，为未来的临床试验奠定基础。
实验的局限性：①需进一步评估超声靶向微泡破坏和纳米微泡联合应用的安全性；②需深入体内研究，以阐明携该双抗体的靶向纳米微泡特异性结合肿瘤细胞、通过抑制免疫检查点PD-L1及阻断基质细胞衍生因子1/CXCR4生物轴抑制肿瘤生长和转移的分子机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

携双抗体纳米微泡对卵巢癌细胞增殖活性的影响

Effect of nanobubbles carrying double antibodies on the proliferation of ovarian cancer cells

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