氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层影响成骨细胞的生物学行为

doi:10.12307/2023.542

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (34): 5430-5435.doi: 10.12307/2023.542

• 组织工程骨材料 tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层影响成骨细胞的生物学行为

黄倩1，2，郝丽英3，贺龙龙1，2，杜良智1，2

1西安交通大学口腔医院，陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室，陕西省西安市 710004；2西安交通大学口腔医院种植科，陕西省西安市 710004；3四川大学华西口腔医院口腔疾病研究国家重点实验室，四川省成都市 610044

收稿日期:2022-06-27 接受日期:2022-09-02 出版日期:2023-12-08 发布日期:2023-04-20
通讯作者: 杜良智，副主任医师，西安交通大学口腔医院，陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室，陕西省西安市 710004；西安交通大学口腔医院种植科，陕西省西安市 710004
作者简介:黄倩，女，1988年生，陕西省西安市人，汉族，博士，助理研究员，主要从事种植体生物涂层材料、种植体周组织再生研究。
基金资助:
国家重点研发计划“智能机器人”重点专项 (2019YFB1302204)，项目负责人：杜良智；陕西省自然科学基础研究计划项目(2020JQ-564)，项目负责人：黄倩；陕西省卫生健康科研项目(2021E019)，项目负责人：黄倩

Graphene oxide-chitosan composite coating affects the biological behavior of osteoblasts

Huang Qian1, 2, Hao Liying3, He Longlong1, 2, Du Liangzhi1, 2

1Key Laboratory of Shaanxi Province for Craniofacial Precision Medicine Research, College of Stomatology, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China; 2Department of Implant Dentistry, College of Stomatology, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China; 3State Key Laboratory of Oral Diseases Research, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610044, Sichuan Province, China

Received:2022-06-27 Accepted:2022-09-02 Online:2023-12-08 Published:2023-04-20
Contact: Du Liangzhi, Associate chief physician, Key Laboratory of Shaanxi Province for Craniofacial Precision Medicine Research, College of Stomatology, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China; Department of Implant Dentistry, College of Stomatology, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China
About author:Huang Qian, PhD, Assistant researcher, Key Laboratory of Shaanxi Province for Craniofacial Precision Medicine Research, College of Stomatology, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China; Department of Implant Dentistry, College of Stomatology, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China
Supported by:
The National Key R&D Project “Intelligent Robot” Key Project, No. 2019YFB1302204 (to DLZ); Natural Science Basic Research Project of Shaanxi Province, No. 2020JQ-564 (to HQ); Health Research Project of Shaanxi Province, No. 2021E019 (to HQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

氧化石墨烯：是一种独特的二维材料，可以看作是石墨的单个单分子层，具有各种含氧官能团，如环氧化物、羰基、羧基和羟基，亲水性好，比表面积大，强度高，易修饰，并且具有良好的生物相容性，在医用材料领域具有广阔的应用前景，并且可以作为添加剂提高材料的机械性能和生物相容性。
壳聚糖：是一种氨基多糖，由甲壳类动物和昆虫中的几丁质脱乙酰化而成，具有天然抗菌性、促组织生长能力以及优异的成膜性和生物相容性，可以作为医用金属表面的涂层以有效改善材料生物学性能。

背景：壳聚糖作为医用金属表面的涂层材料可以有效改善其生物学性能，但单纯壳聚糖存在自身生物活性与成骨诱导能力不足的问题；氧化石墨烯能够提高多种聚合物材料的机械性能和生物相容性，并具有促进成骨分化的作用，将两者结合得到的涂层材料可能具有更好的生物性能和成骨活性。
目的：构建氧化石墨烯改性的壳聚糖复合涂层材料，分析涂层材料的表面形貌、化学组成和物理性质，并进一步分析涂层材料对成骨细胞增殖、黏附和成骨分化行为的影响。
方法：使用3-氨丙基三乙氧基硅烷对钛片表面进行处理，在钛片表面形成硅烷基团，然后利用戊二醛使壳聚糖与硅烷基团形成交联，分别制备单纯壳聚糖涂层与氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层。通过原子力显微镜、扫描电镜、傅里叶变换红外光谱仪、接触角测量系统表征涂层的表面形貌、化学结构及亲水性能。将大鼠成骨细胞直接接种于两种涂层材料表面，通过CCK-8实验、扫描电镜和半定量PCR分析材料对大鼠成骨细胞增殖、细胞铺展与成骨分化的影响。

结果与结论：①通过原子力显微镜测得氧化石墨烯片层的厚度为2 nm左右；扫描电镜下可见，两种涂层表面均光滑致密，其中壳聚糖分子紧密排列，氧化石墨烯能够均匀分布于壳聚糖中，同时由于石墨烯的加入，壳聚糖表面出现褶皱样形貌；氧化石墨烯-壳聚糖复合涂层的接触角小于单纯壳聚糖涂层(P < 0.05)；②CCK-8实验结果显示，相较于单纯壳聚糖涂层，氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层可促进成骨细胞的增殖；③扫描电镜下可见，单纯壳聚糖涂层表面的成骨细胞铺展性较差，氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层表面的成骨细胞表现出更好的铺展状态；④半定量PCR检测显示，氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层组碱性磷酸酶、Runx2 mRNA表达量多于单纯壳聚糖涂层组(P < 0.05)；⑤结果表明，氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层具有良好的理化性能、生物相容性和成骨诱导性能。

https://orcid.org/0000-0001-5602-9767(黄倩)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 氧化石墨烯, 壳聚糖, 二维材料, 涂层材料, 亲水性, 细胞黏附, 细胞增殖, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: As a coating material, chitosan can effectively improve biological properties of medical metal surfaces due to its excellent film-forming and metal binding abilities. However, the biological activity and osteoinductive ability of chitosan are insufficient. Graphene oxide can improve the mechanical properties and biocompatibility of various polymer materials, as well as promote osteogenic differentiation. The combination of chitosan and graphene oxide may have better biological properties and osteogenic activity.
OBJECTIVE: To construct the graphene oxide-modified chitosan composite coating material, analyze the surface morphology, chemical composition, and physical properties of the coating material, as well as the effects of the coating materials on proliferation, adhesion, and osteogenic differentiation of osteoblasts.
METHODS: The titanium surface was treated with 3-aminopropyltriethoxysilane to form silane groups on the surface, and then glutaraldehyde was used to cross-link chitosan with silane groups to prepare simple chitosan coating and graphene oxide/chitosan composite coating, respectively. The surface morphology, chemical structure and hydrophilic properties of the coatings were characterized by atomic force microscopy, scanning electron microscopy, Fourier transform infrared spectroscopy, and contact angle measurement system. Rat osteoblasts were seeded on the surface of the two materials, and the proliferation, spreading, and osteogenic differentiation of rat osteoblasts were analyzed by CCK-8 assay, scanning electron microscopy, and reverse transcription-polymerase chain reaction analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The thickness of the graphene oxide sheets was about 2 nm as measured by atomic force microscopy; the scanning electron microscopy showed that the surfaces of both coatings were smooth and dense, in which the chitosan molecules were closely arranged and the graphene oxide was uniformly distributed in the chitosan, while wrinkles appeared on the surface of chitosan due to the addition of grapheme. The contact angle of the graphene oxide-chitosan composite coating was significantly smaller than the chitosan coating alone (P < 0.05). (2) CCK-8 assay showed that the graphene oxide-chitosan composite coating better promoted the proliferation of osteoblasts compared with the chitosan coating alone. (3) The scanning electron microscopy showed that better spreading was found in osteoblasts on the surface of the graphene oxide-chitosan composite coating compared with the chitosan coating alone. (4) Reverse transcription-polymerase chain reaction analysis showed that the mRNA expression of alkaline phosphatase and Runx2 was significantly increased in the graphene oxide/chitosan composite coating group compared with in the chitosan coating alone group (P < 0.05). (5) These findings suggest that graphene oxide/chitosan composite coating had good biocompatibility, physicochemical, and osteoinductive properties.

Key words: graphene oxide, chitosan, two-dimensional material, coating material, hydrophilicity, cell adhesion, cell proliferation, osteogenic differentiation

中图分类号:

黄倩, 郝丽英, 贺龙龙, 杜良智. 氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层影响成骨细胞的生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(34): 5430-5435.

Huang Qian, Hao Liying, He Longlong, Du Liangzhi. Graphene oxide-chitosan composite coating affects the biological behavior of osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(34): 5430-5435.

图/表（结果） 8

2.1 氧化石墨烯的形貌测定通过原子力显微镜可以观察到氧化石墨烯在水中是以片层的形式存在的，同时测得石墨烯片层的厚度为2 nm左右，见图1。

2.2 氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层的表面形貌扫描电镜下可见，壳聚糖涂层表面光滑致密，其中壳聚糖分子紧密排列，表现出良好的成膜性，氧化石墨烯能够均匀分布于壳聚糖中，并未影响壳聚糖的紧密排列，同时在壳聚糖的表面由于石墨烯的加入出现褶皱样形貌，见图2。

2.3 氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层的化学结构傅里叶红外光谱检测结果显示，氧化石墨烯的特征性官能团峰如下：3 424 cm-1 处强吸收峰代表氧化石墨烯平面内羟基的伸缩振动；1 732 cm-1处为 C=O 伸缩振动；1 624 cm-1处代表芳环的特征峰；2 893 cm-1和2 984 cm-1为C-H的不对称和对称振动[15]。而壳聚糖材料特征性官能团则为：1 079 cm-1处代表伯醇的C-OH，1 632 cm-1 处为酰胺的伸缩振动峰，3 432 cm-1处为氨基的伸缩振动。氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层图谱中同时出现了壳聚糖和氧化石墨烯的特征峰以及重叠峰，同时在1 632 cm-1 处酰胺的伸缩振动峰增强，且峰形状发生改变，提示氧化石墨烯和壳聚糖之间可能有酰胺键形成，见图3。

2.4 氧化石墨烯-壳聚糖复合涂层的亲水性测定单纯壳聚糖涂层的表面亲水性较差，但在引入氧化石墨烯后复合涂层的亲水角变小，组间比较差异有显著性意义[(92.7±1.8)°，(83.4±0.6)°，P < 0.05]，见图4，表明氧化石墨烯的加入使得涂层材料表面的亲水基团增加，改善了壳聚糖的亲水性，这更有利于提高材料的生物相容性。

2.5 成骨细胞在两种涂层材料表面的增殖性能随着时间的延长，两组涂层表面的细胞活力逐渐增加，氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层组培养24，48，72 h的细胞活力均高于单纯壳聚糖涂层组(P < 0.05)，见图5，表明氧化石墨烯/壳聚糖涂层材料对成骨细胞的生物相容性优于单纯壳聚糖涂层材料。

2.6 成骨细胞在两种涂层材料表面的铺展扫描电镜下可见，单纯壳聚糖涂层表面的成骨细胞呈现出条形或接近圆形状态，铺展性较差；氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层表面的成骨细胞呈现为多角形，周围可见细胞突起，表现出更好的铺展状态，见图6。

2.7 成骨细胞在两种涂层表面的成骨向分化第1，2，4天，两种涂层表面成骨细胞的碱性磷酸酶和Runx2 mRNA表达量逐渐增加；第7天，两种涂层表面成骨细胞的碱性磷酸酶和Runx2 mRNA表达量降低。氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层组第2，4，7天的Runx2 mRNA表达量高于单纯壳聚糖涂层组(P < 0.05)，第4天的碱性磷酸酶mRNA表达量高于单纯壳聚糖涂层组(P < 0.05)，见图7。结果表明，氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层对成骨细胞的成骨分化诱导能力要强于单纯壳聚糖涂层。

2.8 涂层材料的生物相容性由CCK-8实验结果可知，氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层材料具有良好的生物相容性。

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引言

壳聚糖是由自然界中的几丁质经过脱乙酰后得到的一种高分子化合物，它来源广泛、具有良好的生物相容性和可降解性，可用于抗菌制剂、调节免疫功能和促进组织修复等。壳聚糖及其衍生物被广泛应用于伤口敷料、药物载体和组织工程支架材料、生物涂层等领域，目前已有多种壳聚糖类产品进入临床应用阶段，例如早在2002年壳聚糖止血辅料(HemCon绷带)就获得美国FDA认可，截至目前仅国内注册批准用于止血的壳聚糖纤维与海绵辅料产品已多达几十种，具有巨大的医学应用和研究价值。
石墨烯是一种单层的碳原子以sp2杂化结构排列的二维材料，它最早来自于英国两位科学家对石墨的机械分离[1-2]。
石墨烯具有良好的导电性、超高的机械性能与良好的生物相容性，被广泛地投入到光学、电学、生物材料的应用研究中。氧化石墨烯是石墨烯的一种衍生物，主要通过改进的Hummers法制备得到，该制备工艺成熟、产量大、制备成本低。在生物学领域，氧化石墨烯应用研究主要集中在组织再生、生物传感、载药和生物成像等方面，具有十分广阔的发展前景。并且，由于表面修饰了丰富的含氧官能团(如羟基、羧基和环氧基等)，氧化石墨烯能够在水等溶剂中保持稳定均匀的分散悬浮状态[3-4]，有利于氧化石墨烯与材料混合均匀。目前已有多项研究证明，氧化石墨烯能够提高多种聚合物材料的机械性能和生物相容性，并通过调节相关基因表达对组织细胞的生物学行为产生明显的影响[5-6]，显著扩展了聚合物材料在生物医学领域中的应用范围。
钛等医用金属材料具有强度高、韧性好及稳定性高等优点，但表面多为生物惰性，临床上目前多采用大颗粒喷砂-酸蚀、微弧氧化等技术改变钛表面的物理形貌和亲水性能，以促进成骨细胞的黏附、增殖和分化。钛表面的生物活性涂层材料能进一步改变其惰性表面，增强治疗效果，因此关于钛表面涂层材料的研究一直在进行，研究者仍在不断努力以得到具有满意的骨传导性和成骨特性的涂层材料[7-8]。壳聚糖具有优异的成膜能力及较强的金属结合能力，可以作为医用金属表面的涂层材料以有效改善其生物学性能，然而单纯的壳聚糖存在自身生物活性与成骨诱导能力不足的问题，通常需要对壳聚糖进行改性，以达到需要的效果[9-10]。针对这些问题，实验构建了一种氧化石墨烯改性的壳聚糖涂层，利用石墨烯的生物相容性和骨诱导性，以及石墨烯和壳聚糖的自组装性能，探讨涂层材料的理化性能，以及成骨细胞在涂层表面的增殖、黏附和成骨性能，研究氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层材料的应用价值。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料合成实验与材料表征，细胞实验，组间比较进行t检验。
1.2 时间及地点材料制备与材料表征于2020年5-12月在四川大学华西口腔医学院/口腔疾病研究国家重点实验室完成，细胞实验于2021年1月至2022年3月于西安交通大学口腔医学检测中心(陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室)完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物出生24 h内的SD大鼠10只，购自西安交通大学动物中心。实验过程参考国际惯例，遵循国家有关法律、法规，实验动物通过乙醚麻醉后快速颈椎脱位法处死，尽量缩短动物承受痛苦时间。实验方案经西安交通大学医学部生物医学伦理委员会批准。
1.3.2 实验试剂石墨粉(100目)购自阿法埃莎(中国)化学有限公司；壳聚糖(分子质量10-30 kD，纯度为99%)购自西雅试剂中心；钛片购自泰宇鑫金属材料有限公司；PBS(pH=7.40)和去离子水、高糖型改良DMEM培养基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶-EDTA均购自美国GiBCO生物公司；青霉素-链霉素混合溶液购自美国Hyclone公司；Ⅰ型胶原酶购自Biosharp公司；细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)购自日本同仁化学研究所；乙酸、氢氧化钠、3-氨丙基三乙氧基硅烷、戊二醛均为分析纯。
1.4 实验方法
1.4.1 单纯壳聚糖和氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层的制备
制备氧化石墨烯：氧化石墨烯通过改良的Hummers法制备[11-12]。将石墨粉在强氧化剂和超声波作用下氧化剥落后，依次用5%盐酸和双蒸水洗涤，直至pH值接近中性，离心弃去沉淀，最终得到氧化石墨烯水溶液。
制备涂层溶液：将1 g的壳聚糖加入2%乙酸水溶液中，不断搅拌直至壳聚糖完全溶解得到壳聚糖溶液；将氧化石墨烯溶液在超声下分散30 min后，逐滴加入搅拌中的壳聚糖溶液中，滴加完毕后持续搅拌1 h，使两种溶液充分混合，控制氧化石墨烯的加入量，使壳聚糖中氧化石墨烯质量分数为0.5%，得到氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层溶液。将壳聚糖溶液和等体积的双蒸水进行混合，得单纯壳聚糖涂层溶液。
涂层的制备：通过溶液共混法制备钛片表面涂层[13-14]，使用3-氨丙基三乙氧基硅烷对钛表面进行处理，在钛片表面形成硅烷基团，接着用戊二醛使壳聚糖与硅烷基团形成交联。使用前将钛片依次以240#、400#、600#、1 000#、1 500#、2 000#的砂纸打磨光滑，并用丙酮、乙醇和去离子水超声清洗，在3∶7的硝酸-去离子水溶液中浸泡30 min；去离子水洗净，然后将钛片浸泡于含2% 3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯中24 h，置于纯甲苯中超声清洗30 min，接着依次用乙醇和纯水清洗；将钛片再浸泡于2%戊二醛水溶液中24 h；超纯水洗净，将单纯壳聚糖涂层溶液或氧化石墨烯-壳聚糖复合涂层溶液旋涂于处理后的钛片表面，使钛片表面被溶液覆盖，静置1 h后以5 000 r/min的速度旋转60 s，置于60 ℃干燥箱中干燥；将涂层好的钛片依次浸泡在0.2 mol/L的磷酸氢二钠溶液和纯水中以除去残留的乙酸，分别制得单纯壳聚糖涂层与氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层。
1.4.2 涂层的性能测定与表征 ①涂层的表面形貌通过美国FEI公司的场发射扫描电子显微镜(FEI Inspect F)表征，使用数码镜头型号为MEGA VIEW-II DOCU，加速电压为20 kV；②氧化石墨烯的形貌和尺寸由日本岛津公司SPM-9700原子力显微镜在轻敲模式下进行表征；③涂层的化学组成由美国尼高力仪器公司的IS10傅里叶变换红外光谱仪进行表征，将 KBr和测试材料的混合物研磨成充分混合的超细粉末并压制成透明薄片，光谱检测范围为500-4 000 cm-1；④亲水性的测定使用的是 DataPhysics’OCAH 200光学高速接触角测量系统，将10 μL双蒸水滴在涂层材料表面，利用软件对液滴图片分析，测定接触角。所有实验独立重复操作3次，取平均值。
1.4.3 成骨细胞原代培养选用出生24 h内的SD大鼠，无菌条件下分离大鼠颅骨并浸泡于PBS中，将颅骨上可视的血管筋膜等结缔组织去除，然后将颅骨剪碎成大小约1 mm×1 mm的小碎片，并将碎片浸泡于0.25%的胰蛋白酶-EDTA中，在37 ℃条件下放置20 min，以进一步将结缔组织消化去除。接着，将胰蛋白酶消化液弃去，留下的骨碎片用PBS洗涤3次，接着用0.075%的Ⅰ型胶原酶在37 ℃条件下消化60 min；消化完成后弃去骨碎片，并将消化液移至一个新的15 mL离心管中，加入含血清培养基中和胶原酶，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液；用含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的H-DMEM重悬沉淀，得到单细胞悬液，将细胞悬液分装至T25的培养瓶中，放入细胞培养箱中培养，细胞培养的条件为：温度37 ℃、体积分数5%CO2、体积分数95%空气。5 d后首次换液，待细胞融合率达到80%时传代。选择P1、P2代用于后续的细胞实验。
1.4.4 涂层对细胞增殖的影响将两种涂层后的钛片(直径15 mm)紫外消毒后置于24孔板底部，将大鼠成骨细胞接种于两种涂层表面，每孔细胞数量为5×104，培养液量为0.5 mL。接种后24，48，72 h，首先将原有培养基弃去，用PBS洗涤贴壁细胞，接着计算所需反应液的量，配制含有10%CCK-8试剂的无血清培养基，每孔中加入500 μL的CCK-8反应液，在37 ℃条件下孵育2 h后，吸取100 μL反应后的上清液并移至一个新的96孔板对应的孔中，用多功能酶标仪(Varioskan Flash 3001)在450 nm波长测量各孔的吸光度值。
1.4.5 涂层对细胞铺展的影响将两种涂层后的钛片(直径15 mm)铺于24孔板底部，将成骨细胞接种于涂层表面，每孔细胞数量为2.5×105，培养液量为0.5 mL。24 h后弃去细胞培养液，用PBS洗涤2次后，加入含有2.5%戊二醛的电镜标本固定液，在4 ℃条件下固定过夜，接着弃去固定液，用不同体积分数乙醇进行梯度序列脱水(50%，60%，70%，80%，90%)，其中每一梯度浓度乙醇脱水时间为10 min。最后将脱水完成后的材料放置于通风处晾干，得到的干燥的细胞+材料标本进行喷金，扫描电镜下观察。
1.4.6 涂层对细胞成骨相关基因表达的影响选用直径33.9 mm的钛片制备两种涂层，并将涂层后的钛片铺于6孔板底部，将大鼠成骨细胞接种于涂层材料表面，每孔细胞数量为5×105，培养液量为2.5 mL。培养第1，2，4，7天，对孔板内细胞进行RNA收样，使用Bioteke公司总RNA提取试剂盒(Trizol法)对RNA进行分离提纯。
RNA反转录成cDNA使用TaKaRa的PrimeScript RT Reagent试剂盒，凝胶电泳使用西班牙的Biowest琼脂糖。PCR反应试剂及步骤为：TIANGEN Taq PCR MasterMix 12.5 µL，cDNA 1 µL，引物2 µL，无酶水 9.5 µL，将以上试剂混合，然后于PCR扩增仪中95 ℃下预变性3 min，再以下述步骤重复30-35圈：95 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃合成30 s；循环结束后，72 ℃下保持10 min后反应结束，样品保持4 ℃保存。

PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳进行分析，DNA染料使用GoldView Ⅱ型核酸染色剂(Solarbio)，电泳后利用凝胶成像系统(Gel Doc 2000 system，BIO RAD，U.S.)进行条带的显像和拍摄，利用软件quantity one和Image Pro Plus 6.0对条带进行定量分析，所用引物的序列见表1。

1.5 主要观察指标两种涂层的理化性能及对成骨细胞增殖与分化的影响。
1.6 统计学分析使用SPSS 21.0软件(SPSS，美国)进行数据处理，组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法己由西安交通大学生物统计学专家审核。

讨论

改良Hummer法通过将石墨氧化增大了石墨层之间的间距，此时通过物理方法则容易将氧化石墨烯分离，得到氧化石墨烯，氧化石墨烯由于表面带有含氧官能团，使得它不仅具有良好的化学稳定性，而且亲水性更好，使其更容易溶解和分散在水溶液或聚电解质溶液中[16-18]。由于氧化石墨烯在水中带负电荷，而壳聚糖带正电荷，氧化石墨烯和壳聚糖通过静电层层自组装作用均匀混合，这种自组装的方式也是石墨烯类复合材料的常用制备方法，有利于形成均匀稳定的复合材料，进而发挥出更加稳定的性能[19-20]。理论上的单原子层石墨烯厚度为0.35 nm，石墨烯在氧化后由于表面存在各种含氧官能团，厚度大于石墨烯，在已知文献中报道的氧化石墨烯的厚度为1 nm或1 nm以上[21-22]，因此可以推测该实验中制备得到的氧化石墨烯为单层或双层结构。
细胞铺展的动力学过程是细胞与细胞外基质相互作用的第一步，细胞在悬浮液中呈圆形，当接触基底后细胞先锚定在基底表面，然后在不同附着蛋白质的作用下细胞骨架组装发生变化，细胞周边伸出伪足，细胞逐渐在基底上展平，它对细胞迁移、细胞生长及组织形成有着重要的作用[23-24]。
实验中材料-细胞标本的扫描电镜显示，在细胞接种到涂层材料表面24 h后，单纯壳聚糖涂层材料表面的细胞更多的表现出的是未铺展状态，而氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层材料表面细胞铺展状态明显好于单纯壳聚糖涂层材料，这说明了氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层材料更有利于成骨细胞在黏附后快速地铺展，这对成骨细胞的增殖、迁移以及种植体更快形成骨结合是有利的。而随后的细胞增殖实验和半定量PCR进一步证实，大鼠成骨细胞在氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层材料表面的增殖速度明显快于单纯壳聚糖涂层材料，并且氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层材料在没有成骨诱导液的情况下Runx2和碱性磷酸酶的mRNA表达水平要明显高于单纯壳聚糖涂层材料。
Runx2和碱性磷酸酶在骨组织形成的调控中发挥着重要的作用，Runx2是参与成骨细胞分化和骨骼形态发生的转录因子，同时他还作为骨相关基因表达的调节因子，对于成骨细胞的成熟必不可少；碱性磷酸酶基因则是一种蛋白质编码基因，转录生成的碱性磷酸酶通过代谢各种磷酸盐化合物，在骨骼和牙齿的矿化中起到关键作用，因此，Runx2和碱性磷酸酶基因的表达量代表了细胞的成骨分化水平。此次实验显示，在没有成骨诱导液存在的情况下，复合涂层表面细胞表达的Runx2和碱性磷酸酶水平相较于单纯壳聚糖涂层明显提高，说明加入了氧化石墨烯后复合涂层材料促成骨分化的作用增强。这与石墨烯本身的促成骨作用有关，已有确切的研究表明，石墨烯材料在无任何诱导剂的情况下具有促进细胞增殖和骨诱导能力。这种成骨诱导作用归功于石墨烯表面特殊的理化性质：石墨烯能够通过非共价结合比如静电作用、大π键在表面吸附多种蛋白以及成骨促进物；石墨烯的表面形貌能够影响细胞分化，石墨烯的高度扭曲结构和高硬度为成骨分化提供了机械刺激[25-27]。
在对涂层的表征中，此次实验发现氧化石墨烯改变了涂层材料的表面结构与性能，在加入氧化石墨烯后，复合涂层材料的表面形貌发生了变化，相比于壳聚糖表面的光滑形貌，氧化石墨烯/壳聚糖涂层材料表面出现了褶皱，而材料表面的形貌也是影响种植体骨整合效果的一个因素，粗糙的表面相比于光滑表面更有利于骨整合的形成。在对接触角测试中发现，氧化石墨烯还提高了涂层材料的表面亲水性能，已经证实亲水性对材料的细胞相容性有着重要作用，亲水性好的材料也更有利于细胞的黏附和生长，加速种植体表面骨结合的形成[28]。因此，作者推断氧化石墨烯/壳聚糖涂层材料亲水性的提高更有利于材料表面对蛋白的吸附，以及材料表面形貌变化能对细胞提供一定的机械刺激，也在一定程度上改变了成骨细胞的增殖、铺展和成骨分化行为。
综上所述，实验制备了一种氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层，并将其用于增强壳聚糖涂层的生物相容性，结果表明氧化石墨烯在壳聚糖中具有良好的分散性，氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层材料促进了成骨细胞的增殖和细胞铺展；此外，氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层促进了成骨细胞碱性磷酸酶和Runx2的表达，具有明显的促成骨向分化作用。实验制备的氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层材料在理化性能和生物活性方面表现出更好的改进，而且生产成本低。但要投入临床应用，不能忽视氧化石墨烯在机体内的长期影响，在实验中还需要对细胞与机体的生物反应进行更深入全面的测试，并探讨氧化石墨烯复合材料的长期毒性和体内降解情况。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

氧化石墨烯/壳聚糖复合涂层影响成骨细胞的生物学行为

Graphene oxide-chitosan composite coating affects the biological behavior of osteoblasts

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