2.1   Ad-BMP2及Ad-Simshn3转染C3H10T1/2细胞   取对数期生长的C3H10T1/2细胞以约1×105/孔的密度铺板至24孔板，细胞贴壁后分别加入不同剂量的重组腺病毒感染，碱性磷酸酶染色观察两组腺病毒处理后5，7 d碱性磷酸酶的表达情况，并参考光学显微镜及荧光显微镜下细胞状态及荧光转染情况选择最佳感染剂量；分别提取最佳感染剂量感染48 h后细胞总mRNA分析BMP2及Shn3的mRNA相对定量值。结果显示：两种重组腺病毒均能成功感染C3H10T1/2细胞；BMP2最佳感染剂量为1.6 μL，Simshn3最佳感染剂量为2.0 μL；1.6 μL Ad-BMP2组较Ad-GFP对照组BMP2 mRNA表达水平显著增高，2.0 μL Ad-Simshn3组较Ad-RFP对照组Shn3 mRNA表达水平显著降低，差异均有显著性意义(P < 0.01)，见图1。因此，后续实验中Ad-BMP2的使用量为1.6 μL/105个细胞，Ad-Simshn3的使用量为2.0 μL/105个细胞。



2.2   抑制Shn3后促进了BMP2诱导C3H10T1/2细胞碱性磷酸酶表达   C3H10T1/2 细胞在各组腺病毒(Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-Simshn3及Ad-BMP2+Ad-Simshn3)感染24 h后观察荧光表达，检测各组重组腺病毒作用3，5，7 d后碱性磷酸酶染色及碱性磷酸酶mRNA转录水平，结果显示，Ad-BMP2能诱导碱性磷酸酶的表达，抑制Shn3能增强BMP2诱导细胞碱性磷酸酶的表达；Ad-BMP2组碱性磷酸酶mRNA表达量显著高于Ad-GFP组，Ad-BMP2联合Ad-Simshn3组碱性磷酸酶mRNA表达量显著高于Ad-BMP2组，差异均有显著性意义(P < 0.01)，见图2。以上结果提示抑制Shn3能显著增强BMP2诱导C3H10T1/2 细胞中碱性磷酸酶的表达。



2.3   抑制Shn3促进BMP2诱导的C3H10T1/2细胞早、晚期成骨分化    成骨标志物的表达是检测间充质干细胞成骨分化的标准之一，随着细胞分化骨基质矿化不断增多，成骨分化的晚期标志钙盐结节也会增加。RT-qPCR检测各组重组腺病毒作用7 d后骨钙素、成骨细胞特异性转录因子、Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原mRNA转录水平。结果显示，Ad-BMP2组成骨细胞特异性转录因子、骨钙素、Ⅰ型胶原、Runt相关转录因子2 mRNA转录水平较Ad-GFP对照组显著增高，抑制Shn3后BMP2诱导的成骨细胞特异性转录因子、骨钙素、Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原mRNA转录水平较Ad-BMP2组显著增高。茜素红染色及半定量分析结果显示，成骨培养基诱导21 d后Ad-GFP组无明显钙盐结节形成，Ad-BMP2组有显著钙盐结节形成，Ad-BMP2联合Ad-Simshn3组相较Ad-BMP2组表现出更显著的钙盐沉积作用，见图3。




2.4   抑制Shn3促进C3H10T1/2细胞成血管因子表达   骨形成往往伴随着血管形成，实验进一步检测了各组重组腺病毒处理C3H10T1/2细胞7 d后成血管因子的表达。RT-qPCR结果显示Ad-BMP2组成血管标志物神经轴突导向因子、血管内皮生长因子、血管性血友病因子、促血管生成素、内皮黏蛋白 mRNA转录水平较Ad-GFP组显著增高，Ad-BMP2联合Ad-Simshn3组相较Ad-BMP2组进一步显著增高，见图4。




2.5   抑制Shn3增强BMP2诱导C3H10T1/2细胞Ⅰ型胶原、血管内皮生长因子、内皮黏蛋白表达   以上实验结果提示抑制Shn3能够有效增强BMP2诱导的C3H10T1/2细胞成骨及成血管因子的转录表达，因此进一步检测Ⅰ型胶原、血管内皮生长因子、内皮黏蛋白的表达。免疫组织化学染色结果显示，Ad-BMP2组Ⅰ型胶原蛋白的表达量较Ad-GFP组显著增强，Ad-Simshn3组血管内皮生长因子、内皮黏蛋白表达量相较Ad-GFP组明显增强，Ⅰ型胶原、血管内皮生长因子及内皮黏蛋白在Ad-Simshn3联合Ad-BMP2组中的表达相较单独处理进一步增强，且表达水平7 d显著高于5 d，见图5。



2.6   抑制Shn3增强小鼠脑微血管内皮细胞小管形成   小管形成实验是对血管内皮细胞血管生成的功能性评价，因此进一步检测抑制Shn3对BMP2诱导成骨过程中血管生成的影响。bEnd.3细胞铺板4 h后于光学显微镜下观察到Ad-GFP组、Ad-BMP2组、Ad-Simshn3组均未形成明显小管，Ad-BMP2联合Ad-Simshn3组开始出现小管雏形；Ad-Simshn3组培养8 h后开始出现小管，至12 h时出现多个显著小管；Ad-BMP2联合Ad-Simshn3组12 h后小管密度逐渐增高且部分区域出现管腔减小的现象；持续8 h及12 h后观察Ad-Simshn3组亦出现小管，并随培养时间延长而增多，见图6。血管生成实验是对血管内皮细胞的功能性评价，可以反映小鼠脑微血管内皮细胞在体外形成血管环的能力。



2.7   抑制Shn3增强BMP2诱导C3H10T1/2细胞裸鼠皮下异位成骨  上述实验证实抑制Shn3显著增强BMP2诱导C3H10T1/2细胞成骨分化及血管形成，因此进一步在裸鼠皮下植入各组腺病毒处理后的C3H10T1/2细胞以观察皮下异位骨块形成情况。结果显示：小动物X射线片检测显示
Ad-GFP组不形成异位骨块，Ad-BMP2组在裸鼠皮下形成的异位骨块显著大于Ad-Simshn3组，但Ad-BMP2+Ad-Simshn3组骨块显著大于Ad-BMP2组，见图7A，B；苏木精-伊红染色及Masson染色结果显示Ad-BMP2+Ad-Simhn3组成熟骨组织相较Ad-BMP2及Ad-Simshn3单独作用组显著增高，见图7C。

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严重骨折导致的大段骨缺损、老年骨质疏松性骨折不愈合、股骨头坏死等是目前骨科临床治疗面临的难点，由于局部或全身因素的影响，骨愈合常无法达到满意的效果[1]。目前Masquelet技术、仿生材料及3D打印技术已成功应用于大段骨缺损，但存在自体骨来源有限、供区并发症、假体磨损和二次手术的风险[2-4]。间充质干细胞可在多种细胞因子作用下经增殖、迁移、分化最终成为骨细胞，已广泛应用于骨组织工程的基础研究。
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)属于转化生长因子β(transforming growth factor-β， TGF-β)超家族，是多功能分泌性酸性糖蛋白信号分子，在胚胎和器官发育过程中具有形态发生的作用[5]。BMP2、BMP7均已被美国 FDA 批准应用于临床，是目前自体骨移植的有效替代方案[6]。统计分析显示在总体的治疗效果及对感染性骨不连的治疗效果两方面，BMP2优于BMP7，尤其是在感染性骨不连的治疗中BMP2展现出更为优越的治疗效果[7]。BMP2也是骨组织工程基础研究中常用的生长因子，具有诱导间充质干细胞成骨、成软骨分化的巨大潜力[8-10]。BMP2主要以3种形式存在，其中16 kD肽片段成骨诱导能力最强，通过活化下游经典BMP/Smad 信号通路和非经典BMP-MAPK信号通路诱导间充质干细胞成软骨、成骨分化[11-12]；但近年来临床研究发现BMP2的使用增高了炎症、异位骨形成、脊柱融合以及肿瘤的发病率[13]。
锌指蛋白3(Schnurri3，Shn3)又称人免疫缺陷病毒Ⅰ型增强子结合蛋白3，参与免疫、发育和转移相关基因的转录，调节免疫球蛋白(Ig)基因重排、细胞存活、巨噬细胞中肿瘤坏死因子信号传导等过程[14-15]；有研究显示Shn3可通过调节干细胞多向分化能力影响出生后发育和重塑[16-18]，参与调节Dpp/TGF-β信号通路中TGF-β信号的转导[19-20]。BMPs/Smad信号通过与Mad/Medea结合进入胞核调控靶基因的表达，而锌指蛋白负责调控Mad与Medea的表达[21-22]。因此，Shn3可能参与调节成骨诱导因子BMP2诱导间充质干细胞成骨分化过程，但两者之间有无联系以及以何种方式联系尚不清楚，故该研究拟在体外运用腺病毒Ad-BMP2、Ad-Simshn3探究Shn3对BMP2诱导间充质干细胞成骨分化的影响及机制，为临床骨折修复、骨缺损及骨不连提供新的实验基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1    设计   体外细胞学实验及裸鼠实验；统计学方法根据实验设计不同分别为：组间比较采用Studen t检验，多组比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2018年10月至2019年12月在重庆医科大学生命科学研究院涂小林实验室及生科院大平台完成。
1.3   材料
1.3.1   细胞及试剂   人胚肾293细胞(HEK-293，ATCC® CRL-1573™，货号：GNHu43)；C3H10T1/2细胞系(ATCC® CCL-226™，货号：SCSP-506)；小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3，ATCC®CRL-2299，货号：CL-0598)由实验室冻存于液氮中。HEK-293细胞、C3H10T1/2细胞均在DMEM完全培养基(90% DMEM、体积分数10%胎牛血清、100 mg/L链霉素和100 kU/L青霉素)中培养；小鼠脑微血管内皮细胞在内皮细胞完全培养基(90%ECM、体积分数10%胎牛血清，100 mg/L链霉素和100 kU/L青霉素)中培养；以上所有细胞均置于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱。碱性磷酸酶染色试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；茜素红S染料、氯化十六烷基吡啶及DAB购自重庆塞米克生物科技有限公司；反转录及实时荧光定量PCR试剂盒均购自大连宝生物技术有限公司；Trizol购自Invitrogen公司；Ⅰ型胶原、血管内皮生长因子抗体及抗兔二抗购自武汉三鹰；内皮黏蛋白抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；染色试剂均购自北京索莱宝生物科技有限公司；RT-qPCR引物由上海生工设计、武汉金斯瑞生物科技有限公司合成。重组腺病毒均由重庆德诺和生物科技有限公司包装合成。
1.3.2   实验仪器   CO2孵箱(Thermo Fisher)；倒置荧光显微镜(Nikon)；常温低速离心机(平凡仪器)；高速低温离心机(Sigma)；微型离心机(武汉生工)；荧光定量PCR仪(Bio-Rad)；普通光学显微镜(Leica)；酶标仪(百乐)；核酸浓度测量仪(Implen)；超声波破碎仪(Sonics & Materials)。
1.3.3   实验动物   实验用4周龄雄性裸鼠20只，分4组，每组5只，体质量约30 g，购自重庆医科大学实验动物中心。实验方案经重庆医科大学实验动物伦理委员会批准，审批号为approval no.2020062。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.4   方法   
1.4.1   重组腺病毒的扩增及滴度测定   该研究中所用到的重组腺病毒Ad-GFP、Ad-RFP、Ad-BMP2(增强BMP2表达)和Ad-Simshn3(抑制Shn3表达)均采用HEK-293细胞扩增。具体步骤为：HEK-293细胞以70%左右密度铺板至直径100 mm的培养皿中，细胞贴壁后加入适量病毒感染。光镜下观察到HEK-293细胞变圆、亮度明显增高且荧光表达明显后，待约50%细胞明显漂浮时，离心收集细胞，利用液氮及37 ℃水浴反复冻融裂解，低温高速离心收集上清，获得研究所需的腺病毒。按照绿色荧光蛋白标记法进行滴度测定[23]，滴度分别为：Ad-BMP2：1.87×1011 GFU/mL；Ad-Simshn3：1.56×1011 GFU/mL；Ad-GFP：2.10×1011 GFU/mL；Ad-RFP：1.73×1011 GFU/mL。 
1.4.2   实验分组与重组腺病毒剂量测定   实验分对照组(Ad-GFP)和实验组( Ad-BMP2、Ad-Simshn3及Ad-BMP2+Ad-Simshn3)。实验前，将处于对数生长期的C3H10T1/2细胞以约1×105 /孔的密度接种于24孔板，贴壁3 h后，Ad-BMP2以如下体积：0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 μL/孔梯度添加重组腺病毒原液感染细胞，Ad-Simshn3以如下体积：0.25，0.5，1.0，2.0，4.0 μL/孔梯度添加重组腺病毒原液感染细胞，5，7 d后进行碱性磷酸酶染色，选择Ad-BMP2处理后染色逐渐加深但并非最强的组别及Ad-Simshn3处理后染色无显著变化组别，按照前述要求重新铺板C3H10T1/2细胞并加入病毒原液，根据24 h后细胞状态、荧光表达情况及48 h后BMP2、Shn3 mRNA 相对表达量确定最佳感染剂量。
1.4.3   碱性磷酸酶染色   将处于对数生长期的C3H10T1/2细胞以约1×105/孔的密度接种至24孔板，贴壁3 h后，加入各组重组腺病毒最适剂量培养3，5，7 d后对细胞进行碱性磷酸酶染色(n=3)。

1.4.4   细胞总RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)   将处于对数生长期的C3H10T1/2 细胞以约1×105/孔的密度接种于24孔板，贴壁3 h后，加入相应滴度病毒作用7 d后加入Trizol提取总RNA，具体操作步骤：无菌无酶枪头充分倒刮加入150 μL TRIzol/孔转入1.5 mL EP 管，室温处理5 min以充分裂解细胞，加入1/5体积氯仿室温放置2 min用以萃取RNA，低温高速12 000×g离心15 min收集上层透明水相并记录体积，加入等体积异丙醇轻柔颠倒混匀，低温高速15 000×g离心15 min弃上清，30 μL体积分数为75%冷乙醇润洗白色 RNA 沉淀，低温高速9 500×g离心5 min弃上清，无菌超净台中风干后根据RNA体积添加适量DEPC水冰上充分溶解；测定RNA 浓度；反转录制备cDNA，稀释5倍后采用RT-qPCR技术测定相应目的基因mRNA的转录水平。所有基因相对表达量均以GAPDH基因作为对照(n=3)。引物序列见表1。

1.4.5   茜素红染色(钙盐结节形成实验)   将对数期生长的C3H10T1/2细胞以约1×105/孔的密度接种于24孔板，细胞贴壁3 h后，分组加入相应滴度病毒作用3 d后将培养基更换为50 mg/L维生素C、0.1 μmol/L地塞米松及10 mmol/L β-磷酸甘油组成的成骨诱导培养基，37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养21 d后加入0.4%茜素红工作液进行染色(n=3)，普通光学显微镜下观察染色情况。然后用去离子水清洗3遍后与10%氯化十六烷基吡啶在室温下孵育30 min，应用酶标仪检测562 nm处的吸光度值，以吸光度值作成骨定量分析。
1.4.6   免疫组化染色   将对数期生长的C3H10T1/2细胞以约1×105 /孔的密度接种于24孔板，细胞贴壁3 h后，分组加入相应滴度病毒作用5，7 d，用40 g/L多聚甲醛固定8-10 min，0.25% Triton-X室温通透，山羊血清封闭，一抗(Ⅰ型胶原、血管内皮生长因子、内皮黏蛋白抗体)4 ℃孵育过夜，二抗常温孵育30 min，DAB复染(n=3)，普通光学显微镜下观察染色情况。
1.4.7   小管形成实验   实验前1 d于4 ℃中溶解Matrigel胶并利用4 ℃预冷枪头于冰上向96孔板中加入50 μL 2倍稀释的基质胶，第2天于37 ℃孵箱中孵育30 min后加入相应病毒混合后的小鼠脑微血管内皮细胞，细胞密度为5×103 /孔，分别于4，8，12 h后普通光学显微镜下观察小管形成情况。每组实验重复3次。
1.4.8   裸鼠皮下异位成骨实验   取对数期生长的C3H10T1/2细胞以约1×106/孔的密度接种于直径100 mm培养皿中，细胞贴壁3 h后，分组加入相应滴度病毒作用1 d，胰酶消化，离心，用PBS重悬至细胞浓度为2×1010 L-1，无菌注射器注射至裸鼠背部皮下，平均每个注射点注射5×106个细胞，5周以后收获背部异位成骨样本进行固定及脱钙处理，然后进行苏木精-伊红染色和Masson染色[24]。
1.5   主要观察指标   ①抑制Shn3对BMP2诱导C3H10T1/2细胞成骨分化的影响；②抑制Shn3对BMP2诱导C3H10T1/2细胞的成骨细胞特异性转录因子、骨钙素、Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原mRNA 转录的影响；③抑制Shn3对BMP2诱导C3H10T1/2细胞的神经轴突导向因子、促血管生成素、血管内皮生长因子、血管性血友病因子mRNA转录的影响；④抑制Shn3对BMP2诱导C3H10T1/2细胞成骨分化过程中Ⅰ型胶原、血管内皮生长因子、内皮黏蛋白表达的影响；⑤抑制Shn3对BMP2诱导小鼠脑微血管内皮细胞血管生成的影响；⑥抑制Shn3对BMP2诱导C3H10T1/2细胞裸鼠皮下异位成骨的影响。
1.6   统计学分析   采用SPSS 21.0进行统计学分析，所有细胞学实验进行3次重复操作，数据以x±s表示，两组之间比较采用student-t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，多组间多个时间点比较采用重复测量资料的方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义，采用Graph Pad Prism 7.0作图。文章统计学方法已经通过四川省医学科学院·四川省人民医院统计学专家审核。

骨重建与修复涉及旧骨去除、基质合成及基质矿化形成新骨，骨形成涉及多种细胞因子参与，其发生方式分为膜内成骨和软骨内成骨[25-26]。间充质干细胞成骨分化可由多种细胞因子介导，其中BMP2和BMP7常用于骨组织工程中工程骨的构建。目前BMP2被FDA批准用于临床治疗骨缺损、骨折不愈合以及脊柱融合[27]，但单独、大量、长期的使用极易引致炎症等并发症[28-29]。此外，在体外诱导成骨分化过程中，BMP2更加倾向于软骨内成骨，生成的软骨细胞晚期会出现肥大、凋亡和基质钙化的特点，从而破坏正常软骨细胞的表型[26]。因此如何诱导种子细胞正常发育形成具有生理功能的矿化骨是现阶段研究的重点。
大量研究表明BMP2在诱导干细胞成骨分化过程中可上调相关成骨标志物的表达：成骨细胞中过表达BMP2可下调趋化因子CXCL12促进新骨中骨细胞的形成[30]；成年小鼠中条件性敲除成骨细胞及内皮细胞中的BMP2不会影响骨形成，但BMP2的使用会产生骨赘，以上研究结果说明BMP2主要作用于非成熟成骨细胞系调节成骨[31-33]。此外，研究显示沉默Shn3后可抑制骨质疏松的发生，Shn3-/-转基因小鼠会形成硬化骨表型小鼠 [34-35]。该研究中，相较Ad-GFP组，Ad-BMP2组C3H0T1/2细胞成骨标志物碱性磷酸酶、骨钙素、成骨细胞特异性转录因子、Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原mRNA转录水平显著上调，Ad-BMP2联合Ad-Simshn3组早期成骨分化标志物碱性磷酸酶、成骨细胞特异性转录因子、Runt相关转录因子2及晚期成骨标志物骨钙素、Ⅰ型胶原 mRNA转录水平较Ad-BMP2组显著增高，提示抑制Shn3通过促进成骨分化显著增强BMP2的促骨形成作用；此外，Ad-BMP2组在成骨诱导培养基作用后能形成钙盐结节，抑制Shn3后BMP2诱导形成的钙盐结节较Ad-BMP2单独作用显著增多：以上结果提示Shn3在调控BMP2诱导的早期骨形成和晚期骨基质矿化过程中均具有重要作用。该研究中，Ad-BMP2联合Ad-Simshn3处理C3H10T1/2细胞后注射至裸鼠皮下相较Ad-BMP2组及Ad-Simshn3组收获更显著的异位骨块，苏木精-伊红染色及Masson染色结果亦显示Ad-BMP2联合Ad-Simshn3组形成更多成熟骨组织。有研究显示Shn3可能通过增强E3泛素连接酶WWP1促进Runt相关转录因子2多泛素化和蛋白酶体依赖降解从而抑制Runt相关转录因子2的功能[35]，因此作者猜测Shn3可能通过调节Runt相关转录因子2参与细胞外基质矿化的过程，从而调节骨形成。
成骨、成软骨的同时往往伴随着血管生成，一方面，成血管因子作用于成骨细胞上，促进成骨细胞的趋化、增生与分化；另一方面，成血管因子能调节人间充质干细胞或内皮祖细胞向成骨细胞的分化[36-37]。该研究中，抑制Shn3后BMP2诱导成骨分化的C3H10T1/2细胞中血管内皮生长因子、神经轴突导向因子、促血管生成素、血管性血友病因子、内皮黏蛋白 mRNA表达水平较Ad-BMP2组显著增高(P < 0.05)，提示抑制Shn3对BMP2诱导成骨分化过程中血管生成起正向作用。此外，Ad-BMP2联合Ad-Simshn3组Ⅰ型胶原、血管内皮生长因子、内皮黏蛋白的表达水平较Ad-BMP2组显著增强。血管内皮生长因子将成血管作用和成骨作用紧密串联起来，使新生血管的形成参与到骨形成过程中，血管中的血液为骨组织输送氧气和营养物质，转运代谢产物，起到了营养作用。在骨骼受创或骨折发生后，骨组织会处在炎症所造成的缺氧环境中，其恢复需依赖血管生成和骨生成的耦
合[36-37]。有研究显示体外联合应用BMP2及血管内皮生长因子165可有效减少骨赘形成[30]，但另一研究结果显示在大鼠颅骨缺损修复模型中单一应用BMP2优于BMP2和血管内皮生长因子A组合[38]，单独应用血管内皮生长因子A在体外和体内均未显示成骨活性[39-40]，因此，联合或单独应用血管内皮生长因子A不会对骨再生产生额外影响，但在成骨过程中血管内皮生长因子的过表达是否会产生作用呢？
KUSUMBE等[41]发表在《Nature》上的研究中提出H型内皮细胞可以分泌维持成骨细胞和软骨细胞骨形成的Noggin蛋白，而成骨细胞和软骨细胞则通过分泌血管内皮生长因子来支持血管生成，可见成血管、成骨过程是相辅相成的；该研究进一步指出H型内皮细胞调节骨中新生血管的生成，产生成骨细胞和骨细胞的骨祖细胞选择性定位于分泌内皮因子CD31及内皮黏蛋白的H型内皮细胞周围，大部分Runt相关转录因子2阳性、Ⅰ型胶原阳性和成骨细胞特异性转录因子阳性的细胞都与H型血管内皮直接接触，因此H型内皮细胞在血管形成过程中起着十分重要的作用[42]。此外，内皮细胞成血管标志物CD31及内皮黏蛋白的表达随成骨细胞神经轴突导向因子的上调而增高，从而导致H型血管形成[43]，意味着神经轴突导向因子作为上游基因调控下游成血管因子CD31及内皮黏蛋白的表达，进而调控成骨、成软骨的过程。这与该研究中Ad-BMP2联合Ad-Simshn3组神经轴突导向因子、内皮黏蛋白mRNA转录水平、内皮黏蛋白表达及小管形成显著增加的结果不谋而合，提示抑制Shn3可促进血管生成、成骨分化及骨形成。
综上所述，抑制Shn3可显著增强BMP2诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化，增强成血管因子mRNA及蛋白的表达调控血管生成过程。实验仍存在以下不足之处：①Shn3可能通过促进Runt相关转录因子2多泛素化和蛋白酶体依赖降解从而调控成骨发育，但其通路复杂，涉及酶体种类繁多，尚需进一步验证与探索；②研究结果提示抑制Shn3后促进成血管分子表达及血管生成，但在此过程中H型内皮是否生成仍需进一步探索，成骨、成血管之间是相互协同还是单向促进及其调控机制仍不清楚。此外，后续还可进一步利用3D打印技术结合干细胞及生物支架构建组织工程骨，缓解目前自体骨不足等问题，以期为促进干细胞成骨及构建组织工程骨提供新的实验及理论基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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文题释义：

骨形态发生蛋白2：骨形态发生蛋白属转化生长因子β家族，是体内诱导骨和软骨形成的主要因子，通过刺激DNA的合成和细胞的复制，促进间充质细胞定向分化为成骨细胞，目前已应用于临床治疗骨不连、骨缺损。
血管生成：是指在原有血管的基础上长出新的血管，是机体生长发育等生理过程中的必经阶段。血管生成在骨形成的过程中起着非常重要的作用，但其作用机制十分复杂，受到生长因子、细胞内信号和细胞外成分的动态调节，其中血管内皮生长因子、促血管生成素、神经轴突导向因子等是目前研究较为广泛的调控血管生成的因子。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨缺损、骨再生、骨修复是目前骨科临床医生面临的挑战，骨形态发生蛋白2是转化生长因子β超家族的成员，并且作为为数不多被批准应用于临床治疗骨不连的药物已被证实可通过BMP/Smad通路调控骨形成，锌指蛋白3可通过调节干细胞多向分化能力影响出生后发育和重塑并参与调节Dpp/TGF-β信号通路中转化生长因子β信号的转导。因此，本文制备相应的重组腺病毒从干细胞分化的角度初步探究锌指蛋白3是否可以调控骨形态发生蛋白2的成骨分化及其机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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