Irisin/PPARα信号通路对小鼠主动脉平滑肌细胞增殖的作用机制

doi:10.12307/2023.493

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (33): 5320-5326.doi: 10.12307/2023.493

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Irisin/PPARα信号通路对小鼠主动脉平滑肌细胞增殖的作用机制

王尧，刘大男，赵广建，周博，王向

贵州医科大学附属医院心内科，贵州医科大学医学科学研究所，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2022-05-23 接受日期:2022-07-14 出版日期:2023-11-28 发布日期:2023-03-30
通讯作者: 刘大男，博士，教授，主任医师，硕士生导师，博士生导师，贵州医科大学附属医院心内科，贵州医科大学医学科学研究所，贵州省贵阳市 550004
作者简介:王尧，男，1994年生，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事动脉粥样硬化形成机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81660083)，项目负责人：刘大男；贵州省科技创新人才团队项目[黔科合平台人才(2020)5014]，项目负责人：刘大男；贵州省“百”层次创新型人才培养计划项目[黔科合人才(2015)4026号]，项目负责人：刘大男；贵州医科大学国家自然科学基金培育项目(TJ20073)，项目负责人：刘大男

Irisin/peroxisome proliferator-activated receptor alpha signaling pathway mediates vascular smooth muscle cell proliferation in mice

Wang Yao, Liu Danan, Zhao Guangjian, Zhou Bo, Wang Xiang

Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Institute of Medical Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2022-05-23 Accepted:2022-07-14 Online:2023-11-28 Published:2023-03-30
Contact: Liu Danan, MD, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Doctoral supervisor, Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Institute of Medical Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Wang Yao, Master candidate, Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Institute of Medical Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81660083 (to LDN); Guizhou Science and Technology Innovation Talent Team Project, No. (2020)5014 (to LDN); Guizhou Province "One Hundred" Level Innovative Talent Training Program, No. (2015)4026 (to LDN); National Natural Science Foundation of Guizhou Medical University, No. TJ20073 (to LDN)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

鸢尾素(Irisin)：是一种肌肉因子，由Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5经水解修饰后释放，其主要生理功能为调节糖脂代谢。
核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体α：是一种核转录因子，在Irisin作用下具有“白色脂肪棕色化”的作用。

背景：鸢尾素(Irisin)由Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5(fibronectin type III domain containing 5，FNDC5)经水解修饰后释放，除调节糖脂代谢的主要生理功能外，同时具有调节多种细胞增殖与凋亡的能力。
目的：探讨Irisin/过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα)信号通路介导血红素氧合酶1调节血管平滑肌细胞增殖与凋亡平衡的作用及机制。
方法：采用FNDC5过表达和沉默慢病毒载体转染血管平滑肌细胞增加或抑制Irisin生成，构建体外细胞模型，分为7组：空白对照组、过表达空载体组、FNDC5组、过表达空载体+GW6471(PPARα抑制剂)组、FNDC5+GW6471组、沉默空载体组及sh-FNDC5组，采用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测各组FNDC5、PPARα、血红素氧合酶1、Bax、Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平；采用流式细胞技术检测血管平滑肌细胞凋亡情况，CCK-8法检测细胞增殖活性。

结果与结论：①与空白对照组、过表达空载体组比较，FNDC5组、FNDC5+GW6471组FNDC5、PPARα、血红素氧合酶1、Bax表达升高，Bcl-2表达降低，Bax/Bcl-2比值升高(均P < 0.05)；②与空白对照组、沉默空载体组比较，sh-FNDC5组FNDC5、PPARα、血红素氧合酶1、Bax表达降低，Bcl-2表达升高，Bax/Bcl-2比值降低(均P < 0.05)；③与FNDC5组比较，FNDC5+GW6471组PPARα、血红素氧合酶1、Bax显著降低，Bcl-2表达升高，Bax/Bcl-2比值降低(均P < 0.05)；④与空白对照组、过表达空载体组比较，FNDC5组、FNDC5+GW6471组血管平滑肌细胞增殖活性显著降低，凋亡率显著升高(均P < 0.05)；⑤与空白对照组、沉默空载体组比较，sh-FNDC5组血管平滑肌细胞增殖活性升高，凋亡率显著降低(均P < 0.05)；⑥与FNDC5组比较，FNDC5+GW6471组血管平滑肌细胞增殖活性显著升高，凋亡率显著降低(均P < 0.05)；⑦提示Irisin/PPARα信号通路可通过诱导血红素氧合酶1表达，抑制氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖，促进血管平滑肌细胞凋亡。

https://orcid.org/0000-0002-4312-5132(王尧)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 鸢尾素, 过氧化物酶体增殖物激活受体α, 血红素氧合酶1, 慢病毒, 转染, 血管平滑肌细胞, 增殖, 凋亡

Abstract: BACKGROUND: Irisin is released from fibronectin type III domain containing 5 (FNDC5) after hydrolysis and modification. In addition to regulating the main physiological functions of glucolipid metabolism, irisin also has the ability to regulate the proliferation and apoptosis of a variety of cells.
OBJECTIVE: To investigate the role and mechanism of irisin/peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARα) signaling pathway mediated heme oxygenase-1 in regulating the balance between proliferation and apoptosis of vascular smooth muscle cells.
METHODS: FNDC5 overexpression and silencing lentivirus vector were used to transfect vascular smooth muscle cells to increase or inhibit irisin production, and an in vitro cell model was constructed. There were seven groups: blank control group, overexpressed empty vector group, FNDC5 overexpression group, overexpressed empty vector+PPARα inhibitor (GW6471) group, FNDC5 overexpression+GW6471 group, silencing empty vector group, and sh-FNDC5 group. The mRNA and protein expression levels of FNDC5, PPARα, heme oxygenase-1, Bax, and Bcl-2 were detected by real-time PCR and western blot assay, respectively. Apoptosis of vascular smooth muscle cells was detected by flow cytometry and proliferation activity of vascular smooth muscle cells was detected by cell counting kit-8 assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the blank control group and overexpressed empty vector group, the expressions of FNDC5, PPARα, heme oxygenase-1, and Bax were increased, the expressions of Bcl-2 were decreased, and the ratio of Bax/Bcl-2 was increased in the FNDC5 group and FNDC5+GW6471 group (all P < 0.05). (2) Compared with the blank control group and silencing empty vector group, the expressions of FNDC5, PPARα, heme oxygenase-1, and Bax were decreased, the expressions of Bcl-2 were increased, and the ratio of Bax/Bcl-2 was decreased in the sh-FNDC5 group (all P < 0.05). (3) Compared with the FNDC5 group, the expressions of PPARα, heme oxygenase-1, and Bax were significantly decreased, Bcl-2 expression was increased, and Bax/Bcl-2 ratio was decreased in the FNDC5+GW6471 group (all P < 0.05). (4) Compared with the blank control group and overexpressed empty vector group, the proliferation activity of vascular smooth muscle cells was significantly decreased in the FNDC5 group and FNDC5+GW6471 group, while the apoptotic rate was significantly increased (all P < 0.05). (5) Compared with the blank control group and silencing empty vector group, the proliferation activity of vascular smooth muscle cells was increased in the sh-FNDC5 group, while the apoptotic rate was significantly decreased (both P < 0.05). (6) Compared with the FNDC5 group, the proliferation activity of vascular smooth muscle cells was significantly increased, while the apoptotic rate was significantly decreased in the FNDC5+GW6471 group (both P < 0.05). (7) Therefore, irisin/PPARα signaling pathway can inhibit proliferation activity and accelerate apoptosis of vascular smooth muscle cells by inducing heme oxygenase-1 expression.

Key words: irisin, peroxisome proliferator-activated receptor alpha, heme oxygenase-1, lentivirus vector, transfection, vascular smooth muscle cell, proliferation, apoptosis

中图分类号:

王尧, 刘大男, 赵广建, 周博, 王向. Irisin/PPARα信号通路对小鼠主动脉平滑肌细胞增殖的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5320-5326.

Wang Yao, Liu Danan, Zhao Guangjian, Zhou Bo, Wang Xiang. Irisin/peroxisome proliferator-activated receptor alpha signaling pathway mediates vascular smooth muscle cell proliferation in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(33): 5320-5326.

图/表（结果） 7

2.1 慢病毒转染血管平滑肌细胞及稳定细胞株的筛选慢病毒(MOI=30)转染血管平滑肌细胞 72 h后，可见大部分细胞发出绿色荧光，转染效率为(78.30±6.10)%，见图1。加入1 μg/mL嘌呤霉素进行筛选，细胞无明显形态学变化，生长状态良好，绿色荧光持续稳定出现，得到FNDC5稳定表达的血管平滑肌细胞株。

2.2 过表达、沉默FNDC5及在过表达FNDC5基础上下调PPARα表达对血管平滑肌细胞中FNDC5、PPARα、HO-1 mRNA及蛋白表达的影响与空白对照组比较，过表达空载体组FNDC5、PPARα、HO-1 mRNA及蛋白表达水平无明显差异(均P > 0.05)。与空白对照组、过表达空载体组对比，FNDC5、FNDC5+ GW6471组FNDC5、PPARα、HO-1 mRNA及蛋白表达显著增加(均P < 0.05)，过表达空载体+ GW6471组PPARα、HO-1 mRNA及蛋白表达显著降低(均P < 0.05)，FNDC5 mRNA和蛋白表达无明显变化(均P > 0.05)；与过表达空载体+GW6471组比较，FNDC5组、FNDC5+GW6471组FNDC5、PPARα、HO-1 mRNA及蛋白表达显著增高(均P < 0.05)；与FNDC5组比较，FNDC5+GW6471组PPARα、HO-1 mRNA及蛋白表达显著降低(均P < 0.05)，FNDC5 mRNA及蛋白表达变化不显著(均P > 0.05)；与空白对照组、沉默空载体组比较，sh-FNDC5组FNDC5、PPARα、HO-1 mRNA及蛋白表达显著降低(均P < 0.05)，FNDC5 mRNA和蛋白表达无明显变化(均P > 0.05)。见图2，3。

2.3 过表达、沉默FNDC5及在过表达FNDC5基础上下调PPARα表达对血管平滑肌细胞中Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表达的影响与空白对照组比较，过表达空载体组Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平、Bax/Bcl-2比值无明显差异(均P > 0.05)；与空白对照组、过表达空载体组对比，FNDC5组、FNDC5+GW6471组Bax mRNA及蛋白表达水平、Bax/Bcl-2比值显著升高，Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平降低(均P < 0.05)，过表达空载体+GW6471组Bax mRNA及蛋白表达水平、Bax/Bcl-2比值显著降低，Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平升高(均P < 0.05)；与过表达空载体+GW6471组比较，FNDC5组、FNDC5+GW6471组Bax mRNA及蛋白表达水平、Bax/Bcl-2比值显著升高，Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平降低(均P < 0.05)；与FNDC5组比较，FNDC5+GW6471组Bax mRNA及蛋白表达水平、Bax/Bcl-2比值显著降低，Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平升高(均P < 0.05)；与空白对照组、沉默空载体组比较，sh-FNDC5组Bax mRNA及蛋白表达水平、Bax/Bcl-2比值显著降低，Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平升高(均P < 0.05)。见图4，5。

2.4 过表达、沉默FNDC5及在过表达FNDC5基础上下调PPARα表达对血管平滑肌细胞增殖活性的影响 CCK-8结果显示，与空白对照组比较，过表达空载体组血管平滑肌细胞增殖活性无明显差异(P > 0.05)；与空白对照组、过表达空载体组比较，FNDC5组、FNDC5+GW6471组增殖活性显著降低(P < 0.05)，过表达空载体+GW6471组血管平滑肌细胞增殖活性显著升高(P > 0.05)；与过表达空载体+GW6471组比较，FNDC5组、FNDC5+GW6471组血管平滑肌细胞增殖活性降低(P < 0.05)；与FNDC5组比较，FNDC5+GW6471组血管平滑肌细胞增殖活性升高(P < 0.05)；与空白对照组、沉默空载体组比较，sh-FNDC5组血管平滑肌细胞增殖活性显著升高(P > 0.05)。见表1。

2.5 过表达、沉默FNDC5及在过表达FNDC5基础上下调PPARα表达对血管平滑肌细胞凋亡的影响与空白对照组比较，过表达空载体组血管平滑肌细胞凋亡率无明显差异(P > 0.05)；与空白对照组、过表达空载体组比较，FNDC5组、FNDC5+GW6471组血管平滑肌细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)，过表达空载体+GW6471组血管平滑肌细胞凋亡率降低(P < 0.05)；与过表达空载体+GW6471组比较，FNDC5组、FNDC5+GW6471组血管平滑肌细胞凋亡率升高(P < 0.05)；与FNDC5组比较，FNDC5+GW6471组细胞凋亡率降低(P < 0.05)；与空白对照组、沉默空载体组比较，sh-FNDC5组血管平滑肌细胞凋亡率明显降低(P < 0.05)。见图6。

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引言

动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病理基础，动脉粥样化硬性疾病是人类死亡的重要原因。血管平滑肌细胞异常增殖是动脉粥样硬化形成的重要环节和病理特点，血管平滑肌细胞增殖与凋亡失衡在动脉粥样硬化的发生发展中起关键作用[1-2]。动脉粥样硬化早期，血管平滑肌细胞增殖数量超过凋亡数量，并从中层向内膜迁移，引起管壁增厚、管腔狭窄及纤维帽形成[3-8]。动脉粥样硬化晚期，血管平滑肌细胞过度凋亡可使斑块纤维帽变薄、不稳定、破裂，引发心脑血管事件；而在晚期动脉粥样硬化中，凋亡血管平滑肌细胞不能及时被清除，导致继发性炎症和坏死，加重动脉粥样硬化[9-10]。因此，纠正血管平滑肌细胞增殖与凋亡失衡，维持二者平衡对于动脉粥样硬化的防治具有重要的临床意义[11]。
鸢尾素(Irisin)是III型纤连蛋白结构域包含蛋白5(fibronectin type III domain containing 5，FNDC5)经水解、修饰后形成的多肽激素，主要功能是调节糖脂代谢、改善肥胖和胰岛素抵抗[12]。课题组前期研究证实，冠心病患者血清Irisin水平显著降低[13]，Irisin可通过抗炎症和氧化作用缓解动脉粥样硬化[14]。Irisin可抑制血小板衍生生长因子BB诱导的血管平滑肌细胞增殖，过表达FNDC5慢病毒转染血管平滑肌细胞可抑制其增殖与迁移[15-16]。过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα)是FNDC5的下游基因，可作用于解偶联蛋白1，将白色脂肪组织转变为棕色脂肪组织，即“白色脂肪棕色化”，导入FNDC5能增加PPARα的表达，增强“棕色化效应”，但该效应能被PPARα的拮抗剂显著减弱，表明FNDC5对脂肪代谢的调节作用至少部分通过PPARα实现[17]。PPARα在动脉粥样斑块中表达，抑制血管平滑肌细胞增殖并促进其凋亡，有抗炎症及心血管保护作用[18-19]。血红素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)及其代谢产物一氧化碳均有抑制血管平滑肌细胞增殖，抗氧化、炎症及动脉粥样硬化作用[20-22]。HO-1为PPARα的直接靶基因，PPARα可诱导HO-1表达，抑制炎症反应和血管平滑肌细胞增殖[23]。可见抑制血管平滑肌细胞增殖及促进其凋亡奠定了Irisin、PPARα和HO-1抗动脉粥样硬化形成的基础。
然而，Irisin抑制血管平滑肌细胞增殖、抗动脉粥样硬化的分子机制尚不清楚，Irisin/ PPARα信号通路能否介导HO-1调节血管平滑肌细胞增殖与凋亡未见报道，此次研究旨在前期研究的基础上探索Irisin/PPARα/HO-1信号通路在调节血管平滑肌细胞增殖与凋亡平衡中的作用及机制，为动脉粥样硬化的临床防治提供理论和实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验，组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。
1.2 时间及地点实验于2020年6-12月在贵州医科大学分子重点实验室完成。
1.3 材料小鼠主动脉血管平滑肌细胞购于武汉普诺赛生命科技有限公司；pLVX-mCMV-ZsGre en-IRES-Puro慢病毒过表达载体、pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA载体、293T细胞系购于武汉维诺赛生物有限公司；反转录试剂盒、SYBR Green Master Mix试剂盒购于南京诺唯暂生物科技有限公司；细胞培养基DMEM/F12、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液(Penicillin-Streptomycin)购于美国Gibco公司；细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司；细胞计数试剂盒(CCK-8)购于BIOSHARP公司；PPARα特异性抑制剂GW6471购于美国Sigma公司；β-actin抗体购于武汉博士德生物工程有限公司；FNDC5抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；PPARα、HO-1、Bax抗体均购于武汉三鹰生物技术有限公司；Bcl-2抗体购于美国Abcam公司；引物合成及测序由北京擎科生物科技有限公司完成。实验过程遵循了本地及国家法规。
1.4 方法
1.4.1 FNDC5基因过表达、沉默慢病毒载体的构建[24] 采用PCR技术合成FNDC5 cDNA克隆片段，将其重组克隆至pLVX-mCMV-ZsGreen-IRES-Puro过表达载体，然后转化293T感受态细胞，运用四质粒包装系统获得重组慢病毒。将FNDC5 shDNA片段重组克隆至pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA载体，同样运用四质粒包装系统获得重组慢病毒。
1.4.2 血管平滑肌细胞培养及处理将血管平滑肌细胞重悬于含体积分数15%胎牛血清、1%青链霉素-链霉素的DMEM/F12完全培养基中。轻柔重悬细胞后转入25 cm2细胞培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养，在细胞数为1×108时进行传代。取处于对数生长期的小鼠主动脉平滑肌细胞，将细胞分为7组并做相应处理：空白对照组加入氧化低密度脂蛋白(50 μg/mL)；过表达空载体组加入氧化低密度脂蛋白(50 μg/mL)并转染过表达慢病毒空载体(感染复数=30)；FNDC5组加入氧化低密度脂蛋白(50 μg/mL)并转染FNDC5基因过表达载体(感染复数=30)；过表达空载体+GW6471组加入氧化低密度脂蛋白(50 μg/mL)并转染过表达空载体(感染复数=30)基础上加入PPARα抑制剂GW6471(10 μmol/L)；FNDC5+GW6471组加入氧化低密度脂蛋白(50 μg/mL)并转染FNDC5基因过表达载体(感染复数=30)基础上加入PPARα抑制剂GW6471(10 μmol/L)；沉默空载体组加入氧化低密度脂蛋白并转染shRNA慢病毒空载体(感染复数=30)；sh-FNDC5组加入氧化低密度脂蛋白并转染sh-FNDC5慢病毒载体。于荧光显微镜下观察荧光标记。

1.4.3 实时荧光定量PCR检测血管平滑肌细胞中FNDC5、PPARα、HO-1、Bax、Bcl-2 mRNA表达水平将1.4.2中分组并处理72 h后的各组细胞置于37 ℃、体积分数5%的CO2细胞培养箱中培养，采用Trizol法提取总RNA，经反转录合成cDNA，然后使用SYBR Green Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR，用熔解曲线及扩增曲线分析排除非特异性扩增，反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，进行40个循环。每样本实验重复3次。以β-actin作为内参基因，用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达水平，ΔCt=实验组目的基因平均 Ct值-对照组目的基因平均Ct值-内参基因平均Ct值。

内参基因β-actin上游引物序列：5’- CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3’，下游引物序列：5’- TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3’；目的基因FNDC5上游引物序列：5’- TGA AGG AGA TGG GGA GGA AC-3’，下游引物序列：5’- TGG TTT CTG ATG CGC TAT TG-3’；PPARα上游引物序列：5’-AGA CAA AGA GGC AGA GGT CC-3’，下游引物序列：5’- CGA TCA GCA TCC CGT CTT TG-3’； HO-1上游引物序列：5’- CCT CAC TGG CAG GAA ATC A-3’，下游引物序列：5’-TCG GGA AGG TAA AAA AAG C-3’；Bax上游引物序列：5’-TTT TGC TAC AGG GTT TCA TCC A-3’，下游引物序列：5’- GTG TCC ACG TCA GCA ATC ATC-3’；Bcl-2上游引物序列：5’-TCA TGA AGA CAG GGG CCT TT-3’，下游引物序列：5’-GTC CAC GTC AGC AAT CAT CC-3’。
1.4.4 Western blot检测血管平滑肌细胞中FNDC5、PPARα、HO-1、Bax、Bcl-2蛋白表达水平将1.4.2中分组并处理72 h后的各组细胞置于37 ℃、体积分数5%的CO2细胞培养箱中培养，在各组细胞中加入RIPA裂解液，冰上裂解，离心后取上清液，采用BCA法进行蛋白定量。取等量蛋白上样，经SDS-PAGE电泳后，恒流转膜至PVDF膜上，室温封闭1 h。封闭后分别加入兔多抗FNDC5(1∶1 000)，PPARα(1∶600)，HO-1(1∶3 000)，Bax(1∶5 000)，Bcl-2(1∶600)，β-actin一抗(1∶200)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次15 min，之后分别加入羊抗兔IgG(1∶5 000)室温孵育1 h。采用ECL法检测蛋白表达，β-actin作为内参，目的蛋白与其灰度比值表示目的蛋白的相对表达量。采用Gel-Pro analyzer 4软件进行条带灰度值分析。
1.4.5 CCK-8法检测血管平滑肌细胞增殖活性取处于对数生长期，生长状态良好的小鼠主动脉血管平滑肌细胞，按5×103个/孔接种于96孔板中，每孔加入DMEM完全培养基200 μL，置37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中培养，按1.4.2随机分为7组并做相应处理，处理72 h后加入CCK-8液，4 h后酶标仪检测A450 nm。
1.4.6 流式细胞技术检测血管平滑肌细胞凋亡在对1.4.2中分组的各组小鼠主动脉平滑肌细胞行相应处理72 h后，收集各组血管平滑肌细胞(3×108 L-1)，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL AnnexinV-APC混匀，再加入5 μL 7-AAD混匀，室温避光反应5-15 min，流式细胞仪上机检测。实验独立重复3次。
1.5 主要观察指标 ①转染FNDC5基因过表达或慢病毒载体72 h后，荧光显微镜观察平滑肌细胞，并计算转染效率；②各组细胞相应处理72 h后，实时荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞FNDC5、PPARα、HO-1及凋亡相关因子Bax、Bcl-2 mRNA与蛋白表达水平；③CCK-8法检测各组细胞增殖活性；④流式细胞技术检测各组细胞凋亡率。
1.6 统计学分析采用 SPSS 20.0和GraphPad Prism 7统计学软件分析数据，计量资料采用x±s表示，两组间比较采用t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05 为差异有显著性意义。文章统计学方法已经贵州医科大学生物统计学专家审核。

讨论

动脉粥样硬化的防治一直是临床上悬而未决的难题。血管平滑肌细胞增殖与凋亡失衡是导致动脉粥样硬化等血管增殖性疾病的重要病因，减少血管平滑肌细胞增殖和增加其凋亡能减轻氧化低密度脂蛋白诱导的血管损伤[25-27]，靶向促进血管平滑肌细胞凋亡可能是减少动脉粥样硬化发生发展的有效途径[28-29]。积极探寻能有效调节血管平滑肌细胞增殖与凋亡平衡的新靶点对于防治动脉粥样硬化具有极其重要的意义。Irisin通过调节糖脂代谢改善肥胖和胰岛素抵抗，还能抗炎症和氧化、抑制血管平滑肌细胞增殖、拮抗动脉粥样硬化[12-15]。基因转移技术的进步使得可以将目的基因导入体外培养的细胞中，并使其稳定表达，慢病毒载体因其安全性、有效性，在实验室被用于稳定的转基因过表达、持续的基因沉默等[30-32]。因而，此次研究中通过构建FNDC5基因过表达或沉默慢病毒载体转导体外培养的小鼠主动脉平滑肌细胞，稳定增加或沉默FNDC5的表达，据此观察其水解产物Irisin对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。荧光显微镜下观察经慢病毒转导的血管平滑肌细胞，可见大量绿色荧光，说明慢病毒成功转导至血管平滑肌细胞。实时荧光定量PCR及免疫印迹显示，FNDC5组细胞呈FNDC5 mRNA和蛋白水平高表达，而sh-FNDC5组表达被沉默，这为接下来研究Irisin对血管平滑肌细胞凋亡的影响提供基础。
课题组前期研究证实，Irisin通过抗炎症和氧化作用缓解动脉粥样硬化的形成，并能降低急性冠脉综合征患者血中炎症递质超敏C-反应蛋白、核因子κB和丙二醛水平，在冠心病中发挥保护作用[13-14]。而在前期的动物实验中，作者通过构建高脂饮食诱导的载脂蛋白E敲除小鼠动脉粥样硬化模型，并经小鼠尾静脉注射Irisin溶液，油红O结果发现小鼠主动脉斑块面积明显减小，证实了Irisin对动脉粥样硬化的改善作用[33]。Irisin可通过上调Akt/mTOR/Nrf2 信号通路，提高氧化低密度脂蛋白处理后的人脐静脉内皮细胞活性，减轻氧化低密度脂蛋白诱导的内皮损伤[34]。在颈动脉部分结扎模型中，Irisin显著降低了载脂蛋白E敲除小鼠的主动脉粥样硬化严重程度，并抑制颈动脉新生内膜的形成[35]。但由于动脉粥样硬化病理复杂，涉及多种细胞，因此Irisin抗动脉粥样硬化的机制尚未完全阐明，抑制血管平滑肌细胞增殖的机制不清楚，也未见Irisin调节血管平滑肌细胞凋亡的报道。PPARα可通过促进血管平滑肌细胞周期依赖性激酶抑制剂p16表达，阻滞细胞周期从G1期到S期的进程，抑制血管平滑肌细胞增殖及颈动脉球囊损伤后新生内膜形成[36]。PPARα mRNA表达增高，能显著增加血管平滑肌细胞凋亡率[37]；PPARα过表达可抑制氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖并促进其凋亡[15]。Bcl-2是细胞凋亡信号通路中的关键因子，Bcl-2的同源基因Bax蛋白表达上调可促进凋亡，经过逐级激活凋亡蛋白酶半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9，最终导致细胞凋亡。凋亡关键因子Bax和Bcl-2分别通过正向、反向调节维持细胞凋亡的平衡[38]。课题组的前期研究证实，HO-1/CO系统通过抑制细胞DNA合成，阻止细胞周期进程，直接参与血管平滑肌细胞增殖的调节，并通过抑制炎症递质核因子κB、肿瘤坏死因子α和内皮素1表达，阻止主动脉内膜增厚及颈动脉球囊损伤后新生内膜形成[20]。此次研究中，过表达FNDC5能显著升高PPARα、HO-1、Bax表达及Bax/Bcl-2比值，增加血管平滑肌细胞凋亡率，同时显著降低Bcl-2表达，抑制血管平滑肌细胞增殖活性，沉默FNDC5呈现相反的结果。进一步在过表达FNDC5的基础上加入PPARα抑制剂GW6471，发现与空白对照组比较，HO-1、Bax表达、Bax/Bcl-2比值及血管平滑肌活性虽然仍有升高，但相比FNDC5组却显著降低。在最初的Irisin研究中研究者通过基因表达阵列鉴定，FNDC5诱导PPARα表达，而PPARα抑制剂GW6471能显著降低FNDC5诱导的解偶联蛋白1增加，说明FNDC5可能通过PPARα发挥其调节脂代谢作用[17]。以上结果显示，Irisin能够诱导PPARα的表达，并且Irisin可能通过PPARα抑制血管平滑肌细胞的增殖活性，并促进血管平滑肌凋亡。
PPARα通过位于转录起始位点-1.4 kb至-2.2 kb之间的片段激活HO-1启动子，直接激活HO-1基因表达，从而抑制血管平滑肌细胞增殖[23]。诱导HO-1表达可抑制血小板源性生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖[39]。HO-1过表达腺病毒转染大鼠主动脉血管平滑肌细胞可促使其凋亡，凋亡程度与促凋亡蛋白P53表达水平升高呈正相关，给予外源性胆绿素或胆红素亦可促进血管平滑肌细胞凋亡[40]。可见，Irisin/PPARα信号通路对血管平滑肌细胞增殖的调节作用与HO-1表达水平呈相反的变化趋势，而对凋亡的调节作用与HO-1表达水平呈相同的变化趋势，表明HO-1既可通过抑制血管平滑肌细胞 DNA合成直接参与血管平滑肌细胞增殖的调节，又可通过调节细胞凋亡信号通路重要功能分子Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2表达促进血管平滑肌细胞凋亡。HO-1作为可诱导型血红素氧合酶，在病理状态下被激活，其表达上调是细胞对抗氧化应激和损伤的保护性反应。进一步表明Irisin通过PPARα靶向诱导HO-1 mRNA和蛋白表达，调节血管平滑肌细胞增殖与凋亡的平衡，这可能是Irisin抗动脉粥样硬化的机制。
综上所述，过表达FNDC5可上调PPARα表达进而诱导HO-1表达增加，一方面，通过抑制血管平滑肌细胞DNA合成阻止血管平滑肌细胞增殖；另一方面，通过调节细胞凋亡信号通路重要功能分子Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2 mRNA和蛋白表达促进血管平滑肌细胞凋亡；表明Irisin/PPARα信号通路能介导HO-1调节血管平滑肌细胞增殖与凋亡的平衡，这在动脉粥样硬化的防治中可能具有重要作用，Irisin有望成为防治动脉粥样硬化形成的新靶点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Irisin/PPARα信号通路对小鼠主动脉平滑肌细胞增殖的作用机制

Irisin/peroxisome proliferator-activated receptor alpha signaling pathway mediates vascular smooth muscle cell proliferation in mice

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