内皮型一氧化氮合酶在运动预适应改善心肌缺血-再灌注损伤中的作用

doi:10.12307/2023.993

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (8): 1283-1288.doi: 10.12307/2023.993

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

内皮型一氧化氮合酶在运动预适应改善心肌缺血-再灌注损伤中的作用

娄国1，张艳2，付常喜3

1江苏经贸职业技术学院，江苏省南京市 211168；2广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530021；3 徐州工程学院体育学院，江苏省徐州市 221008

收稿日期:2022-12-01 接受日期:2023-01-10 出版日期:2024-03-18 发布日期:2023-07-19
通讯作者: 付常喜，博士，副教授，徐州工程学院体育学院，江苏省徐州市 221008
作者简介:娄国，男，1979年生，山东省新泰市人，汉族，硕士，讲师，主要从事运动健康促进研究。
基金资助:
广西教育科学“十三五”规划课题(2017C386)，项目负责人：张艳；江苏省教育科学“十四五”规划课题(T-C/2021/14)，项目负责人：付常喜；江苏经贸职业技术学院“领军人才培养计划”项目(JYKJ2021-087MS)，项目负责人：娄国

Role of endothelial nitric oxide synthase in exercise preconditioning-induced improvement of myocardial ischemia-reperfusion injury

Lou Guo1, Zhang Yan2, Fu Changxi3

1Jiangsu Vocational Institute of Commerce, Nanjing 211168, Jiangsu Province, China; 2Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3School of Physical Education, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, Jiangsu Province, China

Received:2022-12-01 Accepted:2023-01-10 Online:2024-03-18 Published:2023-07-19
Contact: Fu Changxi, MD, Associate professor, School of Physical Education, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, Jiangsu Province, China
About author:Lou Guo, Master, Lecturer, Jiangsu Vocational Institute of Commerce, Nanjing 211168, Jiangsu Province, China
Supported by:
Guangxi Educational Science "13th Five-Year Plan" Project, No. 2017C386 (to ZY); Jiangsu Province Education Science "14th Five-Year Plan" Project, No. T-C/2021/14 (to FCX); "Leading Talent Training Program" of Jiangsu Vocational Institute of Commerce, No. JYKJ2021-087MS (to LG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

运动预适应：反复运动刺激诱导机体产生适应性变化，机体对于随后的不良应激源(如缺血-再灌注)耐受性增强，称为运动预适应，这是运动促进健康、预防疾病的重要机制。
内皮型一氧化氮合酶解偶联：内皮型一氧化氮合酶是一种同源二聚体酶(偶联)，在生理条件下催化L-精氨酸合成一氧化氮。当二聚体结构解离为单体时称为解偶联，此时催化的生化反应发生变异，其产物为超氧阴离子而非一氧化氮。

背景：运动是防治各种心血管疾病并保护心脏免受缺血-再灌注损伤的有效策略，其作用机制有待深入研究。

目的：观察有氧运动预适应对心肌缺血-再灌注损伤的影响，并探讨内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)激活(包括偶联和磷酸化)在其间的作用。
方法：取80只成年Wistar大鼠，采用随机数字表法分为安静组(n=40)和运动组(n=40)，运动组进行8周有氧运动，安静组在鼠笼内安静饲养。8周后进行3项实验：①实验1：末次训练后，检测大鼠心功能、心脏NO代谢物含量及心脏eNOS、磷酸化eNOS-S1177、eNOS二聚体、eNOS单体的蛋白表达量；②实验2：将大鼠分为安静对照组、运动对照组、安静+eNOS抑制剂组、运动+eNOS抑制剂组，均进行体外心肌缺血-再灌注损伤实验，安静+eNOS抑制剂组、运动+eNOS抑制剂组再灌注前10 min持续灌注eNOS抑制剂，再灌注3 h后检测心功能与心肌梗死面积；③实验3：将大鼠分为安静对照组、运动对照组、安静+eNOS偶联剂组和运动+eNOS偶联剂组，均进行体外心肌缺血-再灌注损伤实验，安静+eNOS偶联剂组和运动+eNOS偶联剂组再灌注前10 min持续灌注eNOS偶联剂，再灌注3 h后检测心肌梗死面积、心脏NO代谢物含量及心脏eNOS、磷酸化eNOS-S1177、eNOS二聚体、eNOS单体和3-硝基酪氨酸的蛋白表达量(其中，磷酸化eNOS-S1177/eNOS比值反映eNOS磷酸化/去磷酸化水平，eNOS二聚体/单体比值反映eNOS偶联/解偶联水平)。

结果与结论：①实验1：与安静组比较，运动组大鼠心输出量、左心室射血分数升高(P < 0.05)，亚硝酸盐和S-亚硝基硫醇含量升高(P < 0.05)，磷酸化eNOS-S1177、eNOS蛋白表达和磷酸化eNOS-S1177/eNOS比值上调(P < 0.05)，eNOS二聚体蛋白表达和eNOS二聚体/单体比值升高(P < 0.05)；②实验2：与安静对照组比较，运动对照组左心室发展压升高(P < 0.05)，心肌梗死面积下降(P < 0.05)；与运动对照组比较，运动+eNOS抑制剂组左心室发展压降低(P < 0.05)，心肌梗死面积增加(P < 0.05)；③实验3：与安静对照组比较，运动对照组左心室发展压升高(P < 0.05)，心肌梗死面积下降(P < 0.05)，磷酸化eNOS-S1177/eNOS比值下降(P < 0.05)，eNOS二聚体/单体比值下降(P < 0.05)，S-亚硝基硫醇含量增加(P < 0.05)，3-硝基酪氨酸蛋白表达量下调(P < 0.05)；与运动对照组比较，运动+eNOS偶联剂组左心室发展压降低(P < 0.05)，心肌梗死面积增加(P < 0.05)，磷酸化eNOS-S1177/eNOS比值升高(P < 0.05)，eNOS二聚体/单体比值升高(P < 0.05)，3-硝基酪氨酸蛋白表达升高(P < 0.05)；④结果表明：有氧运动预适应可诱导心脏保护效应，其机制与心脏缺血-再灌注期间eNOS解偶联以及去磷酸化进而抑制NO过度产生并降低硝基-氧化应激有关。

https://orcid.org/0000-0002-4369-0174(娄国)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 运动预适应, 内皮型一氧化氮合酶, 磷酸化/去磷酸化, 偶联/解偶联, 缺血-再灌注损伤, 硝基-氧化应激

Abstract: BACKGROUND: Exercise is an effective strategy to prevent and treat various cardiovascular diseases and protect the heart from ischemia-reperfusion injury. Its mechanism of action needs to be studied in depth.
OBJECTIVE: To observe the effect of aerobic exercise preconditioning on myocardial ischemia-reperfusion injury and to explore the effect of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) activation (including coupling and phosphorylation).
METHODS: Eighty adult Wistar rats were randomly divided into sedentary (n=40) and exercise (n=40) groups. The rats in the exercise group were subjected to aerobic exercise for 8 weeks while those in the sedentary group were quietly fed and caged. After 8 weeks of intervention, three experiments were performed. (1) Experiment 1: After the last training, cardiac function, cardiac nitric oxide metabolite content and cardiac eNOS, phosphorylated enOS-S1177, eNOS dimer and eNOS monomer protein expression levels were detected. (2) Experiment 2: Rats were divided into sedentary control group, exercise control group, sedentary+eNOS inhibitor group, exercise+eNOS inhibitor group, all of which were subjected to an in vitro myocardial ischemia-reperfusion injury experiment. eNOS inhibitor was continuously infused into the sedentary+eNOS inhibitor group and exercise+eNOS inhibitor group 10 minutes before reperfusion, and cardiac function and myocardial infarction area were detected 3 hours after reperfusion. (3) Experiment 3: Rats were divided into sedentary control group, exercise control group, sedentary+eNOS coupler group and exercise+eNOS coupler group, all of which were subjected to an in vitro myocardial ischemia-reperfusion injury experiment. The rats in the sedentary+eNOS coupler group and exercise+eNOS coupler group were treated with eNOS coupler. Myocardial infarct area, cardiac nitric oxide metabolite content, cardiac protein expression of eNOS, phosphorylated enos-S1177, eNOS dimer, eNOS monomer and 3-nitrotyrosine were detected 3 hours after reperfusion. The phosphorylated eNOS-S1177/eNOS ratio reflected the phosphorylated/dephosphorylated level of eNOS and eNOS dimer/monomer ratio reflected eNOS coupling/uncoupling level.
RESULTS AND CONCLUSION: Experiment 1: Compared with the sedentary group, the exercise group had increased cardiac output and left ventricular ejection fraction (P < 0.05), increased nitrite and S-nitrosothiol contents (P < 0.05), upregulated phosphorylated eNOS-S1177, eNOS protein expression and phosphorylated eNOS-S1177/eNOS ratio (P < 0.05), eNOS dimer protein expression and eNOS dimer/monomer ratios were elevated (P < 0.05). Experiment 2: Compared with the sedentary control group, left ventricular development pressure increased (P < 0.05) and myocardial infarct area decreased (P < 0.05) in the exercise control group. Compared with the exercise control group, left ventricular development pressure decreased (P < 0.05) and myocardial infarct area increased (P < 0.05) in the exercise+eNOS inhibitor group. Experiment 3: Compared with the sedentary control group, the exercise control group had increased left ventricular developmental pressure (P < 0.05), decreased myocardial infarct area (P < 0.05), decreased phosphorylated eNOS-S1177/eNOS ratio (P < 0.05), decreased eNOS dimer/monomer ratio (P < 0.05), increased S-nitrosothiol content (P < 0.05), and decreased 3-nitrotyrosine protein expression (P < 0.05). Compared with the exercise control group, the exercise+eNOS coupler group had decreased left ventricular developmental pressure (P < 0.05), increased myocardial infarct area (P < 0.05), increased phosphorylated eNOS-S1177/eNOS ratio (P < 0.05), increased eNOS dimer/monomer ratio (P < 0.05), and elevated 3-nitro tyrosine protein expression (P < 0.05). To conclude, aerobic exercise preconditioning could induce cardioprotection, which is related to uncoupling and dephosphorylation of eNOS during cardiac ischemia-reperfusion, thereby inhibiting the excessive production of nitric oxide and reducing nitro-oxidative stress.

Key words: exercise preconditioning, endothelial nitric oxide synthase, phosphorylation/dephosphorylation, coupling/uncoupling, ischemia-reperfusion injury, nitro-oxidative stress

中图分类号:

娄国, 张艳, 付常喜. 内皮型一氧化氮合酶在运动预适应改善心肌缺血-再灌注损伤中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1283-1288.

Lou Guo, Zhang Yan, Fu Changxi. Role of endothelial nitric oxide synthase in exercise preconditioning-induced improvement of myocardial ischemia-reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(8): 1283-1288.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 80只大鼠全部进入结果分析。
2.2 实验1：运动对静息状态下心功能及心脏eNOS/NO信号途径的影响与安静组比较，运动组大鼠心输出量、左心室射血分数升高(P < 0.05)，磷酸化eNOS-S1177、eNOS蛋白表达和磷酸化eNOS-S1177/eNOS比值上调(P < 0.05)，eNOS二聚体蛋白表达和eNOS二聚体/单体比值升高(P < 0.05)，亚硝酸盐和S-亚硝基硫醇含量升高(P < 0.05)，见图2。

2.3 实验2：缺血-再灌注期间eNOS的作用与安静对照组比较，运动对照组左心室发展压升高(P < 0.05)，心肌梗死面积下降(P < 0.05)；与运动对照组比较，运动+eNOS抑制剂组左心室发展压降低(P < 0.05)，心肌梗死面积增加(P < 0.05)，见图3。

2.4 实验3：缺血-再灌注期间eNOS在运动发挥心脏保护中的作用与安静对照组比较，运动对照组左心室发展压升高(P < 0.05)，心肌梗死面积下降(P < 0.05)，磷酸化eNOS-S1177蛋白表达和磷酸化eNOS-S1177/eNOS比值下降(P < 0.05)，eNOS二聚体蛋白表达下降(P < 0.05)，eNOS单体蛋白表达升高(P < 0.05)，eNOS二聚体/单体比值下降(P < 0.05)，S-亚硝基硫醇含量增加(P < 0.05)，3-硝基酪氨酸蛋白表达下调(P < 0.05)；与运动对照组比较，运动+eNOS偶联剂组左心室发展压降低(P < 0.05)，心肌梗死面积增加(P < 0.05)，磷酸化eNOS-S1177蛋白表达和磷酸化eNOS-S1177/eNOS比值升高(P < 0.05)，eNOS二聚体蛋白表达升高(P < 0.05)，eNOS单体蛋白表达下降(P < 0.05)，eNOS二聚体/单体比值升高(P < 0.05)，3-硝基酪氨酸蛋白表达升高(P < 0.05)；各组环磷酸鸟苷、S-亚硝基硫醇和亚硝酸盐含量比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析，多重比较使用LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2021年7-12月在广西中医药大学运动生理实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 80只雄性Wistar大鼠，3月龄，体质量(210±15) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2018-0027。大鼠饲养环境：温度24-26 ℃，湿度50%-60%，12 h/12 h明暗周期，分笼(5只/笼)标准饲料饲养，自由进食水。实验获得广西中医药大学伦理委员会批准(批准号：E2021-03-005)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 实验试剂与仪器 1%戊巴比妥钠(江苏恒瑞医有限公司)；eNOS特异性抑制剂L-亚氨基乙基鸟氨酸、eNOS偶联剂四氢生物蝶呤、氯化三苯基四氮唑溶液(美国Sigma 公司)；eNOS、3-硝基酪氨酸、GAPDH一抗(Santa cruz公司)；磷酸化eNOS-S1177、eNOS二聚体、eNOS单体一抗(Abcam公司)；二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；超声成像系统(VisualSonics Vevo 3100，加拿大)；FT-200动物跑步机(成都泰盟科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组按照随机数字表法将80只大鼠分为安静组和运动组，每组40只，运动组进行8周有氧运动，安静组在鼠笼内安静饲养，8周干预后根据研究目的分别进行如下3个实验。
实验1：为探讨运动对静息状态下心脏eNOS/NO信号途径的影响，每组随机取10只动物，末次训练后48 h测定心功能，随后取心脏测定eNOS蛋白表达量、eNOS磷酸化、eNOS解偶联以及NO代谢物(环磷酸鸟苷、亚硝酸盐、S-亚硝基硫醇)含量。
实验2：为检验缺血-再灌注期间eNOS的作用，安静组和运动组各随机取20只大鼠分为安静对照组、运动对照组、安静+eNOS抑制剂组、运动+eNOS抑制剂组，每组10只。4组进行体外心脏缺血-再灌注实验，再灌注前10 min，安静+eNOS抑制剂组和运动+eNOS抑制剂组给予eNOS特异性抑制剂L-亚氨基乙基鸟氨酸处理，安静对照组和运动对照组给予等量生理盐水。实验后测定心功能(左心室发展压)和心肌梗死面积。
实验3：为进一步探讨缺血-再灌注期间eNOS在运动发挥心脏保护中的作用，每组取剩余的10只动物分为安静+eNOS偶联剂组和运动+eNOS偶联剂组，每组10只，进行体外心脏缺血-再灌注实验，再灌注前10 min，两组给予eNOS促偶联剂四氢生物蝶呤处理(注：数据统计时，相应的对照组采用实验2中的安静对照组和运动对照组)。缺血-再灌注实验过程中测定左心室发展压，实验后检测心肌梗死面积、eNOS蛋白表达量、eNOS磷酸化、eNOS解偶联、NO代谢物(环磷酸鸟苷、亚硝酸盐、S-亚硝基硫醇)含量以及3-硝基酪氨酸的蛋白表达量。

整体实验流程图见图1所示。

1.4.2 大鼠运动方案运动组所有动物先进行5 d适应性跑台训练，方案为：速度5-15 m/min，坡度0°，时间10-20 min/d。适应性训练结束后，参照课题组前期建立的方法利用递增负荷跑台运动测试获取大鼠最大跑台速度，方案如下[18]：坡度为0°，起始负荷为5 m/min，每2 min递增1.5 m/min，直至力竭，记录最大跑台速度。运动组大鼠随后进行8周跑台运动训练，运动强度为最大跑台速度的60%，运动时间为60 min/d，每周训练5 d。分别于第4，6周重新测定最大跑速以调整训练强度。
1.4.3 大鼠体外心脏缺血-再灌流实验与取材末次训练后48 h，安静组和运动组每组随机取10只动物，麻醉后利用超声心动图测定心功能(指标包括心输出量和左心室射血分数)，随后取心脏，待测NO代谢物含量以及相关蛋白表达量。
取剩余60只大鼠随机分为6组(详见实验分组)：安静对照组、运动对照组、安静+eNOS抑制剂组、运动+eNOS抑制剂组、安静+eNOS偶联剂组和运动+eNOS偶联剂组，每组10只。采用Langendorff离体灌流系统建立大鼠体外心肌缺血/再灌注模型[19]：腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.06 g/kg)麻醉大鼠，固定在恒温手术台，快速暴露心脏并分离，固定于Langendorff灌流装置，用Krebs-Henseleit(K-H)液常规恒压(10.108 kPa)灌流，以体积分数95%O2+5%CO2饱和，维持灌流液温度37 ℃；将已定标的双压力Millar导管经右颈总动脉插入到大鼠左心室内，手术线固定，连接LabChart 8数据采集系统，监测左心室收缩压和左心室舒张压，计算左心室发展压(左心室收缩压-左心室舒张压)作为体外心脏心功能参数；各组心脏均稳定30 min后，局部结扎冠状动脉左前降支模拟缺血30 min，松开结扎线再灌注3 h；再灌注开始前
10 min，安静+eNOS抑制剂组和运动+eNOS抑制剂组大鼠给予eNOS特异性抑制剂L-亚氨基乙基鸟氨酸(10 μmol/L)持续灌注，安静+eNOS偶联剂组和运动+eNOS偶联剂组给予eNOS偶联剂四氢生物蝶呤(50 μmol/L)持续灌注，安静对照组和运动对照组持续灌注生理盐水。在整个实验过程中以记录心脏插管灌流后30 min时的稳定数据作为左心室发展压基础值，随后分别记录给药后固定时间点(给药10，30，60 min)
的数据，计算给药后各时间点数据相对于灌流30 min时基础值的百分率。实验结束后将心脏分为两部分，一部分染色后用于评估心肌梗死面积，另一部分迅速投入液氮中并转移至-80 ℃低温冰箱冻存，待测NO代谢物含量以及相关蛋白表达量。
1.4.4 心肌梗死面积评估取心脏沿垂直于心脏长轴的方向切取 2 mm左右的组织片，置于2%氯化三苯基四氮唑溶液中，37 ℃避光孵育30 min，然后用40 g/L多聚甲醛固定。缺血区呈苍白色、未缺血区呈砖红色。拍照后用Image-Pro Plus 6.0软件测量面积，心肌梗死面积比例=白色区面积÷总面积×100%。
1.4.5 心脏NO代谢物含量测定采用分光光度法于540 nm处测定亚硝酸盐含量，酶联免疫吸附法测定环磷酸鸟苷含量，高效液相色谱法测定S-亚硝基硫醇含量(代表蛋白质S-亚硝基化反应)。
1.4.6 心脏相关蛋白表达量检测采用免疫印迹法检测心脏eNOS、磷酸化eNOS-S1177、eNOS二聚体、eNOS单体、3-硝基酪氨酸的蛋白表达量。取适量心肌组织匀浆后，4 ℃下12 000×g离心5 min，取上清，采用考马斯亮蓝测定总蛋白质浓度。取50 μg蛋白样品在垂直电泳仪上经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后转移至聚偏二氟乙烯膜上。加入一抗[eNOS(1∶2 000)、磷酸化eNOS-S1177(1∶1 000)、eNOS二聚体(1∶1 000)、eNOS单体(1∶1 000)、3-硝基酪氨酸(1∶2 000)]后4 ℃静置孵育过夜，二抗(1∶5 000)37 ℃孵育2 h。充分洗涤后，使用增强化学发光试剂盒发光成像，凝胶成像系统拍照，Image-Pro Plus 6.0软件测定各条带吸光度值。内参蛋白为GAPDH(1∶10 000)，将目的蛋白吸光度值与GAPDH的比值作为目的蛋白相对表达量，计算各组各蛋白相对表达量与安静组或安静对照组的比值作为相对表达率。
1.5 主要观察指标安静组和运动组大鼠心功能、心脏NO代谢物含量及心脏eNOS、磷酸化eNOS-S1177、eNOS二聚体、eNOS单体的蛋白表达量；安静对照组、运动对照组、安静+eNOS抑制剂组、运动+eNOS抑制剂组心功能与心肌梗死面积；安静对照组、运动对照组、安静+eNOS偶联剂组和运动+eNOS偶联剂组心肌梗死面积、心脏NO代谢物含量及心脏eNOS、磷酸化eNOS-S1177、eNOS二聚体、eNOS单体和3-硝基酪氨酸的蛋白表达量。
1.6 统计学分析使用SPSS 20.0 软件包对数据进行统计学处理与分析。所有数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较使用LSD检验。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经广西中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

此次研究的主要发现是：①运动通过提升静息状态下心脏eNOS磷酸化和偶联水平活化eNOS并增加NO利用度，进而改善大鼠安静时的心功能；②运动预适应减轻体外心脏缺血-再灌注损伤，通过eNOS抑制剂处理则抵消了运动的益处，说明eNOS在运动诱导的心脏保护中起关键作用；③出乎意料的是，运动对照组大鼠心脏缺血-再灌注期间eNOS发生解偶联和去磷酸化，然而NO生物利用度增加、3-硝基酪氨酸表达量降低；利用四氢生物蝶呤稳定eNOS二聚体(即抑制eNOS解偶联)并促进其磷酸化未改善NO生物利用度，但却增加3-硝基酪氨酸表达量，进而造成硝基－氧化应激并阻断运动诱导的心脏保护效应。因此，有氧运动预适应诱导的心脏保护效应与缺血-再灌注期间eNOS解偶联和去磷酸化有关。
规律运动能够改善静息状态下的心功能，这在先前的多项研究中均得到证实[18，20]，NO是介导这一过程的关键因子[2]。在此次研究中，运动组eNOS总蛋白、磷酸化eNOS-S1177/eNOS比值以及二聚体/单体比值上调，环磷酸鸟苷、亚硝酸盐和S-亚硝基硫醇含量增加，心输出量、左心室射血分数升高，说明运动通过促进eNOS表达、磷酸化以及偶联水平活化eNOS，促进NO合成并增加心脏基线水平NO代谢储存，进而通过环磷酸鸟苷信号转导通路以及蛋白质S-亚硝基化作用改善心功能[16-17]。
运动同时也是保护心脏免受缺血-再灌注损伤的有效策略[1]。在此次研究中，运动预适应对心脏产生保护效应，表现为运动对照组大鼠缺血-再灌注时左心室发展压升高，心肌梗死面积下降，即缺血-再灌注损伤程度减轻。利用eNOS特异性抑制剂灌注后阻断了运动的益处，而安静对照组eNOS受抑后心肌梗死面积无显著变化，提示eNOS在运动诱导的心脏保护中起关键作用，然而这一过程中eNOS的具体调节机制尚不明确。磷酸化和二聚化(偶联)是eNOS激活的主要调节方式，也是运动诱导心脏保护的重要因素，然而出乎意料的是，运动对照组心肌缺血-再灌注期间磷酸化eNOS-S1177/eNOS比值和二聚体/单体比值下降，提示发生eNOS去磷酸化以及eNOS解偶联。CHEN等[21]的研究认为，eNOS在S1177位点处磷酸化水平上调有利于eNOS在应激时的解偶联；ARAGÓN等[22]报道，安静动物注射肾上腺素诱导eNOS-S1177磷酸化可减轻心脏缺血-再灌注损伤。结合此次研究结果，作者认为缺血-再灌注时eNOS解偶联和去磷酸化是一种特异性运动依赖机制，eNOS解偶联将造成酶结构变异并破坏其磷酸化位点。eNOS解偶联可能是由于缺血期间四氢生物蝶呤含量降低造成的，有研究证实，四氢生物蝶呤减少与血流限制时间呈正比[23]。四氢生物蝶呤是eNOS二聚体的必需辅因子，其含量下降直接导致eNOS解偶联以及去磷酸化[4]。随后，为阐明eNOS解偶联和去磷酸化在运动诱导的心脏保护中的确切作用，采用eNOS偶联剂四氢生物蝶呤灌注离体心脏，结果发现灌注四氢生物蝶呤的运动组大鼠(运动+eNOS偶联剂组)eNOS偶联和磷酸化得以维持，但令人意外的是，心肌梗死面积增加、心肌功能下降，表明eNOS解偶联和去磷酸化是运动性心脏对抗缺血-再灌注损伤所必需的。
通常情况下，eNOS解偶联和去磷酸化导致NO含量减少[5]。在此次研究中，运动对照组磷酸化eNOS-S1177/eNOS比值和eNOS二聚体/单体比值下降，S-亚硝基硫醇含量升高，环磷酸鸟苷和亚硝酸盐含量则不变，提示缺血-再灌注时eNOS解偶联和去磷酸化并未影响NO的生物利用度。由于心肌缺血期间NO主要来源于NO代谢物而非eNOS活性[24]，因此推测，运动组静息状态下(基线水平)心脏产生的较高含量的NO代谢物作为NO储备是缺血和再灌注期间维持NO利用度的重要来源。亚硝酸盐和S-亚硝基硫醇既是NO的代谢产物，也是NO的重要供体，参与NO的储存和转运[2]。此外，S-亚硝基硫醇是含巯基蛋白质亚硝基化的产物，而S-亚硝基化是蛋白质重要的翻译后修饰方式，可增强蛋白活性、参与对信号转导的调节，同时也是诱导心脏保护效应的关键触发因素[25]。
研究证实，eNOS解偶联时催化的生化反应发生变异，其产物是超氧阴离子而非NO，超氧阴离子可直接与NO反应生成毒性更强的过氧亚硝酸盐并造成硝基-氧化应激[5]。过氧亚硝酸盐具有强氧化和硝基化作用，可硝基化蛋白质中的酪氨酸残基生成3-硝基酪氨酸，从而改变一些重要酶蛋白的活性、损伤线粒体及诱导细胞凋亡和死亡，因此，3-硝基酪氨酸是过氧亚硝酸盐的生物标志物[26]。结合此次研究结果推测，在缺血-再灌注期间，NO的保护或有害作用可能主要取决于NO和超氧阴离子的相对含量。此次研究中，运动对照组3-硝基酪氨酸蛋白表达量较安静对照组下降，提示eNOS去磷酸化以及解偶联可能限制了NO和自由基过量产生，进而减轻NO和超氧阴离子之间的毒性反应。运动组灌注四氢生物蝶呤后(运动+eNOS偶联剂组)，eNOS重新偶联和磷酸化，这可能导致NO过量产生，然而过量的NO水平并未提高NO利用度，而是增加了硝基-氧化应激水平，表明过量的NO迅速与再灌注时释放的自由基反应形成过氧亚硝酸盐，进而削弱了运动的心脏保护作用。因此，运动诱导的eNOS解偶联和去磷酸化有助于防止NO与超氧阴离子反应形成过氧亚硝酸盐，降低硝基-氧化应激，进而发挥心脏保护效应。尽管研究证实，未经训练的大鼠在缺血期间通过补充四氢生物蝶呤促进eNOS重新偶联有助于改善缺血后的心功能恢复[11]，但结合此次研究结果提示，经过规律训练后补充四氢生物蝶呤应持谨慎态度，具体效应和机制尚需深入研究。
现将eNOS在运动预适应诱导心脏保护中的可能作用机制总结如下：规律运动促进eNOS表达、磷酸化以及偶联水平活化eNOS，催化NO合成并增加心脏基线水平NO代谢储存，进而通过环磷酸鸟苷信号转导通路以及蛋白质S-亚硝基化作用改善心功能。在缺血-再灌注过程中，eNOS发生解偶联和去磷酸化，但NO利用率仍维持较高水平，表明NO合成主要依赖于储存的NO代谢物；此时NO维持在生理剂量，通过蛋白质S-亚硝基化作用对心脏起保护效应。在缺血-再灌注过程中使用eNOS偶联剂四氢生物蝶呤处理后导致NO过量产生，但并未增加NO利用率，而是通过与超氧阴离子反应生成过氧亚硝酸盐，增加硝基-氧化应激水平，从而削弱了运动的心脏保护作用。
研究尚存在些许不足之处：第一，eNOS在冠状动脉内皮细胞中高表达，有助于调节冠状动脉血流量[27]，但内皮细胞在运动性心脏保护中的作用尚不明确；第二，研究证实未经规律训练的大鼠在心脏体外缺血-再灌注过程中补充四氢生物蝶呤有助于减轻心肌损伤[11]，然而此次研究中安静+eNOS偶联剂组并未观察到类似效应，可能与使用的四氢生物蝶呤剂量较低有关；第三，在缺血-再灌注过程中尚存在诸多环节(如缺血早期、缺血晚期、再灌注早期、再灌注晚期)[28]，不同环节可能存在不同的生物学机制，研究并未细化上述环节。
结论：有氧运动预适应可诱导心脏保护效应，其机制与心脏缺血-再灌注期间eNOS解偶联以及去磷酸化进而抑制NO过度产生并降低硝基-氧化应激有关。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

内皮型一氧化氮合酶在运动预适应改善心肌缺血-再灌注损伤中的作用

Role of endothelial nitric oxide synthase in exercise preconditioning-induced improvement of myocardial ischemia-reperfusion injury

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