力竭运动损伤模型大鼠运动预适应后心脏STAT3和Caspase-3的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.40.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：信号转导及转录激活因子3(STAT3)和Caspase-3是JAK2/STAT3信号通路中的重要因子，它们在运动预适应心肌保护中的作用目前相关研究较少。

目的：分析运动预适应对大鼠心脏STAT3和Caspase-3表达的影响及其对心脏保护的作用机制。

方法：将80只SD大鼠随机分为对照组、力竭组、运动预适应组、运动预适应+AG490组。连续3 d的间歇跑台运动建立运动预适应动物模型。对照组：常规饲养3 d；力竭组：常规饲养3 d后，以30 m/min的速度运动至力竭；运动预适应组：先进行3 d的运动预适应，24 h后以30 m/min的速度运动至力竭；运动预适应+AG490组：在每天运动预适应前10 min，腹腔注射JAK2抑制剂AG490(3 mg/kg)，余处理同运动预适应组。用HBFP染色法检测心肌缺血缺氧改变，用Western blot方法检测心脏STAT3表达，用免疫组织化学方法检测心脏Caspase-3表达。

结果与结论：与对照组相比，力竭组心肌缺血缺氧面积、心脏STAT3表达和心脏Caspase-3表达均显著升高；与力竭组相比，运动预适应组心肌缺血缺氧面积和心脏Caspase-3表达均明显降低，而心脏STAT3表达显著升高；与运动预适应组相比，运动预适应+ AG490组心肌缺血缺氧面积和心脏对照组Caspase-3表达均显著升高，而心脏STAT3表达明显降低。提示运动预适应可以通过激活JAK2/STAT3信号通路，诱导心脏STAT3表达增加，下调心脏Caspase-3表达，减少心肌细胞凋亡，减轻心肌缺血损伤，从而对心肌发挥保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 心肺及血管损伤的动物模型, 运动预适应, STAT3, Caspase-3, 心肌保护效应, 运动医学

Abstract:

BACKGROUND: Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) and Caspase-3 are the important factors in JAK2/STAT3 signaling pathway. However, there are few studies on their role in the exercise preconditioning for myocardial protection.

OBJECTIVE: To analyze the effects of exercise preconditioning on the expression of STAT3 and Caspase-3 in the heart of rats and investigate the cardioprotective mechanism of action.

METHODS: Eighty Sprague-Dawley rats were randomly divided into control, exhaustive, exercise preconditioning, and exercise preconditioning+AG490 groups. The exercise preconditioning rat models were established by subjecting to intermittent treadmill exercise for 3 successive days. Rats in the control group were fed routinely for 3 days. Rats in the exhaustive group underwent treadmill exercise at 30 m/min until exhaustion after 3 days of routine raise. Rats in the exercise preconditioning group underwent exercise preconditioning for 3 days, and 24 hours later, they underwent treadmill exercises at the speed of 30 m/min until exhaustion. Rats in the exercise preconditioning+AG490 groups were intraperitoneally injected JAK2 inhibitor AG490 (3 mg/kg) at 10 minutes before exercise preconditioning and the remaining treatments were the same as that in the exercise preconditioning group. Myocardial ischemia and hypoxia degrees were detected by hematoxylin basic fuchsin picric acid staining method. The expression of STAT3 in the heart of rats was detected by Western blot assay and Caspase-3 by immunohistochemistry,respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the myocardial ischemia and hypoxia area and the expression of Caspase-3 and STAT3 in the heart of rats were obviously increased in the exhaustive group. Compared with the exhaustive group, the myocardial ischemia and hypoxia area and the expression of Caspase-3 in the heart of rats were noticeably decreased, but the expression of STAT3 in the heart of rats was significantly increased in the exercise preconditioning group. Compared with the exercise preconditioning group, the myocardial ischemia and hypoxia area and the expression of Caspase-3 in the heart of rats were remarkably increased, but the expression of STAT3 in the heart of rats was obviously decreased in the exercise preconditioning+AG490 group. These results suggest that exercise preconditioning plays its cardioprotective role through activating JAK2/STAT3 signaling pathway, increasing the expression of STAT3 and down-regulating the expression of Caspase-3 in the heart of rats, reducing the apoptosis of myocardial cells, and alleviating myocardial ischemia injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Sports Medcine, Caspase 3, Myocardium

中图分类号:

R318

孙晓娟. 力竭运动损伤模型大鼠运动预适应后心脏STAT3和Caspase-3的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(40): 6450-6454.

Sun Xiao-juan. Effects of exercise preconditioning on expression of STAT3 and Caspase-3 in the heart of rats with exhaustive exercise injury [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(40): 6450-6454.

图/表（结果） 2

2.1 造模成功动物数量及过程实验选用大鼠80只，分为4组，实验中4只大鼠不能坚持进行跑台运动，最终有76只大鼠进入结果分析。造模动物流程图见图1。 2.2 模型方法的改进目前学者们普遍采用Demirel等^[4]和Lennon等^[5]的建模方法，以结扎冠状动脉造成急性心肌缺血损伤。而本实验在以上研究的基础上，以力竭运动造成急性心肌缺血损伤，观察运动预适应对心肌缺血损伤的保护作用。 2.3 模型稳定性力竭运动损伤动物模型建立方法简单，创伤性小，重复性好，适合于运动预适应心肌保护机制的实验研究。

2.4 心肌组织缺血缺氧染色结果对照组心肌纤维的胞浆呈黄色，卵圆形的细胞核呈蓝黑色，胞浆内未见红色缺血缺氧改变(图2A)；力竭组心肌纤维结构模糊，胞浆内有大量的片状红色缺血缺氧改变(图2B)；运动预适应组心肌缺血缺氧程度减轻，胞浆内有少量的片状红色缺血缺氧改变(图2C)；运动预适应+AG490组胞浆内有一定量的片状红色缺血缺氧改变(图2D)。

计算机图像分析结果显示：与对照组(0)相比，力竭组心肌缺血缺氧面积明显增加(111.82±56.59，P < 0.05)；运动预适应组心肌缺血缺氧面积较力竭组明显减少(43.25±21.96，P < 0.05)；与运动预适应组相比，运动预适应+AG490组心肌缺血缺氧面积显著增加(77.38±39.24，P < 0.05)。 2.5 心脏STAT3蛋白表达的变化 Western blot免疫印迹结果显示：与对照组(0.358±0.136)相比，力竭组(0.521± 0.208)心脏STAT3蛋白表达水平升高(P < 0.05)；运动预适应组(0.789±0.367)心脏STAT3蛋白表达水平又较力竭组明显升高(P < 0.05)；与运动预适应组相比，运动预适应+ AG490组(0.547±0.253)心脏STAT3蛋白表达水平降低 (P < 0.05)，见图3。 2.6 心脏Caspase-3蛋白表达的变化心脏Caspase-3阳性表达主要位于心肌细胞的胞浆，呈棕褐色。对照组胞浆内可见少量的Caspase-3阳性表达，呈细颗粒状，染色浅 (图4A)；力竭组心脏Caspase-3阳性表达增强，胞浆内可见大量的点状或小块状棕褐色颗粒(图4B)；运动预适应组心脏Caspase-3阳性表达减少，胞浆内可见少量的棕褐色颗粒(图4C)；运动预适应+AG490组胞浆内可见较多的Caspase-3阳性表达颗粒(图4D)。计算机图像分析结果显示：与对照组相比，力竭组心脏Caspase-3蛋白表达水平显著升高(1 561.59±182.43，6 126.48±419.35，P < 0.05)；运动预适应组心脏Caspase-3蛋白表达水平较力竭组明显降低(3 259.57±286.34，P < 0.05)；与运动预适应组相比，运动预适应+AG490组心脏Caspase-3蛋白表达水平明显升高(4 861.26±329.58，P < 0.05)。

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引言

激烈运动或超负荷体力劳动时，易出现心肌的缺血缺氧，引发心肌超微结构及其应激性改变，因此对心肌缺血损伤的防治一直是心血管领域研究的热点。运动预适应(exercise preconditioning，EP)是指反复短暂的间歇性大强度运动能够增强心脏对长时间缺血缺氧的耐受性，是减轻心肌缺血损伤的有效途径之一^[1-3]。目前关于运动预适应心肌保护机制尚不明确。研究运动预适应心肌保护作用机制的首要环节是建立运动预适应动物模型。目前学者们普遍是采用对大鼠进行连续3-5 d的间歇跑台运动，诱导运动预适应心肌保护效应^[4-5]，以结扎冠状动脉造成心肌缺血损伤，这种方式手术操作难度大，动物死亡率高，不易使用。本研究在以上模型的基础上，采用一次性力竭运动造成运动性心肌缺血损伤，观察运动预适应对心肌缺血损伤的保护作用，这种建模方式建立方法简单，创伤性小，动物存活率高，重复性好，适合于运动预适应心肌保护机制的实验研究。Janus激酶2-信号转导子和转录激活子3(Janus kinase 2/signal transducers and activators of transcription 3，JAK2/STAT3)信号通路是是近年来备受关注的一条细胞内重要的信号转导途径，参与介导细胞应激、生长、增殖、分化、凋亡等多种生理过程^[6-7]。其中STAT3是该信号通路中一个至关重要的转录因子，研究表明STAT3参与了缺血预适应(ischemic preconditioning，IP)和药物预适应的心肌保护作用^[8-9]，但它参与运动预适应的心肌保护作用的研究报道较少。因此，本研究拟在建立大鼠运动预适应和力竭运动损伤模型的基础上，应用JAK2抑制剂AG490进行干预，用HBFP染色法检测心肌缺血缺氧改变，研究运动预适应对心脏STAT3和Caspase-3表达的影响，探讨JAK2/STAT3通路在运动预适应心肌保护效应中的作用及其机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

1.1 造模动物及材料健康雄性SD大鼠80只，体质量220-250 g，SPF级(解放军第四军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(军)2007-007。

力竭运动损伤模型大鼠运动预适应后心脏STAT3和Caspase-3的表达实验所用试剂
试剂	来源
JAK2激酶抑制剂(AG490)	美国Calbiochem公司
STAT3抗体、Caspase-3抗体	美国Cell signaling公司
二步法免疫组织化学检测试剂盒和DAB显色试剂盒	北京中杉金桥生物公司

1.2 造模方法实验于2013年6至12月在咸阳师范学院体育系运动人体科学实验室完成。

将所有大鼠适应性饲养1周，每天以15 m/min的速度进行10 min适应性跑台练习。1周后将大鼠按体质量分层，随机分为4组，对照组、力竭组、运动预适应组、运动预适应+AG490组，每组20只。建立运动预适应动物模型，大鼠进行连续3 d的间歇跑台运动，速度为28-30 m/min，运动60 min/d，在60 min的运动过程中，运动15 min，休息 5 min，重复3次。对照组：常规饲养3 d。力竭组：常规饲养3 d后，以30 m/min的速度运动至力竭。运动预适应组：先进行3d的运动预适应，24 h后以30 m/min的速度运动至力竭。运动预适应+AG490组：在每天运动预适应前 10 min，腹腔注射JAK2抑制剂AG490(3 mg/kg)，余处理同运动预适应组。

1.3 造模成功检测标准大鼠力竭标准为大鼠用毛刷驱赶无效，在跑台尾端停留2 s仍不愿跑，且失去快速翻正反射^[10]。

1.4 样本采集建模结束后30 min，将各组大鼠以0.4%戊巴比妥钠(10 μL/g)腹腔麻醉后，呈仰卧位固定，每组半数大鼠迅速开胸取心脏，经预冷的灭菌生理盐水清洗后，置液氮速冻，-80 ℃冰箱保存待用，用于Western blot检测。其余半数大鼠经左心室常规灌注固定后，取出心脏，置于40 g/L多聚甲醛中后固定24 h。组织常规乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋和切片。用于心肌缺血缺氧染色和免疫组织化学实验。

1.5 心肌缺血缺氧染色实验采用苏木精-碱性复红-苦味酸(hematoxylin basic fuchsin picric acid，HBFP)染色法。切片脱蜡至水，明矾苏木精染液5 min，自来水冲洗5 min；1%盐酸分化5-10 s，自来水冲洗10 min；0.1%碱性复红染液 3 min，蒸馏水洗5-10 s；纯丙酮5-10 min；0.1%苦味酸纯丙酮5-15 min；二甲苯透明，中性树胶封固。在Olympus显微镜下观察并进行图像采集。应用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0进行图像分析，测定每个视野的心肌缺血缺氧面积。

1.6 Western blot检测取冻融的心肌组织100 mg，冰浴下剪碎放入管中，加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂300 µL，用电动匀浆器低温下匀浆。将制备好的裂解液 4 ℃、14 000 xg离心15 min，收集上清液。取蛋白上清加入2×SDS上样缓冲液煮沸后，经10%SDS-PAGE中电泳，转移至PVDF膜上(恒流30 mA过夜)。取出PVDF膜，置于5% BSA封闭液中室温孵育1 h，加入相应的一抗4 ℃过夜；TBST洗膜后加入相应的二抗，室温下作用1 h；免疫反应性条带用化学发光系统检测，测定心脏STAT3蛋白的表达水平，X射线照相记录。蛋白条带用Image J图像分析软件测积分灰度值，对各组蛋白表达量与内参GAPDH比值进行半定量分析。

1.7 免疫组织化学实验制作常规石蜡切片，切片脱蜡至水；体积分数3%H₂O₂去离子水室温孵育10 min；滴加复合消化液室温孵育10 min；滴加一抗(兔抗Caspase-3抗体)，4 ℃孵育24 h；滴加HRP标记的二抗(羊抗兔IgG)，37 ℃孵育20 min；DAB 显色；脱水，透明，封固。显微镜下观察并摄片。以PBS代替一抗作为阴性对照。在Olympus显微镜下观察并进行图像采集。应用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0进行图像分析，测定心脏Caspase-3免疫反应阳性表达的积分吸光度(A)。

1.8 主要观察指标 ①心肌组织缺血缺氧染色结果。②心脏STAT3蛋白表达的变化。③心脏Caspase-3蛋白表达的变化。

1.9 统计学分析实验数据采用SPSS 17.0统计软件处理，所有数据均用x(_)±s表示，组间比较采用One-Way ANOVA检验。显著性标准为P < 0.05。

讨论

JAK2/STAT3信号通路是目前研究得较为深入和透彻的一个信号转导途径，参与了多种细胞因子和生长因子介导的信号传递。STAT3是JAK2/STAT3信号通路家族中的一员。STAT3通过JAK家族酪氨酸磷酸化后，形成同源或异源型二聚体，然后转位到细胞核，与DNA结合，启动相应的基因转录，产生多种生物学效应^[11-12]。研究显示STAT3在缺血预适应心肌保护中发挥重要作用。Xuan等^[8]发现缺血预适应可诱导JAKl和JAK2的磷酸化，缺血后30 min，STAT3从胞浆转位到细胞核中，与DNA结合的活性明显增加。预先给予JAK抑制剂AG490，能显著抑制JAKs和STATs的活化以及与DNA的结合活性，同时完全取消缺血预适应的心肌保护作用。Goodman等^[13]采用心肌特异性STAT3基因敲除小鼠建立缺血预适应动物模型，发现STAT3基因敲除小鼠对心肌的保护作用减轻，提示STAT3介导了缺血预适应的心肌保护作用。

运动预适应作为缺血预适应的一种特殊形式，不仅能缩小心肌梗死面积，减轻心肌顿抑，加快心肌功能恢复，降低心律失常的发生，而且在心肌细胞凋亡过程中发挥重要作用^[14-17]。本研究在运动预适应动物模型的基础上，采用Western blot方法对心脏中STAT3表达进行了研究。结果显示，与力竭组相比，运动预适应组心脏STAT3蛋白表达显著增加。AG490是一种选择性拮抗JAK2酪氨酸磷酸化的抑制剂，可有效阻断其下游信号转导和转录激活子STAT的活化。本实验在运动预适应前给予AG490处理后，运动预适应+AG490组心脏STAT3蛋白表达较运动预适应组明显减少，提示运动预适应的心肌保护作用与心脏STAT3表达增加有关。研究显示JAK2/STAT3信号通路激活后可调控Caspase-3等凋亡相关因子的表达。Caspase家族是细胞凋亡发挥关键作用的一组半胱氨酸蛋白酶，其中Caspase-3在凋亡级联反应中处于核心地位。在各种生理和病理因素刺激下，Caspase-3被激活而降解其作用底物产生终末事件，引起细胞特征性的凋亡形态学上的改变，加重组织或器官的功能损害^[18-19]。Caspase-3的表达增强可以增加组织细胞的凋亡，抑制Caspase-3的表达可以抑制细胞凋亡的发生。研究表明缺血预适应快速诱导JAK2和STAT3的磷酸化^[20-21]，上调Bcl-2表达，下调Bax和Caspase-3的表达，促进缺血后心室收缩功能的恢复，减少心肌梗死面积和心肌细胞凋亡，预先使用JAK2抑制剂AG490，上述心肌保护作用完全被取消，提示JAK2/STAT3信号通路参与缺血预适应抗心肌细胞凋亡机制。本实验结果表明，运动预适应诱导心脏STAT3蛋白表达增加，同时降低心脏Caspase-3表达和减轻心肌缺血损伤；在运动预适应前给予AG490阻断JAK2/STAT3信号通路后，心脏Caspase-3表达和心肌缺血损伤增加。提示运动预适应诱导心脏STAT3表达增加，进而下调心脏Caspase-3的表达，抑制心肌细胞凋亡，减轻心肌缺血损伤。小结：运动预适应的心肌保护作用机制与JAK2/STAT3信号通路有关。运动预适应通过诱导心脏STAT3表达增加，抑制心脏Caspase-3的表达，减少心肌细胞凋亡，减轻心肌缺血损伤，从而对心肌发挥保护作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程