人脐血间充质干细胞移植对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的神经保护

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1648

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
缺血缺氧性脑病：是各种原因引起的脑组织缺血缺氧导致的脑部病变，最常见的是新生儿缺血缺氧性脑病，但也可发生在其他年龄段。新生儿缺血缺氧性脑病是围生期新生儿因缺氧引起的脑部病变，常见的原因有各种原因导致的胎儿宫内窘迫，如脐带绕颈、羊水异常等，也常见于分娩过程及出生后的窒息缺氧，少数可见于其他原因引起的脑损害。
脐血间充质干细胞：来源于脐血祖细胞，是脐血中的非造血组织多能干细胞，不仅可分化为中胚层来源的多种细胞如脂肪细胞、成骨细胞及肌细胞等，还可分化为内胚层来源的肝细胞和外胚层来源的神经细胞。

摘要
背景：目前研究虽已证实脐血间充质干细胞移植可促进神经功能的恢复，但其具体作用机制尚不明确。
目的：观察人脐血间充质干细胞移植对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的治疗作用，分析其可能的作用机制。
方法：取10 d龄新生SD大鼠(由川北医学院实验动物中心提供)，置于6 000 m海拔高原低压环境模拟仓生活和运动(运动方式为在舱内游泳槽内进行为期15 d的运动，60 min/d)，建立高原缺血缺氧性脑损伤模型。造模成功24 h后，将60只大鼠随机分为移植组、模型组，移植组脑组织海马内注射DAPI标记的脐血间充质干细胞悬液，模型组以同样方法注射等量PBS；另取30只大鼠作为空白对照组，不建模不移植。细胞移植48 h后，TUNEL法检测神经细胞凋亡，Western blot法检测脑组织Caspase-3、p-Akt蛋白表达；细胞移植后21 d，Morris水迷宫实验测试大鼠学习记忆能力；细胞移植28 d后，ELISA法检测大鼠脑组织炎性因子表达，组织学观察脑组织病理变化。
结果与结论：①TUNEL染色显示空白对照组仅见极少量凋亡细胞，模型组可见大量细胞凋亡，移植组细胞凋亡介于空白对照组与模型组之间，3组间细胞凋亡数量比较差异有显著性意义；②移植组脑组织Caspase-3蛋白表达明显低于模型组(P < 0.05)，p-Akt蛋白表达明显高于模型组(P < 0.05)；③Morris水迷宫实验测试结果显示，移植组大鼠逃避潜伏期与游泳距离均明显短于模型组(P < 0.05)；④与模型组比较，移植组肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素10质量浓度明显降低(P < 0.05)，白细胞介素8质量浓度明显升高(P < 0.05)；⑤模型组大鼠海马区神经元水肿，核染色质结构不清，有空泡形成，室管膜细胞重度水肿；移植组大鼠海马区神经元水肿程度轻于模型组，核染色质结构不清，未见空泡形成；⑥结果提示，人脐血间充质干细胞可通过调控炎性因子的表达、抑制神经细胞凋亡来改善新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的学习记忆能力，发挥脑保护作用的，其中PI3K/Akt信号通路在抑制细胞凋亡中可能发挥了一定的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5078-6369(周玉)

关键词: 脐血间充质干细胞, 细胞移植, 神经保护, 缺氧缺血性脑损伤, Caspase-3蛋白, p-Akt蛋白, 细胞凋亡, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Although it has been confirmed that human umbilical cord blood mesenchymal stem cells transplantation can promote the recovery of neural function, its mechanism is unclear.
OBJECTIVE: To observe the therapeutic effect of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells transplantation on hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rats and to analyze its possible mechanism.
METHODS: Sixty 10-day-old neonatal Sprague-Dawley rats (provided by the Experimental Animal Center of North Sichuan Medical College in China) were placed in a simulated hypobaric environment at 6 000-meter altitude to live and exercise. The animal model of ischemic-hypoxic brain injury at high altitude was established by exercising 60 min/d for 15 days in the swimming tank of the cabin. At 24 hours after modeling, 60 rats were randomly divided into transplantation group and model group. In the transplantation group, DAPI labeled human umbilical cord blood mesenchymal stem cells were injected into the rat hippocampus, while in the model group, the same volume of PBS was injected into the rat hippocampus. Another 30 rats were taken as blank control group, with no modeling and treatment. At 48 hours after cell transplantation, apoptosis of neurons was detected by TUNEL method, and western blot assay was used to detect the expression of Caspase-3 and p-Akt protein in brain tissue. At 21 days after cell transplantation, the learning and memory abilities of rats were measured by Morris water maze test. At 28 days after cell transplantation, the expression of inflammatory factors in rat brain tissue was detected by ELISA and pathological changes of the rat brain tissue were observed histologically.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The results of TUNEL staining showed that only a small number of apoptotic cells were observed in the blank control group, and a large number of apoptotic cells were observed in the model group. The number of apoptotic cells in the transplantation group was higher than that in the blank control group but lower than that in the model group. There was a significant difference in the number of apoptotic cells among the three groups. (2) The expression of Caspase-3 protein in the rat brain tissue was significantly lower in the transplantation group than the model group (P < 0.05), while the expression of p-Akt protein in the transplantation group was significantly higher than that in the model group (P < 0.05). (3) In the Morris water maze test, the escape latency and swimming distance in the transplantation group were significantly shorter than those in the model group (P < 0.05). (4) Compared with the model group, the levels of tumor necrosis factor α, interleukin 1β and interleukin 10 were significantly reduced in the transplantation group (P < 0.05), while the level of interleukin 8 was significantly increased in the transplantation group (P < 0.05). (5) In the model group, the rats appeared to have neuronal edema in the hippocampus, with unclear chromatin structure and vacuoles, and severe ependymal cell edema. In the transplantation group, there was milder neuronal edema in the rat hippocampus compared with the model group, and the chromatin structure was still unclear but with no formation of vacuoles. To conclude, human umbilical cord blood mesenchymal stem cells can improve the learning and memory abilities of neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury by regulating the expression of inflammatory factors and inhibiting neuronal apoptosis. PI3K/Akt signaling pathway may play a role in inhibiting apoptosis.

Key words: Cord Blood Stem Cell Transplantation, Hypoxia-Ischemia, Brain, Caspase 3, Tissue Engineering

中图分类号:

周玉，莫国梁，赵婧，方平. 人脐血间充质干细胞移植对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的神经保护[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(13): 2035-2041.

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图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 参加实验120只大鼠，30只大鼠造模失败，其余90只大鼠均进入结果分析。

2.2 人脐血间充质干细胞的培养与标记 细胞接种后72 h开始贴壁，多呈梭形，7 d后梭形细胞逐渐增多，细胞排列具有一定的方向性，呈成纤维样细胞形态；第3代细胞增殖迅速，可见大量成纤维细胞样集落，细胞呈梭形，方向一致，见图1A，B。取第3代人脐血间充质干细胞进行DAPI标记，荧光显微镜观察细胞核呈蓝色强荧光，DAPI标记阳性率在98%以上，见图1C。

2.3 各组脑组织细胞凋亡情况 细胞移植48 h后，TUNEL染色可见空白对照组仅见极少量的凋亡细胞，模型组可见大量细胞凋亡，移植组细胞凋亡介于空白对照组与模型组之间，见图2。空白对照组、模型组、移植组凋亡细胞数分别为(3.2±0.6)，(59.8±9.5)，(22.8±6.4)个，模型组、移植组凋亡细胞数均高于空白对照组(P < 0.05)，移植组凋亡细胞数低于模型组(P < 0.05)。

2.4 各组Western blot检测结果 细胞移植48 h后，模型组脑组织Caspase-3蛋白表达明显高于空白对照组，p-Akt蛋白表达明显低于空白对照组(P < 0.05)；移植组脑组织Caspase-3蛋白表达明显低于模型组，p-Akt蛋白表达明显高于模型组(P < 0.05)；移植组脑组织Caspase-3蛋白表达明显高于空白对照组，p-Akt蛋白表达明显低于空白对照组(P < 0.05)，见图3。

2.5 各组大鼠学习记忆能力检测 Morris水迷宫实验检测结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期与游泳距离均明显延长(P < 0.05)；与模型组比较，移植组大鼠逃避潜伏期与游泳距离均明显缩短(P < 0.05)，但移植组大鼠逃避潜伏期与游泳距离仍显著长于空白对照组(P < 0.05)，见表1。

2.6 各组脑组织匀浆炎症因子检测 与空白对照组比较，模型组肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素10质量浓度明显升高(P < 0.05)，白细胞介素8水平明显降低(P < 0.05)；与模型组比较，移植组肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素10质量浓度明显降低(P < 0.05)，白细胞介素8水平明显升高(P < 0.05)；与空白对照组比较，移植组肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素8质量浓度明显升高(P < 0.05)，白细胞介素10水平明显降低(P < 0.05)，见表2。

2.7 各组脑组织病理观察结果 空白对照组大鼠脑组织海马区内神经元细胞包膜完整，核大而圆，细胞间隙正常，细胞突起清晰；模型组大鼠海马区神经元排列稀疏、散乱，核染色质结构不清，有空泡形成，室管膜细胞重度水肿；移植组大鼠海马区神经元水肿程度轻于模型组，神经元排列稍紊乱，可见少量细胞丢失，见图4。

2.8 人脐血间充质干细胞的存活与分布观察 细胞移植28 d后，移植组大鼠左侧脑组织海马内可见大量DAPI阳性细胞，多分布于齿状回，见图5。

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引言

围生期新生儿因缺氧引起的脑部病变为新生儿缺氧缺血性脑损伤。新生儿缺氧缺血性脑损伤常见的原因有胎儿宫内窘迫(如脐带绕颈、羊水异常等)、分娩过程及出生后的窒息缺氧及其他原因引起的脑损害，多发生于足月儿，也可发生于早产儿，可致新生儿死亡与神经系统发育障碍^[1-2]。目前临床尚无有效治疗缺氧缺血性脑损伤的有效手段。

近些年来，干细胞移植为缺氧缺血性脑损伤的治疗提供了新的思路。间充质干细胞是近年备受关注的多能干细胞，具有多向分化与自我增殖潜能，存在于骨髓、脐血、脂肪、脐带、血管与皮肤等组织中，其中以骨髓间充质干细胞研究居多^[3-6]。研究证实，骨髓间充质干细胞移植后可在脑内分化为神经元和神经胶质细胞，显著降低脑损伤大鼠神经系统的功能损害^[7-10]。但是，骨髓取材存在来源有限、属有创操作、有感染可能及骨髓间充质干细胞随供者年龄增大有老化倾向^[11]。研究证明人脐血间充质干细胞来源于中胚层，其形态和生物学特点与骨髓间充质干细胞极为相似，具有自我更新和多向分化潜能，在一定实验条件下可以分化为骨、脂肪、肌肉，甚至可以跨胚层分化为神经样细胞^[12]。与骨髓间充质干细胞相比，脐血间充质干细胞还具有来源丰富、易于采集及保存、无创伤、不涉及伦理问题、抗原性较弱等优点。目前，各地已有脐血干细胞库建立，可为细胞移植提供充足的细胞来源。王丹妮^[13]研究表明，人脐血间充质干细胞经分离培养后高表达神经上皮干细胞蛋白Nestin，Ki67，提示其均具有部分神经干细胞特性和较强的增殖能力，综合以上，人脐血间充质干细胞是中枢神经系统疾病细胞移植治疗的较佳选择^[14-16]。目前研究虽已证实脐血间充质干细胞移植可促进神经功能的恢复，但其具体作用机制尚不清晰。当前研究主要观察人脐血间充质干细胞移植对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的治疗作用，分析其可能的作用机制，以期为缺氧缺血性脑损伤的干细胞移植治疗提供一些实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2017年1月至7月在川北医学院完成。

1.3 材料

1.3.1 细胞、试剂与仪器 人脐血间充质干细胞(赛业(苏州)生物科技有限公司)；DAPI(北京华夏远洋科技有限公司)；DMEM细胞培养基(上海哈灵生物科技有限公司)；胰蛋白酶(上海士锋生物科技有限公司)；戊巴比妥钠(北京华业寰宇化工有限公司)；多聚甲醛(济南福方化工有限公司)；高原环境压力模拟实验舱-6 000 m环境模拟实验舱(HE-270，东莞市豪恩检测仪器有限公司)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素8、白细胞介素10蛋白酶联免疫吸附试剂盒(南京比迪生物科技有限公司)；小鼠抗大鼠β-actin抗体(武汉塞维尔生物科技有限公司)；兔抗大鼠Caspase3抗体、兔抗大鼠p-Akt抗体(广东蓝岛生物技术有限公司)；倒置显微镜(XDS-200D，上海蔡康光学仪器有限公司)；荧光显微镜(MF52-LED，广州市明美光电技术有限公司)；脑立体定位仪(北京众实迪创科技发展有限责任公司)；Morris水迷宫实验装置(江苏赛昂斯生物科技有限公司)；T25培养瓶(海门市春博生物实验器材厂)；细胞培养箱(上海知楚仪器有限公司)。

1.3.2 实验动物 10 d龄雄性SD大鼠120只，清洁级，体质量(30±2) g，由川北医学院实验动物中心提供，动物研究经川北医学院动物伦理委员会批准，批准号2017ERC(A) 004。

1.4 方法

1.4.1 人脐血间充质干细胞的培养与传代 取出装有人脐血间充质干细胞的冷冻管后，立即放入37 ℃水槽中快速解冻，按5×10⁹ L^-1的细胞浓度接种到T25培养瓶中，放入37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中静置三四小时，以稳定细胞状态。待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。去除培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞1次，添加0.25%胰蛋白酶消化液1 mL，轻微转动培养瓶，使消化液覆盖整个培养瓶底，去除多余胰蛋白酶消化液，在37 ℃温浴1-3 min；倒置显微镜下观察细胞回缩变圆后，加入5 mL完全培养基终止消化；用吸管轻轻吹打混匀，按1∶2或1∶3适当的比例进行接种传代，补充新鲜完全培养基至5 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养；待细胞完全贴壁后，培养观察，之后每隔两三天更换新鲜的完全培养基。

1.4.2 DAPI标记人脐血间充质干细胞 用1 mL ddH₂O将DAPI溶解，制得2.9 mmol/L的DAPI溶液(1 mg DAPI/1 mL H₂O)，取适量DAPI水溶液加到PBS中，制备成50 µmol/L的DAPI溶液。取第3代人脐血间充质干细胞，当细胞达到70%融合时，加入含10%DAPI溶液的DMEM细胞培养基，在37 ℃培养细胞10-20 min，PBS洗细胞6次，荧光显微镜观察。于细胞移植前1 d标记。

检测细胞标记率：DAPI标记细胞后，荧光显微镜下随机选择3个视野计数DAPI阳性细胞，计算标记率，标记率= DAPI阳性细胞÷视野全部细胞×100%。

1.4.3 建立高原缺血缺氧性脑损伤动物模型 参考庞炜^[17]的研究方法进行。取90只SD大鼠，置于6 000 m海拔高原低压环境模拟仓生活和运动，环境温度(26±2) ℃，相对湿度(45±5)%，正常昼夜节律，运动方式为在舱内游泳槽内进行为期15 d的运动，60 min/d，如果大鼠不能以尾部支持底部可休息，水温30 ℃，水深为大鼠尾长的1.5倍。大鼠在高原低压环境模拟仓生活的时间≥20 h/d。最后去掉造模失败的30只大鼠，造模成功大鼠共60只。

1.4.4 实验分组设置 造模成功24 h后，将60只模型大鼠随机分为移植组、模型组，每组30只。采用体积分数10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，将其俯卧固定在脑立体定位仪下方，沿正中线切开头皮，分离脑骨膜，严格按照大鼠颅内立体定位的图谱，选择左侧海马为移植部位：在大鼠左侧颅骨前囟前后2.7 mm、中线外侧2 mm，进针深度2.5 mm位置进行穿刺，移植组注射3 μL人脐血间充质干细胞悬液(细胞浓度为4×10¹⁰ L^-1)，注射速度为0.2 μL/min，注射完毕后留针5 min，缓慢移出针头，模型组以同样方法注射等量PBS。另取30只大鼠作为空白对照组，不建模不移植。

1.4.5 TUNEL法检测细胞凋亡 严格按照试剂盒说明书进行操作。细胞移植48 h后，随机取各组大鼠10只，麻醉后处死，取脑组织，一部分制作脑组织切片，一部分用于Western blot检测。按常规方法脱蜡至水，PBS漂洗3次，5 min/次；加入蛋白酶K工作液，37 ℃反应15-30 min，PBS漂洗3次，5 min/次；室温固定15-30 min，PBS漂洗3次，5 min/次；浸入封闭液中，室温封闭10 min，PBS漂洗3次，5 min/次；小心地用滤纸吸去载玻片上组织周围的多余液体，在切片上滴加100 μL TdT酶反应液，37 ℃避光反应60 min；用去离子水按1∶10稀释20×SSC，终止反应，室温15 min，PBS漂洗3次，5 min/次；浸入体积分数3%H₂O₂/PBS中封闭内源性过氧化物酶活性，室温孵育3-5 min，PBS漂洗3次，5 min/次；滴加100 μL Strept avidin-HRP工作液，37 ℃反应30-60 min，PBS漂洗3次，5 min/次；DAB显色，苏木精复染，去离子水漂洗数次，中性树胶封固，荧光显微镜下每张切片随机选取10个视野进行观察，计数视野中凋亡细胞数，取平均值。

1.4.6 Western blot法检测Caspase-3、p-Akt蛋白表达 细胞移植48 h后，取上述各组新鲜脑组织样本，加入含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂1 mL，制成匀浆后抽提总蛋白。按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，检测样品浓度。

将准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。将蛋白质转移到PVDF膜，按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，在30 mA恒流条件下4 ℃转移过夜。将膜在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育1 h，在封闭过的膜中加入一抗(小鼠抗大鼠β-actin抗体、兔抗大鼠Caspase-3抗体、兔抗大鼠p-Akt抗体)室温孵育1.5 h，抗原抗体结合。加入HRP标记的二抗，室温孵育膜1 h，进行ECL化学发光法检测。采用凝胶成像分析软件检测条带的积分吸光度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.4.7 学习记忆能力检测 细胞移植后21 d，每组剩余20只大鼠参照以往实验方法进行Morris水迷宫实验^[18]。实验装置由透明平台、圆形水池、摄像机及计算机组成。水池内水深度30 cm，水温约23 ℃；将透明平台置于圆形水池第三象限的中心位置，将平台置于水面下2 cm左右。使大鼠面贴水池壁，将其头朝下放入水中，大鼠找到水下平台所需的时间就是逃避潜伏期，记录大鼠逃避潜伏期时间及游泳距离。逃避潜伏期越长说明大鼠学习记忆能越差。如果大鼠超过60 s内仍未找到平台位置，可将其引至平台休息，使其知道平台位置。圆形水池4个象限各训练1次/d，每2次训练间隔为20 min，实验连续进行5 d，最后逃避潜伏期与游泳距离取平均值。

1.4.8 炎症因子检测 细胞移植28 d后，随机取各组大鼠10只，PBS体循环灌注，断颈冰上取脑，称质量，取脑组织0.5 g，加入裂解液(1∶10)，采用手持式匀浆器匀浆2 min，制备脑组织匀浆，4 ℃环境下12 000 r/min离心10 min，取上清液，采用ELISA法分别测定肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素8、白细胞介素10蛋白的表达水平，严格按照试剂盒说明书具体操作流程执行。

1.4.9 脑组织病理观察 细胞移植28 d后，取各组大鼠10只，以3%戊巴比妥钠1.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，将其仰卧位固定于鼠板上，剖开胸腔，显露心脏，剪开右心耳，向主动脉内依次注入150 mL生理盐水、400 mL 100 g/L多聚甲醛，取出全脑，采用40 g/L多聚甲醛固定，常规制作病理切片，冠状位切片厚度4 μm，进行苏木精-伊红染色，光镜下观察拍照。

1.4.10 人脐血间充质干细胞的存活与分布观察 细胞移植28 d后，取上述移植组病理检测剩余一部分大鼠脑组织，40 g/L多聚甲醛固定24 h，体积分数30%蔗糖脱水48 h，-25 ℃包埋，冷冻切片4 μm，荧光显微镜下每张切片随机选取10个视野计数DAPI标记阳性细胞数。

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠脑组织匀浆炎症因子水平；②各组大鼠脑组织病理观察结果；③各组大鼠脑组织神经细胞凋亡情况；④各组大鼠脑组织Caspase-3、p-Akt蛋白表达；⑤移植组大鼠脑组织内人脐血间充质干细胞定植情况。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0统计学软件进行，如符合计量资料正态分布，采用x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

建立良好的实验动物模型，将有助于探究缺氧缺血性脑损伤的发病机制与治疗措施。常用的模型制作方法有感染法(孕鼠腹腔、子宫内感染与幼鼠脑内感染等、缺氧缺血法(单、双侧颈动脉结扎，妊娠期母体子宫动脉结扎，模拟高原环境下的缺氧等)、胆红素等神经毒素致脑瘫法，各种造模方法均有各自的优缺点，并且大多数模型制作需要在麻醉下进行，与临床新生儿缺氧缺血性脑损伤的发病存在较大差异^[18-25]。近年，庞炜^[17]以模拟高原环境下缺氧缺血合并游泳运动的方法制作新生大鼠缺氧缺血脑损伤，很好地模拟了在高原地区新生儿脑病发生的因素，模型容易操作且可量化，结合游泳运动的方法模拟了人在高原环境中运动下的脑缺氧缺血，更加接近临床疾病的发生条件。因此当前实验参考庞炜研究的方法制作了新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型，通过脑组织病理及行为学测试证明实验造模成功。

脐血间充质干细胞移植治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤已经取得了一定成果，但是对于其具体的作用机制仍在继续研究中，目前认为可能的途径主要为^[16]：脐血间充质干细胞在脑内微环境下，分化为与宿主细胞相似的神经元，修复损伤神经组织；脐血间充质干细胞可通过合成与分泌细胞外基质调节宿主神经细胞的增殖与分化，促进内源性神经干细胞的增殖与分化，促进神经功能的恢复；脐血间充质干细胞可分化为血管内皮祖细胞，促进损伤区神经与血管组织的修复。当前研究中Morris水迷宫实验检测结果显示，造模后，大鼠逃避潜伏期与游泳距离均明显延长，说明大鼠空间学习记忆能力显著下降；进行脐血间充质干细胞移植后，大鼠逃避潜伏期与游泳距离较模型组明显缩短，说明脐血间充质干细胞可发挥脑保护作用，改善缺氧缺血性脑损伤大鼠的空间学习记忆能力。对于脐血间充干细胞的移植治疗作用，实验进行了细胞凋亡、炎症因子、细胞存活与定植检测，分析其可能的作用途径。

在新生儿缺氧缺血性脑损伤发病中，神经细胞凋亡性损伤是其中的重要环节，也是导致新生儿功能和神经行为障碍的主要原因^[26-28]。PI3K/Akt是经典的抗凋亡信号通路，Caspase-3蛋白为其中的关键凋亡效应蛋白，而Akt为Caspase-3的上游启动分子，在调控细胞凋亡中发挥着重要作用^[29-31]。p-Akt为Akt的活性形式，在脑损伤中可促进神经细胞存活，抑制其凋亡^[32]。当前研究在细胞移植48 h后，采用TUNEL法检测神经细胞凋亡，Western blot检测脑组织Caspase-3、p-Akt蛋白表达，结果发现缺氧缺血性脑损伤大鼠神经细胞大量凋亡，脑组织Caspase-3蛋白表达升高，而p-Akt蛋白表达降低；而移植人脐血间充质干细胞后，缺氧缺血性脑损伤大鼠神经细胞凋亡数量明显减少，脑组织Caspase-3蛋白显著降低，而p-Akt蛋白表达显著升高，由此推测在人脐血间充质干细胞移植治疗大鼠缺氧缺血性脑损伤的过程中，可能通过激活PI3K/Akt信号通路抑制神经细胞的凋亡，发挥脑保护作用的。

炎症反应是缺氧缺血性脑损伤的重要病理表现^[33]。刘慧娟等^[34]采用骨髓间充质干细胞移植治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤，观察大鼠脑内肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平，发现缺氧缺血性脑损伤大鼠脑内脑内肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平较正常大鼠显著增加，且存在统计学差异；经过骨髓间充质干细胞移植治疗后，缺氧缺血性脑损伤大鼠脑内脑内肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平显著降低，认为骨髓间充质干细胞可能通过下调炎症因子表达来修复缺氧缺血性脑损伤的。当前研究采用ELISA法检测大鼠脑组织炎性因子的表达，发现造模后，缺氧缺血性脑损伤大鼠肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素10质量浓度明显高于空白对照组，白细胞介素8质量浓度明显低于空白对照组，脐血间充质干细胞移植治疗后，缺氧缺血性脑损伤大鼠肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素10质量浓度明显低于模型组，白细胞介素8质量浓度高于模型组，说明人脐血间充质干细胞可通过调控炎性因子的表达来改善缺氧缺血性脑损伤大鼠脑内微环境，发挥脑保护作用，与刘慧娟等^[34]研究结论一致。

研究表明，人脐血间充质干细胞具有可塑性及多向分化潜能，在体内外特定条件下可定向分化为神经元与神经胶质细胞^[35-36]。当前研究结果显示，人脐血间充质干细胞移植1个月后仍能在缺氧缺血性脑损伤大鼠脑内存活，并有一定的迁移能力，但是有关人脐血间充质干细胞的分化以及更长时间的存活等情况实验将进一步追踪观察。

综上所述，人脐血间充质干细胞可通过调控炎性因子的表达、抑制神经细胞凋亡来改善新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的学习记忆能力，发挥脑保护作用的，其中PI3K/Akt信号通路在抑制细胞凋亡中可能发挥了一定的作用。但是有关间充质干细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤的机制复杂，课题组将进一步追踪人脐血间充质干细胞在缺氧缺血性脑损伤动物模型脑内的分化及其在血管重建中的作用，更进一步了解其作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程