缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护及其机制的初步探讨

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.009

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (37): 5537-5537.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.009

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缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护及其机制的初步探讨

张景达，阳富春，阳茂春，刘军廷，胡峰，王静威

广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科，广西医科大学再生医学研究所，广西壮族自治区南宁市 530021

出版日期:2016-09-09 发布日期:2016-09-09
通讯作者: 阳富春，博士，教授，广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科，广西医科大学再生医学研究所，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:张景达，男，1987年生，广西壮族自治区崇左市人，回族，广西医科大学在读硕士，主要从事创伤修复与功能重建方面的研究。
基金资助:
广西自然科学基金资助项目(2011GXNSFC018021)；国家自然科学基金项目(81260276)

Ischemic post-conditioning protects against ischemia-reperfusion injury in the skeletal muscle: a preliminary research on its mechanism

Zhang Jing-da, Yang Fu-chun, Yang Mao-chun, Liu Jun-ting, Hu Feng, Wang Jing-wei

Department of Trauma Orthopedics & Hand Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Institute of Regenerative Medicine of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Online:2016-09-09 Published:2016-09-09
Contact: Yang Fu-chun, M.D., Professor, Department of Trauma Orthopedics & Hand Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Institute of Regenerative Medicine of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhang Jing-da, Studying for master’s degree, Department of Trauma Orthopedics & Hand Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Institute of Regenerative Medicine of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2011GXNSFC018021; the National Natural Science Foundation of China, No. 81260276

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
缺血后调适：又名缺血后处理或缺血后适应，是指在组织缺血后立即施予几个短时程的再灌注/缺血操作，可以引发内源性保护组织缺血再灌注损伤的现象。研究认为，缺血后调适能介导和激活一系列信号级联反应，从而减轻由缺血再灌注引起的细胞凋亡与坏死，发挥其保护作用。
缺血后调适方案可降低骨骼肌缺血再灌注损伤：再灌注挽救激酶信号通路主要由PI3K-Akt和MEK1/ 2-Erk1/2两条重要信号通路组成，再灌注挽救激酶信号通路在缺血预调适和后调适过程中激活了对组织缺血再灌注损伤保护机制的关键环节。

摘要
背景：再灌注损伤挽救激酶信号通路在缺血预调适和后调适引发的组织器官缺血再灌注损伤保护机制中均起重要作用。目前国内外有关缺血后调适对心肌缺血再灌注损伤保护通路机制的研究较多，而对骨骼肌缺血再灌注损伤保护信号通路机制研究较少。
目的：探索后调适方案对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用及再灌注损伤挽救激酶通路机制。
方法：将18只雄性SD大鼠随机等分为缺血再灌注组、缺血后调适组和对照组。缺血再灌注组给予右侧股动脉无创动脉夹夹闭使远端肢体缺血4 h，松开再灌注24 h；缺血后调适组在缺血4 h后立即施加4个循环30 s再灌注/30 s缺血操作，再灌注24 h；对照组分离右侧股动脉不予以处理。
结果与结论：①苏木精-伊红染色显示，与缺血再灌注组相比，缺血后调适组骨骼肌纤维结构病理改变程度较轻，少见炎性灶，肌细胞水肿程度明显改善；②TTC染色结果显示，缺血后调适组的梗死面积小于缺血再灌注组；③Western blot结果显示，缺血后调适组的磷酸化Akt、磷酸化内皮型一氧化氮合酶-S1177蛋白表达量较缺血再灌注组明显增加；而磷酸化内皮型一氧化氮合酶-Thr495的蛋白表达较缺血再灌注组显著降低；④Ca2+诱导线粒体通透性转换孔开放测试结果：缺血后调适组线粒体吸光度的降低程度较缺血再灌注组更为明显。⑤结果表明，缺血后调适能显著减轻大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤，其机制可能通过激活再灌注损伤挽救激酶信号通路作用于线粒体通透性转换孔，限制其开放，从而增强大鼠骨骼肌对缺血再灌注损伤的耐受能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-3245-2426(阳富春)

关键词: 组织构建, 组织工程, 缺血再灌注损伤, 骨骼肌, 缺血后调适, 再灌注损伤挽救激酶通路, Akt, 内皮型一氧化氮合酶, 线粒体通透性转换孔, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Reperfusion injury salvage kinase (RISK) pathway plays an important role in protective mechanism against ischemia reperfusion injury (IRI) induced by both ischemic pre- and post-conditioning. Many researches have been carried out on RISK pathway mechanism underlying ischemic post-conditioning conferring cardioprotection against IRI; however, there is less research about its effect on IRI in the skeletal muscle.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect of an optimized protocol of ischemic post-conditioning on IRI in rat skeletal muscle and its underlying mechanism.
METHODS: Eighteen male Sprague-Dawley rats were equivalently randomized into IRI, ischemic post-conditioning and control groups. Rats were given occlusion or disocclusion of the right femoral artery of the right lower limb. Subsequently, the IRI group rats were subjected to 24 hours of reperfusion; the ischemic post-conditioning group immediately given 4 cycles of 30 seconds reperfusion/30 seconds ischemia, followed by 24 hours of reperfusion; the control group given no intervention.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining showed that in the ischemic post-conditioning group, the morphology of muscle fibers changed little, with fewer inflammatory lesions and milder edema compared with the IRI group. The infarct size with TTC staining in the ischemic post-conditioning group was smaller than that in the IRI group. Western blot analysis revealed that the expressions of phospho-Akt and phosphorylated endothelial nitric oxide synthase-S1177 were significantly increased, but the expression of phosphorylated type endothelial nitric oxide synthase-Thr495 was much decreased in the ischemic post-conditioning group compared with the IRI group. The measurement of mitochondrial permeability transition pore opening with Ca2+ induction showed that the absorbance values in the ischemic post-conditioning group were significantly lower than those in the IRI group (P < 0.05). These results indicate that ischemia-reperfusion injury can be improved by applying an optimal protocol of ischemic post-conditioning in rat skeletal muscle. The underlying mechanism may be associated with the activation of RISK signaling pathway to inhibit opening of mitochondrial permeability transition pore, thereby contributing to the enhanced tolerance to IRI in rat skeletal muscle.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Muscle, Skeletal, Reperfusion Injury, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张景达，阳富春，阳茂春，刘军廷，胡峰，王静威. 缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护及其机制的初步探讨[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(37): 5537-5537.

Zhang Jing-da, Yang Fu-chun, Yang Mao-chun, Liu Jun-ting, Hu Feng, Wang Jing-wei. Ischemic post-conditioning protects against ischemia-reperfusion injury in the skeletal muscle: a preliminary research on its mechanism[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(37): 5537-5537.

图/表（结果） 4

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引言

骨骼肌缺血再灌注损伤主要指肢体骨骼肌经过一段时间缺血再灌注后，不仅功能上没有得到恢复，而且损伤加重的现象，常见于断肢再植、游离肌皮瓣修复以及骨筋膜室综合征减压等治疗后^[1]，常导致预后效果不佳，因此预防或降低缺血再灌注损伤在一定程度上已成为提高肢体损伤修复后功能不可忽视的重要环节。

2003年Zhao等^[2]提出了缺血后调适的概念，即在再灌注前立刻给予一次或多次短暂重复的心肌缺血/再灌注，这能减轻心肌后续长时间缺血再灌注损伤的现象。近10多年来，缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤影响的研究不断增多，并从不同方面用不同方案验证其保护作用^[3-7]。作者所在团队前期实验对3个不同缺血后调适方案(4个循环10 s再灌/10 s缺血、4个循环30 s再灌/30 s缺血、4个循环60 s再灌/60 s缺血)进行比较，结果显示4个循环30 s再灌/30 s缺血保护效果最好^[8]。缺血后调适现象自被发现以来，其作用机制一直引发研究者浓厚的兴趣，如Hausenloy等^[9]发现由促生长因子的磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K-Akt)与有丝分裂原激活蛋白激酶p44/p42细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，Erk)1/2共同构成的再灌注损伤挽救激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)通路，在提高心肌对缺血再灌注损伤的耐受能力中发挥重要作用。

RISK通路被证实在许多器官组织缺血后调适保护机制中发挥着重要的作用^[10-11]。此通路在骨骼肌的缺血再灌注损伤保护机制中研究较少，尤其在骨骼肌的缺血后调适作用机制中尚未见类似研究。一氧化氮合酶是一种存在于哺乳动物细胞的一氧化氮合酶，可分为内皮型、神经型、诱导型，其中内皮型一氧化氮合酶不仅在血管内皮细胞持续表达，而且参与了很多重要的生理功能，如可诱导一氧化氮的生成与释放。生理剂量的一氧化氮能抑制白细胞黏附、平滑肌细胞增殖及血小板聚集^[12-14]，并且可以调控活性氧的产生^[15]。而一氧化氮合酶和一氧化氮的改变在缺血再灌注损伤的病理机制中起关键作用，而对其缺失的干预可以减轻机体组织的再灌注损伤^[16-17]。研究认为，内皮型一氧化氮合酶在缺血预调适激发的缺血再灌注损伤保护中发挥至关重要的作用^[18]，而在缺血后调适的作用如何尚不清楚。线粒体通透性转换孔作为再灌注损伤关键靶点被证实在介导心肌缺血再灌注损伤发挥着重要作用，有研究表明线粒体通透性转换孔的开放可以导致线粒体内促凋亡物质释放到细胞质中从而引起细胞凋亡及死亡^[19]。作者拟研究优选的缺血后调适方案对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用并初步探讨这种保护作用是否也通过激活RISK通路，经PI3K-Akt途径启动，激活内皮型一氧化氮合酶，最终抑制线粒体通透性转换孔的开放。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年6月至2016年2月在广西医科大学科学实验中心完成。

1.3 材料

实验动物：SPF级健康雄性SD大鼠18只，鼠龄10周，体质量280-320 g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物许可证号为SYXK桂2014-0003。动物实验经广西医科大学第一附属医院伦理委员会审查批准。

缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤影响研究使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
总Akt、磷酸化Akt一抗	Cell Signaling公司
总内皮型一氧化氮合酶、磷酸化内皮型一氧化氮合酶-S1177一抗	Abcam公司
磷酸化内皮型一氧化氮合酶-Thr495一抗	Santa Crus Biotechnology公司
GAPDH一抗	武汉华美生物技术公司
二抗抗体	Cell Signaling公司
TTC	北京索莱宝科技有限公司
线粒体提取试剂盒	南京建成生物工程研究所
PVDF膜	Millipore公司
Odyssey双色红外荧光成像系统	美国Licor公司
显微镜	日本OLYMPUS公司
紫外分光光度计	北京普析T6新世纪公司

1.4 方法

1.4.1 动物分组大鼠随机等分为3组，缺血再灌注组、缺血后调适组和对照组，各6只。

1.4.2 骨骼肌缺血再灌注损伤及缺血后调适用2%的戊巴比妥钠(70 mg/kg)腹腔内注射麻醉，仰卧位固定于手术台上。术野常规备皮、消毒、铺巾。分别于右侧腹股沟处做斜行切口，依次切开皮肤、皮下组织、深筋膜，显露股动脉、静脉和股神经，分离股动脉。

缺血再灌注组用无创动脉夹夹闭右侧股动脉4 h，再灌注24 h。缺血后调适组用无创动脉夹夹闭右侧股动脉4 h后紧接着4个循环30 s再灌注/30 s缺血，再灌注 24 h。对照组分离右侧股动、静脉后不阻断血流。

股动脉夹闭时可观察到患肢鼠爪由粉红色转变为暗紫色确认缺血，松夹再灌注患肢鼠爪由暗紫色又转为粉红色确认血流恢复，并证实无血栓形成后依层缝合切口(图1)。

1.4.3 取材大鼠清醒后自由饮食和饮水，再灌注24 h后，大鼠麻醉，取材，样本立即使用或放置于-80 ℃冷冻箱保存。

1.4.4 苏木精-伊红染色新鲜大鼠比目鱼肌后立即用冰生理盐水冲洗干净，于100 g/L多聚甲醛溶液固定 24 h，并石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色，显微镜下观察大鼠骨骼肌组织的病理学变化。

1.4.5 TTC染色小腿腓肠肌冰冻标本中部横切成 2 mm薄片，PBS(0.1 mol/L)洗3遍，2% TTC溶液37 ℃避光浸泡30 min，双蒸馏水洗3遍。数码相机拍照，Image-Pro Plus 6.0软件计算梗死面积。梗死面积百分比(%)=梗死面积/横切片总面积×100%。

1.4.6 Western blot检测提取大鼠骨骼肌组织总蛋白，蛋白定量，-80 ℃保存。取蛋白提取液，进行凝胶电泳，将蛋白质电转移至PVDF膜上，转膜条件相对分子质量150 000以上300 mA、2 h，相对分子质量 150 000以下200 mA、1 h。室温下体积分数5%胎牛血清溶液封闭1 h后加入总Akt、总内皮型一氧化氮合酶、磷酸化Akt、磷酸化内皮型一氧化氮合酶-S1177、磷酸化内皮型一氧化氮合酶-Thr495、GAPDH抗体于4 ℃孵育过夜。洗膜后以对应二抗室温孵育1 h；TBST洗3次。使用双色红外荧光成像系统进行扫描。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析蛋白条带的灰度值，以目标蛋白/GAPDH灰度值比值表示目标蛋白相对表达水平。

1.4.7 线粒体通透性转换孔开放检测线粒体在 200 μmol/L Ca²⁺的诱导下，线粒体通透性转换孔开放导致线粒体水肿、崩解，导致在520 nm下吸光度下降^[20]。取部分胫前肌，按说明书提取线粒体溶液，加入Ca²⁺(200 μmol/L)诱导线粒体通透性转换孔开放后，利用紫外分光光度计检测各组线粒体通透性转换孔吸光度下降的程度。

1.5 主要观察指标 ①大鼠骨骼肌组织的病理学变化；②骨骼肌梗死面积；③PI3K-Akt通路关键蛋白总Akt、总内皮型一氧化氮合酶、磷酸化Akt、磷酸化内皮型一氧化氮合酶-S1177及磷酸化内皮型一氧化氮合酶-Thr495蛋白的表达水平；④线粒体通透性转换孔吸光度变化。

1.6 统计学分析使用SPSS 21.0软件进行分析，数据以x(_)±s表示，各组数据均进行正态检验和方差齐性检验。组间比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

作者所在团队前期通过设计不同缺血后调适方案(即4 h缺血后立即施加4个循环10 s再灌注/10 s缺血、30 s再灌注/30 s缺血、60s再灌注/60 s缺血的后调适操作)研究显示，缺血后调适能不同程度骨骼肌水肿，降低血清乳酸脱氢酶水平，同时降低骨骼肌组织髓过氧化物酶、丙二醛水平，从而减轻大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤^[8]。实验研究用优选的缺血后调适方案进一步探讨其对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤的影响。TTC染色结果显示，相比缺血再灌注组，缺血后调适能有效小骨骼肌梗死面积；苏木精-伊红染色结果也显示与缺血再灌注组相比，缺血后调适组的肌细胞水肿程度明显减轻及肌纤维病理学损伤改变明显改善，进一步证实缺血后调适能提高骨骼肌对缺血再灌注损伤的耐受性。

缺血后调适是针对已经缺血的组织或器官于缺血结束再灌注初期给予多次短时的缺血再灌注的处理，临床上有其潜在应用可能性。一方面，在骨外科手术中比较常见，如断肢再植、游离肌皮瓣移植、骨筋膜室综合征减压后及长时间使用止血带松开时等。另一方面，因为缺血后调适操作本身可能对所施加操作的器官或组织造成潜在(尽管可能微不足道)的损害，因而探究其保护作用机制以应用于临床其实更有意义。RISK通路是一条具有广泛调控作用的信号通路，其通路过程主要有PI3K激活Akt，再启动下游保护性信号级联，尽管下游通路仍未完全弄清楚，但活化的Akt(即磷酸化Akt) 通过磷酸化内皮型一氧化氮合酶促进内源性一氧化氮生成是其中一条重要的途径^[21-22]。Western Blot结果提示缺血后调适组中活化的磷酸化Akt、磷酸化内皮型一氧化氮合酶-S1177表达量较缺血再灌注组明显增多，说明缺血后调适可能通过激活Akt-内皮型一氧化氮合酶-一氧化氮信号通路而发挥其保护作用。有趣的是，实验中缺血再灌注组磷酸化内皮型一氧化氮合酶-Thr495 (Thr495)的表达较缺血后调适组高。有研究显示，Thr495与S1177的作用恰恰相反，Thr495是一种存在于钙调素结合蛋白的苏氨酸残基，长期处于磷酸化，而磷酸化的Thr495可以使S1177去磷酸化，从而使内皮型一氧化氮合酶处于失活状态，抑制一氧化氮的产生^[23-25]。可能的原因是磷酸化的Thr495阻碍了内部电子的流动，从而抑制了L-精氨酸氧化成L-瓜氨酸和一氧化氮的过程^[25-26]。实验结果表明，缺血后调适可能通过某种机制使内皮型一氧化氮合酶-Thr495去磷酸化而使内皮型一氧化氮合酶得以活化。而有研究表明RhoA/Rho- kinase通路一方面可以通过抑制Akt磷酸化，从而抑制PI3K-Akt下游的Ser1177磷酸化使内皮型一氧化氮合酶失活，另一方面又可通过Thr495磷酸化而使内皮型一氧化氮合酶失活^[27]。另外，蛋白激酶C也可能参与了Thr495的磷酸化过程从而抑制内皮型一氧化氮合酶的活化^[28]。Thr495在骨骼肌缺血再灌注损伤机制中发挥着某种重要的作用，而S1177的磷酸化和内皮型一氧化氮合酶的活化与缺血后调适引发骨骼肌缺血再灌注损伤保护密切相关。其内在机制有待进一步研究。

线粒体通透性转换孔为存在于线粒体膜，是一种非特异性的电压和钙离子依赖通道^[29]。氧化应激、钙离子超载、ATP的过度损耗都能使其开放，导致线粒体电位梯度的消失，氧化磷酸化的解偶联，ATP消耗/产生失去平衡，这些因素导致了线粒体结构的不稳定，线粒体结构的变化亦可以使以上情况恶化，这种级联的正反馈最终导致了线粒体肿胀、崩解，释放细胞色素C诱导细胞凋亡和坏死^[30]。有研究表明，线粒体通透性转换孔是RISK信号通路的终末效应器^[31-32]。实验利用Ca²⁺诱导骨骼肌线粒体通透性转换孔开放，结果表明，与缺血再灌注组相比，缺血后调适组线粒体吸光度在2，4及6 min时下降程度均比缺血再灌注组小，说明缺血后调适可能通过激活RISK信号通路抑制下游线粒体通透性转换孔的开放而减轻骨骼肌缺血再灌注损伤。但是RISK信号通路抑制细胞线粒体通透性转换孔开放的机制尚不明确，而有研究表明，在缺血的组织再灌注的最初几分钟，线粒体基质钙离子过载和活性氧族的爆发是导致线粒体通透性转换孔开放的主要原因，而低pH值却能抑制线粒体通透性转换孔的开放^[33]，其具体的机制尚需深入研究。实验显示缺血后调适通过激活RISK机制，特别是PI3K-Akt信号通路，活化内皮型一氧化氮合酶，最终抑制线粒体通透性转换孔开放而降低缺血再灌注损伤。

综上所述，缺血后调适能显著减少骨骼肌缺血再灌注的损伤，其作用机制可能通过部分或完全激活RISK信号通路作用于线粒体通透性转换孔，限制其开放，从而增强骨骼肌对缺血再灌注损伤的保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护及其机制的初步探讨

Ischemic post-conditioning protects against ischemia-reperfusion injury in the skeletal muscle: a preliminary research on its mechanism

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