安石榴苷促进成骨治疗绝经后骨质疏松

doi:10.12307/2024.438

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (26): 4101-4105.doi: 10.12307/2024.438

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安石榴苷促进成骨治疗绝经后骨质疏松

张树东1，黄一琳1，姚琦2

1河南大学第一附属医院骨二科，河南省开封市 475000；2首都医科大学附属北京世纪坛医院关节科，北京市 100038

收稿日期:2023-07-12 接受日期:2023-08-09 出版日期:2024-09-18 发布日期:2023-09-28
通讯作者: 姚琦，博士，主任医师，硕士生导师，首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京市 100038
作者简介:张树东，男，1991年生，河南省民权县人，汉族，硕士，医师，主要从事骨质疏松治疗的基础研究。
基金资助:
河南省医学教育研究项目(Wjlx2021388)，项目负责人：黄一琳

Punicalagin treats postmenopausal osteoporosis by promoting osteogenesis

Zhang Shudong1, Huang Yilin1, Yao Qi2

1Second Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Henan University, Kaifeng 475000, Henan Province, China; 2Department of Joint, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China

Received:2023-07-12 Accepted:2023-08-09 Online:2024-09-18 Published:2023-09-28
Contact: Yao Qi, MD, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Joint, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China
About author:Zhang Shudong, Master, physician, Second Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Henan University, Kaifeng 475000, Henan Province, China
Supported by:
Medical Education Research Project of Henan Province, No. Wjlx2021388 (to HYL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

安石榴苷：石榴中最丰富、活性最高的一种较大的多酚化合物，能通过降低氧化应激、炎症反应和细胞凋亡对肝、肾、神经系统等发挥保护作用，已有研究表明安石榴苷对阿尔茨海默病、心血管疾病、癌症等老年性常见病有一定的治疗效果。
绝经后骨质疏松：是最常见的骨质疏松症类型，绝经期雌激素缺乏导致骨代谢增加，骨吸收超过骨形成，随着时间的推移最终出现骨质疏松，以骨密度降低、骨微结构破坏、骨强度受损和骨折风险增高为特征。

背景：安石榴苷作用广泛，安全性高，但其对成骨细胞和绝经后骨质疏松症的作用尚不清楚。

目的：探讨安石榴苷对成骨细胞和绝经后骨质疏松症的作用。
方法：安石榴苷作用于MC3T3-E1细胞，检测其促成骨细胞增殖作用。在成骨诱导液中添加安石榴苷，检测其促成骨分化作用。卵巢切除大鼠术后灌胃安石榴苷，3个月后进行Micro CT扫描和血清1型前胶原氨基末端肽检测，观察治疗效果。

结果与结论：①CCK-8检测发现安石榴苷能促进成骨细胞增殖(P < 0.05)；②qRT-PCR和Western blot检测发现安石榴苷能促进碱性磷酸酶、Runx2 mRNA和蛋白的表达(P < 0.05)；③Micro CT扫描和血清学检测结果显示，安石榴苷能改善卵巢切除大鼠的骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目和1型前胶原氨基末端肽水平；④结果表明，安石榴苷能促进成骨细胞增殖和分化，且对绝经后骨质疏松大鼠有治疗作用。

https://orcid.org/0000-0002-2103-1274(张树东)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 安石榴苷, 骨质疏松症, 卵巢切除, 成骨细胞, 1型前胶原氨基末端肽

Abstract: BACKGROUND: Punicalagin has a wide range of effects and high safety, but its effect on osteoblasts and postmenopausal osteoporosis is unknown.
OBJECTIVE: To investigate the effect of punicalagin on osteoblasts and postmenopausal osteoporosis.
METHODS: The effect of punicalagin on the proliferation of MC3T3-E1 cells was detected. Punicalagin was added to the osteogenic induction medium to detect its effect on osteogenic differentiation. Punicalagin was used to treat ovariectomized rats and Micro CT scan and serum procollagen type 1 N-terminal propeptide test were performed after 3 months to detect the therapeutic effect.
RESULTS AND CONCLUSION: Cell counting kit-8 assay showed that punicalagin could promote the proliferation of osteoblasts (P < 0.05). The results of qRT-PCR and western blot showed that punicalagin could promote the mRNA and protein expressions of alkaline phosphatase and Runx2 in osteoblasts (P < 0.05). The results of Micro CT scan and serological test showed that punicalagin could improve bone mineral density, bone volume fraction, trabecular thickness, trabecular number and procollagen type 1 N-terminal propeptide level of ovariectomized rats. To conclude, punicalagin can promote osteoblast proliferation and differentiation, and have therapeutic effects in postmenopausal osteoporosis rats.

Key words: punicalagin, postmenopausal osteoporosis, ovariectomy, osteoblast, procollagen type 1 N-terminal propeptide

中图分类号:

张树东, 黄一琳, 姚琦. 安石榴苷促进成骨治疗绝经后骨质疏松[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4101-4105.

Zhang Shudong, Huang Yilin, Yao Qi. Punicalagin treats postmenopausal osteoporosis by promoting osteogenesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(26): 4101-4105.

图/表（结果） 3

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引言

骨质疏松症是最常见的代谢性骨病，以骨密度降低、骨微结构破坏、骨强度受损和骨折风险增高为特征[1-2]。根据世界卫生组织的标准，将低于年轻成人参考人群平均骨密度2.5个标准差定义为骨质疏松[3]。骨质疏松症的发病率在世界范围内呈现上升趋势，全世界大约有2亿的骨质疏松症患者[4]。健康年轻成人骨重塑处在骨吸收与骨形成的动态平衡中，没有骨量的流失，而在慢性疾病、衰老等情况下，骨重塑的平衡被打破，骨吸收大于骨生成，骨重塑过程的不平衡最终会导致骨质疏松症的发生。参与骨重塑的主要细胞是破骨细胞和成骨细胞[5]。
绝经后骨质疏松症是最常见的骨质疏松症类型，主要原因是由于雌激素缺乏[6]。绝经后雌激素缺乏导致骨形成和骨吸收之间的动态平衡被打破，使得骨代谢增加，骨吸收超过骨形成[7-8]。雌激素促进间充质干细胞的成骨分化和成骨细胞的成熟，从而促进骨的形成；此外，雌激素还会抑制破骨细胞的形成并诱导破骨细胞凋亡，从而限制骨吸收。雌激素可能对破骨细胞、成骨细胞和骨细胞具有直接的作用[9]。当女性绝经后体内雌激素不足时，促进骨合成和抑制骨吸收的作用减弱，导致持续的骨流失[10]。绝经后妇女的骨质流失可以分为2个阶段：最初，绝经相关的骨质流失发生在小梁骨，会在3-5年内迅速丢失；随后，是年龄相关的骨质流失，在5-10年的时间内，骨小梁和骨皮质部分的骨质均会流失[11]。绝经后骨质疏松症是骨折的主要危险因素[12-13]，并且骨质疏松性骨折的内固定容易松动，愈合时间和住院时间变长，死亡率也会增加[8]。
骨质疏松症如若得不到治疗，会导致再次骨折甚至多次骨折，增加致残率和死亡率，使用有效的抗骨质疏松药物可预防骨折并改善预后[1]。骨质疏松症的治疗目标是改善骨结构，提高骨强度，降低骨折风险。治疗骨质疏松的药物可以分为两大类，一是抑制骨吸收的药物，代表药物是双膦酸盐和地诺单抗，主要作用于破骨细胞，通过抑制破骨细胞的功能起到治疗骨质疏松的作用；二是促进骨生成的药物，如特立帕肽和罗莫索单抗，作用于成骨细胞，刺激骨生成[14]。抗骨吸收的药物不能使得已经失去的骨量恢复，促进骨生成的药物则能促进骨量的增加。目前，抗骨质疏松治疗的药物都有局限性。
有充分证据表明，部分蔬菜和水果可以降低实验性啮齿动物和人类患骨质疏松症的风险[3]。流行病学研究结果证实，富含植物多酚的饮食可以降低肥胖等慢性疾病的发病风险，安石榴苷是石榴干燥果皮中多酚的主要成分，也存在于石榴果实、叶子当中，易于水解，释放鞣花酸，经消化道吸收进入体内，对多个信号通路起作用，已有研究证实安石榴苷对阿尔茨海默病、心血管疾病、癌症等多种老年慢性疾病有一定的治疗效果[15-17]。但是，安石榴苷对成骨细胞的作用研究很少，因此该研究探讨安石榴苷对成骨细胞和绝经后骨质疏松症的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物和细胞实验。
1.2 时间及地点实验于2022年1月至2023年5月在河南大学第一附属医院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物及分组 12周龄SPF级雌性SD大鼠18只，体质量(250±20) g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2021-0011，水和食物供应充足，环境温度25 ℃，湿度55%。
实验方案经河南大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准(审批号：2021-03-041)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要细胞、药物、试剂和仪器 MC3T3-E1成骨细胞(北京协和医学院基础医院研究所)；安石榴苷(上海麦克林生化科技股份有限公司)；α-MEM培养液、胎牛血清(美国赛默飞公司)；PCR试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；CCK-8试剂盒(南京建成生物工程研究所)；碱性磷酸酶多克隆抗体、Runx2多克隆抗体(美国BD公司)；血清1型前胶原氨基末端肽(procollagen type 1 N-terminal propeptide，P1NP) ELISA试剂盒(英国Abcam公司)；倒置显微镜(Olympus公司，日本)；酶标仪、PCR仪器(Bio-Rad公司，日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 试剂配制 ①MC3T3-E1细胞培养基：含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基，即90 mL α-MEM培养液中加入10 mL胎牛血清；②成骨细胞诱导液：90 mL α-MEM培养液，10 mL胎牛血清，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，10-7 mol/L地塞米松，50 μg维生素C。
1.4.2 成骨细胞增殖实验预实验中设置安石榴苷浓度梯度为1，5，10 μmol/L，进行促进成骨细胞增殖研究，以5 μmol/L效果最优，因此，该研究细胞实验中安石榴苷浓度设置为5 μmol/L。取液氮冻存的MC3T3-E1细胞，复苏，使用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基，在37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱培养。将细胞传代培养至第3代，以5×103/孔的密度接种于96孔板，培养24 h待细胞贴壁后分为2组：对照组使用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基培养；治疗组在含体积分数10%胎牛血清的α-MEM中加入5 μmol/L安石榴苷，每组设置5个复孔，继续培养24，48 h，加入10% CCK-8溶液，培养2 h，酶标仪在450 nm波长检测吸光度值，观察成骨细胞增殖情况。

1.4.3 qRT-PCR检测成骨细胞中碱性磷酸酶和Runx2 mRNA水平将MC3T3-E1细胞复苏，传代培养至第3代，待细胞融合至60%时，胰酶消化细胞并计数，以5×105/孔的密度接种至24孔板，过夜培养，待细胞贴壁后随机分为3组：空白组应用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基培养，诱导组应用成骨诱导液培养，治疗组在成骨诱导液中加入5 μmol/L安石榴苷，药物干预1周后，按照试剂盒说明书的步骤，提取成骨细胞总RNA。以GAPDH作为内参，将mRNA反转录为cDNA，按照试剂盒说明书添加扩增体系，引物由华大基因科技有限公司设计合成，见表1。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 1 min，进行40次循环。每个样本设置3个复孔，根据Ct值计算2-ΔΔCt值。

1.4.4 Western blot检测成骨细胞中碱性磷酸酶和Runx2 蛋白表达水平将MC3T3-E1细胞复苏，传代培养至第3代，待细胞融合至60%时，胰酶消化并计数，以1×106/孔的密度接种至6孔板，过夜培养，待细胞贴壁后分为3组：空白组应用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基培养，诱导组使用成骨诱导液培养，治疗组在成骨诱导液中加入5 μmol/L安石榴苷，药物干预1周后，按照试剂盒步骤裂解细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，稀释，蛋白上样后使用SDS-PAGE凝胶电泳，剥胶、转膜，采用5%脱脂牛奶进行封闭，分别加入碱性磷酸酶(1∶1 000稀释)、Runx2(1∶1 000稀释)和β-actin(1∶2 000稀释)一抗，然后4 ℃孵育过夜，再进行二抗孵育2 h，洗膜、发光，分析计算相对灰度值。
1.4.5 动物实验适应性喂养1周后，将18只SD大鼠随机分为3组：假手术组，给予3%苯巴比妥钠溶液麻醉，分离显露卵巢，切除卵巢周围少量脂肪组织，保留卵巢，逐层缝合切口；卵巢切除组和治疗组分离显露双侧卵巢并摘除，逐层缝合切口。手术结束适应性喂养1周后进行干预。假手术组及卵巢切除组正常饲喂，治疗组以20 mg/kg的用量灌胃安石榴苷给药[15]，每天2次，3个月后所有大鼠麻醉后安乐死。大鼠尾静脉采血，静置1 h，离心，分离血清并-80 ℃冻存，按试剂盒说明书方法检测P1NP水平。分离右侧股骨进行Micro CT扫描，检测骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目等参数。
1.5 主要观察指标安石榴苷对MC3T3-E1细胞增殖、分化的影响，以及对卵巢切除大鼠骨结构参数和骨代谢指标的影响。
1.6 统计学分析所有实验数据采用SPSS 20.0进行统计分析，两组间比较采用独立样本t检验，3组数据比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。统计图采用GraphPad Prism 8.0软件绘制。文章统计学方法已通过河南大学医学统计学专家审核。

讨论

绝经后骨质疏松症表现为骨量低、骨组织微结构退化、骨强度丢失、骨折风险增加[18-19]。全球范围内，50岁以上的女性中有20%-30%被诊断为骨质疏松症[20-21]。正常骨量的维持是通过成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收之间的动态平衡来维持的，在绝经后骨质疏松症中，破骨细胞数量的增加导致骨吸收增加了70%，而骨形成只有少量增加或者保持不变[22]。抑制破骨细胞的功能或促进成骨细胞增殖和分化，都能达到治疗骨质疏松症的目的，而促进成骨作用能使得已经丢失的骨量再增加[23]。与人工合成的药物相比，植物中提取的天然化合物具有成本低、生物利用度高、毒性小的优点，越来越受重视[24]。茶、水果和蔬菜等多种食物来源中都含有多酚，多酚在许多慢性疾病中发挥着保护作用，安石榴苷是石榴中最丰富、活性最高的一种较大的多酚化合物[25]。安石榴苷能通过降低氧化应激、炎症反应和细胞凋亡对肝、肾、神经系统等发挥保护作用[26-27]。该研究发现，安石榴苷能促进成骨细胞增殖和分化，能改善骨质疏松大鼠骨密度和骨小梁结构。
MC3T3-E1细胞是骨组织工程中常用的一种细胞类型，它是由C57BL/6小鼠的颅骨发育而来的成骨细胞，因其培养条件简单、来源明确、性质稳定，非常适合体外成骨机制的研究[28-29]。成骨细胞是从骨髓间充质干细胞分化而来的，排列在骨的表面，负责有机骨基质的合成和分泌，在骨形成中发挥着关键作用[30-31]。成骨细胞的成骨过程可以分为3个阶段：骨增殖、骨形成和矿化。该实验将安石榴苷作用于MC3T3-E1细胞，分别在培养24，48 h时通过CCK-8检测发现安石榴苷能显著促进成骨细胞增殖。在成骨分化过程中，碱性磷酸酶活性突出，在成骨早期表达，是最可靠的成骨分化标志物之一，还能通过调节磷酸盐运输参与钙化过程。成熟的成骨细胞嵌入钙化的骨基质中，碱性磷酸酶从骨基质中的成骨细胞释放出来，沉积在骨膜下和骨骺线等骨化部位[4]。
碱性磷酸酶与成骨细胞的分化和增殖过程密切相关，被用作成骨细胞的生物标志物[32]。Runx2是Runt转录因子家族中的一员，是控制成骨分化的重要转录因子，Runx2缺陷小鼠的骨形成过程受损严重[33-34]。碱性磷酸酶和Runx2是成骨细胞早期成骨的生物标志物，是调控成骨分化的重要因子[35]。该研究将碱性磷酸酶和Runx2作为成骨分化的标志物，检测结果发现安石榴苷能显著提高成骨细胞中碱性磷酸酶、Runx2的mRNA和蛋白表达水平，表明安石榴苷具有促进成骨细胞分化的功能。
因卵巢切除大鼠和人类雌激素缺乏所致的骨流失过程相似，是被广泛用于模拟绝经后骨质疏松症的动物模型[36]。卵巢切除后，动物表现出非常迅速的骨小梁丢失，呈现出骨质减少的表型[37]，其发生机制是破骨细胞数量增加，骨重塑的动态平衡向骨吸收发生倾斜，可以模拟人类绝经早期时骨转换增高的过程，几周后骨质疏松的骨质表型即可变得明显，此外，卵巢切除后成骨细胞失去雌激素的作用，导致成骨细胞活性受损，骨的形成过程受到抑制[10]。该研究通过对大鼠行卵巢切除建立绝经后骨质疏松症模型，结果表明卵巢切除大鼠股骨骨密度显著降低，骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目也显著降低。
骨组织可分化为皮质骨和小梁骨，这2种类型的骨质在细胞和分子组成方面相似，但在功能和力学特性方面不同。皮质骨是长骨最外层的骨骼，是一种非常致密的组织。相反，小梁骨又称松质骨，见于长骨的骨骺、椎骨和关节面附近，是由骨髓包围的薄骨板，与连接支柱组成网络结构[13]。因绝经后骨小梁先受到影响，常用于绝经后骨质疏松症的相关研究，骨小梁微结构也存在性别差异[38]。骨密度和骨微结构是评价骨质量的重要指标[3]。面积骨密度可以通过双能X射线吸收仪测量，是评估骨质疏松治疗药物效果最常用的检测参数，但是双能X射线吸收仪不能用于评估骨小梁微结构的变化[39]。Micro CT则能很好地显示骨小梁微结构，能更全面评估骨结构的变化，在骨相关研究中应用广泛[40]。绝经后骨质疏松症的骨微结构发生退变，骨结构参数发生改变[41-42]。该研究使用Micro CT检测安石榴苷治疗后骨质疏松大鼠的骨质结构，通过扫描右侧股骨发现安石榴苷治疗组大鼠骨密度升高，骨小梁参数也得到改善。P1NP作为骨形成标志物，在绝经后骨质疏松症中显著下降[43]。安石榴苷治疗组骨质疏松大鼠血清P1NP水平显著升高，证明安石榴苷通过促进成骨作用发挥治疗绝经后骨质疏松症的功效。
综上，该研究证实安石榴苷能促进MC3T3-E1成骨细胞增殖和分化，对绝经后骨质疏松症大鼠也能发挥治疗作用，安石榴苷是绝经后骨质疏松症的潜在治疗药物，还需要更多的实验验证其治疗绝经后骨质疏松症的作用机制和远期效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

安石榴苷促进成骨治疗绝经后骨质疏松

Punicalagin treats postmenopausal osteoporosis by promoting osteogenesis

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