2.1   差异表达基因   主成分分析显示两组样本间有明显的偏差聚类，说明HD-MSC和AML-MSC的基因表达谱有显著差异，见图1A。获取得到324个差异基因，其中包括184个上调基因和140个下调基因，例如显著上调的MAF、RRAGD、COX7A1、GPNMB、CRIP1和显著下调的RASD1、HES1、CLDN11、LRRC17、NR4A2，见图1B。截取|log FC|排名前50的上调基因和下调基因，以热图展示每个样本的基因表达情况，见图1C。



2.2   GO富集分析和KEGG通路分析   首先对HD-MSC和AML-MSC的差异表达基因进行GO富集分析和KEGG通路分析，以便更好地了解差异表达基因参与的生物学过程，见图2A。GO分析显示，筛选出的差异表达基因主要富集在正调控细胞分解代谢过程、体细胞干细胞种群维持、对过氧化氢的反应、脂肪细胞分化、脂肪酸代谢过程的生物过程；溶酶体腔、COPⅡ囊泡外壳、三级颗粒、肽酶抑制剂复合物、血小板致密管状网的细胞组分；蛋白酪氨酸/苏氨酸磷酸酶活性、MAP激酶酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性、MAP激酶磷酸酶活性的分子功能。KEGG富集分析结果表明AML-MSC差异基因主要在NOD样受体信号通路中富集。
2.3   GSEA分析   对数据集GSE84881所有基因表达数据进行GSEA分析，结果显示上调的富集通路主要涉及线粒体内的电子传递链氧化磷酸化系统、氧化磷酸化、蛋白聚糖、白色和棕色脂肪细胞的分化、氨基酸调节mtorc1，见图2B；下调的富集通路主要涉及Myc激活通路、有丝分裂前中期、细胞周期、有丝分裂中期和后期、细胞周期检查点，见图2C。




2.4   PPI网络构建及Hub基因挖掘   在STRING数据库中输入上调基因或下调基因，分别得到节点136个和179个，蛋白-蛋白互作线71条和280条，见图3A，B。根据Degree算法筛选出了10个上调的Hub基因：STAT1、OPTN、STX7、CHCHD10、F8、LUM、RRAGC、LGALS3、PHYH、NPC2，见图3C；10个下调的Hub基因：CDH2、EGF、DUSP1、CXCL8、MET、ZFP36、MYC、NFKBIA、ATF3、IL1B，见图3D。



2.5   骨髓间充质干细胞的鉴定结果   原代培养5 d后，可见接种健康供者来源骨髓单个核细胞的培养瓶中存在大量贴壁的梭形细胞，而接种急性髓系白血病患者来源骨髓单个核细胞的培养瓶中贴壁的梭形细胞较少。待细胞融合至90%时进行传代，第3代骨髓间充质干细胞均呈梭形且贴壁生长，见图4A。流式细胞术检测细胞表面标志物的表达，HD-MSC和AML-MSC均高表达CD73、CD90和CD105，而低表达CD11b、CD34、CD45、HLA-DR，见图4B。



2.6   AML细胞条件培养液对骨髓间充质干细胞分化潜能的影响   成脂诱导第14天进行油红O染色，与HD-MSC相比，AML-MSC胞浆内出现更为明显的脂滴形成，见图5A。值得注意的是，与AML-MSC一致，CM-THP-1-MSC和CM-U937-MSC胞浆内表现出显著多于HD-MSC的脂滴形成。成骨形成第21天进行茜素红染色，HD-MSC有明显的钙盐结节形成，而CM-THP-1-MSC、CM-U937-MSC和AML-MSC的钙盐沉积较少，见图5B。



2.7   细胞形态和β-半乳糖苷酶染色结果   与HD-MSC相比，AML-MSC的细胞面积更大，形态扁平，胞质面积增加，同时CM-THP-1-MSC和CM-U937-MSC显示出相同的特征，见图6A。CM-THP-1-MSC、CM-U937-MSC和AML-MSC均表现出增加的β-半乳糖苷酶活性，见图6B。



2.8   细胞周期   流式检测结果显示，与HD-MSC相比，CM-THP-1-MSC、CM-U937-MSC和AML-MSC的G1期细胞增多(P < 0.05)，S期和G2期细胞的比例减少(P < 0.05)，即细胞阻滞于G1期，见图7。




2.9   LGALS3和MYC基因的表达   如图8所示，与HD-MSC相比，CM-THP-1-MSC、CM-U937-MSC和AML-MSC中LGALS3的mRNA表达升高(P < 0.05)，MYC的mRNA表达降低(P < 0.05)。

[1] DINARDO CD, ERBA HP, FREEMAN SD, et al. Acute myeloid leukaemia. Lancet. 2023;401(10393):2073-2086. [2] ZHAO X, LIU HQ, WANG LN, et al. Current and emerging molecular and epigenetic disease entities in acute myeloid leukemia and a critical assessment of their therapeutic modalities. Semin Cancer Biol. 2022;83:121-135. [3] SCHULPEN M, GOEMANS BF, KASPERS GJL, et al. Increased survival disparities among children and adolescents & young adults with acute myeloid leukemia: A Dutch population-based study. Int J Cancer. 2022;150(7):1101-1112. [4] BEJANYAN N, WEISDORF DJ, LOGAN BR, et al. Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study. Biol Blood Marrow Transplant. 2015;21(3):454-459. [5] CHEN Y, LI J, XU L, et al. The genesis and evolution of acute myeloid leukemia stem cells in the microenvironment: From biology to therapeutic targeting. Cell Death Discov. 2022;8(1):397. [6] CORRADI G, BASSANI B, SIMONETTI G, et al. Release of IFNγ by Acute Myeloid Leukemia Cells Remodels Bone Marrow Immune Microenvironment by Inducing Regulatory T Cells. Clin Cancer Res. 2022;28(14):3141-3155. [7] BORELLA G, DA ROS A, BORILE G, et al. Targeting the plasticity of mesenchymal stromal cells to reroute the course of acute myeloid leukemia. Blood. 2021; 138(7):557-570. [8] BOLANDI SM, PAKJOO M, BEIGI P, et al. A Role for the Bone Marrow Microenvironment in Drug Resistance of Acute Myeloid Leukemia. Cells. 2021; 10(11):2833. [9] GALÁN-DÍEZ M, BOROT F, ALI AM, et al. Subversion of Serotonin Receptor Signaling in Osteoblasts by Kynurenine Drives Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discov. 2022;12(4):1106-1127. [10] HUANG D, SUN G, HAO X, et al. ANGPTL2-containing small extracellular vesicles from vascular endothelial cells accelerate leukemia progression. J Clin Invest. 2021;131(1):e138986. [11] WOODS K, GUEZGUEZ B. Dynamic Changes of the Bone Marrow Niche: Mesenchymal Stromal Cells and Their Progeny During Aging and Leukemia. Front Cell Dev Biol. 2021;9:714716. [12] LYU T, WANG Y, LI D, et al. Exosomes from BM-MSCs promote acute myeloid leukemia cell proliferation, invasion and chemoresistance via upregulation of S100A4. Exp Hematol Oncol. 2021;10(1):24. [13] YOU R, WANG B, CHEN P, et al. Metformin sensitizes AML cells to chemotherapy through blocking mitochondrial transfer from stromal cells to AML cells. Cancer Lett. 2022;532:215582. [14] LU J, DONG Q, ZHANG S, et al. Acute myeloid leukemia (AML)-derived mesenchymal stem cells induce chemoresistance and epithelial-mesenchymal transition-like program in AML through IL-6/JAK2/STAT3 signaling. Cancer Sci. 2023;114(8):3287-3300. [15] SHAFAT MS, OELLERICH T, MOHR S, et al. Leukemic blasts program bone marrow adipocytes to generate a protumoral microenvironment. Blood. 2017; 129(10):1320-1332. [16] VON DER HEIDE EK, NEUMANN M, VOSBERG S, et al. Molecular alterations in bone marrow mesenchymal stromal cells derived from acute myeloid leukemia patients. Leukemia. 2017;31(5):1069-1078. [17] YU G, WANG LG, HAN Y, et al. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284-287. [18] SZKLARCZYK D, GABLE AL, LYON D, et al. STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1): D607-D613. [19] DOMINICI M, LE BLANC K, MUELLER I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-317. [20] MENTER T, TZANKOV A. Tumor Microenvironment in Acute Myeloid Leukemia: Adjusting Niches. Front Immunol. 2022;13:811144. [21] AHMED HMM, NIMMAGADDA SC, AL-MATARY YS, et al. Dexamethasone-mediated inhibition of Notch signalling blocks the interaction of leukaemia and mesenchymal stromal cells. Br J Haematol. 2022;196(4):995-1006. [22] MARLEIN CR, ZAITSEVA L, PIDDOCK RE, et al. NADPH oxidase-2 derived superoxide drives mitochondrial transfer from bone marrow stromal cells to leukemic blasts. Blood. 2017;130(14):1649-1660. [23] ABDUL-AZIZ AM, SUN Y, HELLMICH C, et al. Acute myeloid leukemia induces protumoral p16INK4a-driven senescence in the bone marrow microenvironment. Blood. 2019;133(5):446-456. [24] AL-AZAB M, SAFI M, IDIIATULLINA E, et al. Aging of mesenchymal stem cell: machinery, markers, and strategies of fighting. Cell Mol Biol Lett. 2022;27(1):69. [25] KORNBLAU SM, RUVOLO PP, WANG RY, et al. Distinct protein signatures of acute myeloid leukemia bone marrow-derived stromal cells are prognostic for patient survival. Haematologica. 2018;103(5):810-821. [26] CORRADI G, BALDAZZI C, OČADLÍKOVÁ D, et al. Mesenchymal stromal cells from myelodysplastic and acute myeloid leukemia patients display in vitro reduced proliferative potential and similar capacity to support leukemia cell survival. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1):271. [27] ZHANG L, ZHAO Q, CANG H, et al. Acute Myeloid Leukemia Cells Educate Mesenchymal Stromal Cells toward an Adipogenic Differentiation Propensity with Leukemia Promotion Capabilities. Adv Sci (Weinh). 2022;9(16):2105811. [28] CHEN Y, HOFFMEISTER LM, ZAUN Y, et al. Acute myeloid leukemia-induced remodeling of the human bone marrow niche predicts clinical outcome. Blood Adv. 2020;4(20):5257-5268. [29] TRATWAL J, ROJAS-SUTTERLIN S, BATACLAN C, et al. Bone marrow adiposity and the hematopoietic niche: A historical perspective of reciprocity, heterogeneity, and lineage commitment. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2021;35(4):101564. [30] MAYNARD RS, HELLMICH C, BOWLES KM, et al. Acute Myeloid Leukaemia Drives Metabolic Changes in the Bone Marrow Niche. Front Oncol. 2022;12:924567. [31] HARA A, NIWA M, NOGUCHI K, et al. Galectin-3 as a Next-Generation Biomarker for Detecting Early Stage of Various Diseases. Biomolecules. 2020;10(3):389. [32] TARIGHAT SS, FEI F, JOO EJ, et al. Overcoming Microenvironment-Mediated Chemoprotection through Stromal Galectin-3 Inhibition in Acute Lymphoblastic Leukemia. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12167. [33] SADOVSKAYA A, PETINATI N, DRIZE N, et al. Acute Myeloid Leukemia Causes Serious and Partially Irreversible Changes in Secretomes of Bone Marrow Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Int J Mol Sci. 2023;24(10):8953. [34] KARGAR-SICHANI Y, MOHAMMADI MH, AMIRI V, et al. Effect of Acute Myeloid Leukemia-derived Extracellular Vesicles on Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells: Expression of Poor Prognosis Genes. Arch Med Res. 2023;54(2):95-104. [35] LIU ZZ, HONG CG, HU WB, et al. Autophagy receptor OPTN (optineurin) regulates mesenchymal stem cell fate and bone-fat balance during aging by clearing FABP3. Autophagy. 2021;17(10):2766-2782. [36] YAMADA T, FUKASAWA K, HORIE T, et al. The role of CDK8 in mesenchymal stem cells in controlling osteoclastogenesis and bone homeostasis. Stem Cell Reports. 2022;17(7):1576-1588. [37] GUO H, ZHAO M, QIU X, et al. Niemann-Pick type C2 deficiency impairs autophagy-lysosomal activity, mitochondrial function, and TLR signaling in adipocytes. J Lipid Res. 2016;57(9):1644-1658. [38] XIONG Y, SI Y, FENG Y, et al. Prognostic value of lipid metabolism-related genes in head and neck squamous cell carcinoma. Immun Inflamm Dis. 2021;9(1):196-209.  [39] DING M, MA YJ, DU RQ, et al. CHCHD10 Modulates Thermogenesis of Adipocytes by Regulating Lipolysis. Diabetes. 2022;71(9):1862-1879. [40] GLADYCK S, ARAS S, HÜTTEMANN M, et al. Regulation of COX Assembly and Function by Twin CX9C Proteins-Implications for Human Disease. Cells. 2021; 10(2):197. [41] 王诗,谢凯,任志健,等. SNARE蛋白在肿瘤发生中作用的研究进展[J].医学研究生学报,2022,35(8):872-876. [42] APPUNNI S, RUBENS M, RAMAMOORTHY V, et al. Lumican, pro-tumorigenic or anti-tumorigenic: A conundrum. Clin Chim Acta. 2021;514:1-7. [43] LAMA-SHERPA TD, JEONG MH, JEWELL JL. Regulation of mTORC1 by the Rag GTPases. Biochem Soc Trans. 2023;51(2):655-664. [44] WALKER GE, MERLIN S, ZANOLINI D, et al. Factor VIII as a potential player in cancer pathophysiology. J Thromb Haemost. 2022;20(3):648-660. [45] MELNIK S, WERTH N, BOEUF S, et al. Impact of c-MYC expression on proliferation, differentiation, and risk of neoplastic transformation of human mesenchymal stromal cells. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):73. [46] ZHOU C, GE Z, SONG L, et al. Strontium-modified titanium substrate promotes osteogenic differentiation of MSCs and implant osseointegration via upregulating CDH2. Clin Oral Implants Res. 2023;34(4):297-311. [47] PARKER J, HOCKNEY S, BLASCHUK OW, et al. Targeting N-cadherin (CDH2) and the malignant bone marrow microenvironment in acute leukaemia. Expert Rev Mol Med. 2023;25:e16. [48] KHAN AA, HUAT TJ, AL MUTERY A, et al. Significant transcriptomic changes are associated with differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into neural progenitor-like cells in the presence of bFGF and EGF. Cell Biosci. 2020;10:126. [49] KNIGHT C, JAMES S, KUNTIN D, et al. Epidermal growth factor can signal via β-catenin to control proliferation of mesenchymal stem cells independently of canonical Wnt signalling. Cell Signal. 2019;53:256-268. [50] LIU P, LI Y, WANG W, et al. Role and mechanisms of the NF-ĸB signaling pathway in various developmental processes. Biomed Pharmacother. 2022;153:113513. [51] MALKOVA AM, GUBAL AR, PETROVA AL, et al. Pathogenetic role and clinical significance of interleukin-1β in cancer. Immunology. 2023;168(2):203-216. [52] CAMBIER S, GOUWY M, PROOST P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023;20(3):217-251.  [53] SADOVSKAYA AV, PETINATI NA, KAPRANOV NM, et al. Dynamics of Changes in the Properties of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells in Patients with Acute Leukemia. Bull Exp Biol Med. 2023;174(4):556-563. [54] HU S, ZHAO X, LI R, et al. Activating transcription factor 3, glucolipid metabolism, and metabolic diseases. J Mol Cell Biol. 2023;14(10):mjac067. [55] ZANDI Z, KASHANI B, ALISHAHI Z, et al. Dual-specificity phosphatases: therapeutic targets in cancer therapy resistance. J Cancer Res Clin Oncol. 2022;148(1):57-70. [56] MAKITA S, TAKATORI H, NAKAJIMA H. Post-Transcriptional Regulation of Immune Responses and Inflammatory Diseases by RNA-Binding ZFP36 Family Proteins. Front Immunol. 2021;12:711633.   [57] RIVAS S, MARÍN A, SAMTANI S, et al. MET Signaling Pathways, Resistance Mechanisms, and Opportunities for Target Therapies. Int J Mol Sci. 2022;23(22): 13898.

[1]	卜献忠, 卜保献, 许 伟, 张 驰, 张翼升, 钟远鸣, 李智斐, 唐福波, 麦 威, 周劲衍. 急性期神经根型颈椎病患者的血清差异蛋白组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 535-541.
[2]	陆晓铃, 刘 斌, 徐 斌. 类风湿关节炎脂肪酸代谢相关基因的生物信息学鉴定与验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5116-5121.
[3]	陈冠廷, 张琳琪, 王希茜, 陈 旭. 自噬及铁死亡相关靶点与慢性肾病肾功能损伤的进展：生物信息学分析及实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5122-5129.
[4]	宋文学, 廖益东, 明 江, 何龙才, 陈光唐, 陈 晨, 王梓力, 熊明松, 崔君拴, 徐卡娅. 颅内移植人骨髓间充质干细胞减轻大鼠脑缺血再灌注损伤[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 5036-5041.
[5]	高 杰, 邹星星, 文邦红, 李远迪, 苏 敏, 胡 蓉. Pax6基因表达对过氧化氢诱导骨髓间充质干细胞衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 4921-4925.
[6]	赵文静, 刘百坤, 李秋莲, 陈 曦. 长期传代培养对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 4926-4930.
[7]	陈 双, 席志鹏, 王 楠, 房晓阳, 刘 鑫, 康 然, 谢 林. 槲皮素靶向CCR1、CXCR4促进人骨髓间充质干细胞的迁移[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 4945-4950.
[8]	施伟丽, 刘珊珊, 常红波, 高海霞, 王新洲, 秦 楠, 吴 鸿. 血管内皮生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子改善骨髓间充质干细胞复制性衰老[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 4958-4963.
[9]	林 峰, 程 玲, 高 勇, 周建业, 商青青. 透明质酸水凝胶包裹骨髓间充质干细胞改善心肌梗死大鼠的心功能(Ⅲ)[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 355-359.
[10]	毕玉杰, 马笃军, 彭力平, 周紫琼, 赵 静, 朱厚均, 钟秋辉, 杨玉鑫. 中医药联合医用水凝胶治疗疾病的策略及意义[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 419-425.
[11]	李树栋, 梁学振, 骆 帝, 李嘉程, 阎博昭, 李 刚. 绝经后骨质疏松症潜在铁死亡及细胞焦亡相关诊断生物标志物[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4511-4515.
[12]	陈相汕, 刘 桦, 孙伟康, 李华南. m6A甲基化调控骨代谢防治骨质疏松症的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4572-4577.
[13]	杨启培, 陈 锋, 崔 伟, 张 驰, 武瑞骐, 宋振恒, 孟 鑫. 山奈酚活性单体治疗骨质疏松症的相关信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4242-4249.
[14]	刘 莹, 刘亚磊, 刘 玉. 雏菊叶龙胆酮拮抗阿霉素诱导心肌损伤中差异表达lncRNA的筛选及分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4121-4128.
[15]	刘 婧, 梁芳园, 李 佳, 王 华. 针刺治疗腹泻型肠易激综合征模型大鼠结肠黏膜差异蛋白质组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4129-4136.

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是成人急性白血病中最常见的恶性血液系统疾病，其病因是异常分化的髓系母细胞克隆性扩增[1-2]。AML预后极差，约有38%患者经异基因造血干细胞移植后出现复发，患者5年生存率仅为43%-58%[3-4]。研究表明引起临床病情复发的主要因素是肿瘤微环境中白血病细胞的增殖[5]。
越来越多的证据支持AML母细胞能将正常骨髓微环境重塑为肿瘤微环境，进而引起肿瘤细胞的增殖和抵抗化疗药物[6-10]。骨髓间充质干细胞是骨髓微环境中的关键成分之一，具有自我更新、多向分化的潜能，可分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞等多种基质细胞[11]。研究显示，骨髓间充质干细胞可通过线粒体转运以及分泌外泌体和细胞因子等方式促进AML细胞增殖和化疗药物抵抗[12-14]。此外，骨髓间充质干细胞衍生的脂肪细胞在AML细胞的诱导下能够通过促进脂肪酸转运，进而促进肿瘤细胞的增殖[15]。故肿瘤微环境中骨髓间充质干细胞与AML细胞的交互作用机制是当前科学研究领域的热点问题。
因此，该研究通过生物信息学和体外细胞实验验证健康供者来源骨髓间充质干细胞(healthy donor mesenchymal stem cell，HD-MSC)与AML患者来源骨髓间充质干细胞(acute myeloid leukemia mesenchymal stem cell，AML-MSC)生物学功能的差异，并探讨了AML细胞条件培养液对HD-MSC生物学功能的影响。其研究结果将进一步解析肿瘤微环境中AML细胞如何重塑骨髓间充质干细胞的功能以及为AML微环境中骨髓间充质干细胞的生物学功能变化和药物治疗提供新的基础实验依据。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1    设计   生物信息学分析结合体外细胞实验验证，两组间比较进行 t 检验。
1.2   时间及地点   实验于2021年11月至2023年8月在贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心进行。
1.3   材料
1.3.1   骨髓样本   在贵州医科大学附属医院血液科获取骨髓样本。经过患者知情同意后，共获取6例健康供者和3例急性髓系白血病患者的骨髓血标本，其中健康供者包括男3例、女3例，年龄(31±14)岁；AML患者包括男2例、女1例，年龄(29±17)岁。该研究经贵州医科大学附属医院医学伦理委员会批准，伦理批号：2021伦理审查第(181)号。
1.3.2   实验细胞   AML细胞系THP-1和 U937由贵州医科大学附属医院血液科王季石教授实验室赠予。
1.3.3   实验试剂与仪器   RPMI 1640培养基、L-DMEM培养基、H-DMEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(Biological Industries，以色列)；青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(Biosharp，中国)；人外周血淋巴细胞分离液、TriQuick Reagent总RNA提取试剂、β-半乳糖苷酶染色试剂盒(索莱宝，中国)；油红O染色试剂盒、茜素红S染色液(碧云天，中国)；细胞周期检测试剂盒(凯基生物，中国)；Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix(抗体法，No Rox)、Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)(翌圣生物，中国)；0.22 μm过滤器(Millipore，美国)；引物(生工，中国)；实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)；流式细胞仪(BD，美国)；倒置荧光显微镜(Olympus Corporation，日本)。
1.4   方法   
1.4.1   数据获取   从GEO数据库(hps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)获取符合下列标准的数据集：①检索词为“MSC AND AML”；②物种为“Homo sapiens”；③研究类型为“Expression profiling by array”；④样本为从骨髓抽吸物中分离提取并纯化的骨髓间充质干细胞，并且未经药物处理；⑤同时具有AML和健康对照的骨髓间充质干细胞样本。经过筛查，数据集GSE84881符合条件。数据集GSE84881总共包含23个样本，包括19例AML-MSC和4例HD-MSC，所有样本均纳入此次研究[16]。
1.4.2   差异表达基因筛选   使用“ggplot2”包绘制主成分分析图(principal component analysis，PCA)以展示各样本间差异情况。为分析AML组相对于健康对照组骨髓间充质干细胞基因表达的差异，使用R软件的“limma”包进行两组的差异分析进而提取差异表达基因。差异表达基因的筛选标准为：adj.P.Value < 0.05和|log FC|>0.58。R软件中的“ggplot2”包和“ComplexHeatmap”包用于绘制火山图和显著上下调前50的差异表达基因的热图。
1.4.3   GO富集分析和KEGG通路分析   GO富集分析包含对目的基因的3类基因功能的探索，包括生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。KEGG通路分析研究目的基因在通路水平的相关生物进程。使用org.Hs.eg.db包进行ID转换后再利用clusterProfiler包进行GO富集分析和KEGG通路分析[17]。adj.P.Value < 0.05为有统计学意义，使用“ggplot2”包对富集结果可视化。
1.4.4   基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)   GSEA用于分析AML-MSC和HD-MSC的基因表达差异的生物学意义，因其对所有基因的表达情况展开分析而不同于GO富集分析和KEGG通路分析。参考的c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt [All Canonical Pathways]来源于msigdbr包。使用org.Hs.eg.db包对分子进行ID转换后，用clusterProfiler包进行GSEA分析。同时符合adj.P.Value < 0.05和false discovery rate(FDR) < 0.25为显著富集。
1.4.5   蛋白质-蛋白质互作(protein-protein interaction，PPI)网络的构建及Hub基因的筛选   将筛选出的上调或下调差异表达基因分别输入STRING数据库(https://cn.string-db.org/)，设置最小交互分数0.4为限定条件进行PPI网络分析[18]，导出可视化图片和相关文件。使用Cytoscape软件(v3.9.1)中CytoHubba插件的Degree算法筛选PPI网络中评分最高的10个Hub基因。
1.4.6   HD-MSC和AML-MSC的分离及培养   取健康供者及AML患者的骨髓血，通过Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，随后采用贴壁传代纯化骨髓间充质干细胞。在37 ℃、体积分数为5%CO2的细胞培养箱中培养，每3 d换液1次，培养瓶中细胞密度达80%-90%以上进行传代处理。取第3-5代骨髓间充质干细胞用于后续实验。
1.4.7   HD-MSC和AML-MSC表面标志物的鉴定   取上述两组第3代或第4代骨髓间充质干细胞用0.25%胰酶消化，获得单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min后弃上清，加入PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1×109 L-1。取200 μL细胞悬液于EP管中，分别加入5 μL的鼠抗人CD105-PE、CD73-PE、CD45-PE、CD11b-PE、CD34-FITC、CD90-FITC、HLA-DR-FITC单克隆抗体，同型对照抗体IgG-FITC和IgG-PE作为阴性对照，4 ℃条件下避光孵育30 min，PBS清洗1次后使用流式细胞仪进行检测[19]。
1.4.8   AML条件培养液的制备   使用1640完全培养基培养AML系THP-1和U937细胞，当细胞密度达到50%时，更换培养基培养24 h，900 r/min离心5 min，收集细胞上清液，用0.22 μm滤器过滤除去上清液中残存的细胞和细胞碎片，-80 ℃保存备用。以L-DMEM完全培养基与AML细胞上清液体积比为4∶1混合作为条件培养液(CM-THP-1和CM-U937)，使用2种细胞条件培养液分别培养第3代HD-MSC 48 h获得条件培养液组骨髓间充质干细胞(CM-THP-1-MSC和CM-U937-MSC)。
1.4.9   骨髓间充质干细胞成脂分化及染色   取第3代HD-MSC、AML-MSC以2×104/cm2的密度接种于6孔板中培养24 h，分成4组：HD-MSC组和AML-MSC组继续使用L-DMEM完全培养基培养48 h，CM-THP-1-MSC组和CM-U937-MSC组使用CM-THP-1和CM-U937干预48 h。将上述4组的培养基更换为成脂诱导培养基(H-DMEM培养基、体积分数为10%胎牛血清、250 nmol/L地塞米松、500 µmol/L 异丁基甲基黄嘌呤、5 mg/L胰岛素、1 µmol/L罗格列酮)，每隔3 d更换1次诱导液，诱导14 d进行油红O染色：用40 g/L多聚甲醛中固定15 min，PBS洗1遍，油红O染色30 min，PBS冲洗1遍，使用倒置荧光显微镜观察脂滴生成情况并拍照记录。
1.4.10   骨髓间充质干细胞成骨分化及染色   取第3代HD-MSC、AML-MSC以2×104/cm2的密度接种于6孔板中培养24 h，分成4组：HD-MSC组和AML-MSC组继续使用L-DMEM完全培养基培养48 h，CM-THP-1-MSC组和CM-U937-MSC组使用CM-THP-1和CM-U937干预48 h。将上述4组的培养基更换为成骨诱导体系(H-DMEM培养基、体积分数为10%胎牛血清、0.1 μmol/L地塞米松、0.2 mmol/L L-抗坏血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油钠)，每隔3 d更换1次诱导液，诱导21 d进行茜素红S染色：PBS洗涤细胞1次，用40 g/L多聚甲醛固定5 min，PBS冲洗1次，加入1 mL茜素红S染色5 min，PBS冲洗1次，使用倒置荧光显微镜观测钙盐沉积情况并拍照记录。
1.4.11   细胞形态观察及β-半乳糖苷酶染色   取第3代HD-MSC、AML-MSC以2×104/cm2的密度接种于6孔板中培养24 h，分成4组：HD-MSC组和AML-MSC组继续使用L-DMEM完全培养基培养48 h，CM-THP-1-MSC组和CM-U937-MSC组使用CM-THP-1和CM-U937干预48 h，进行β-半乳糖苷酶染色：PBS洗涤1次，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min，PBS洗涤3次，每次3 min，加入染色工作液，37 ℃孵育12 h，在倒置荧光显微镜下观察衰老细胞呈淡蓝至深蓝色。
1.4.12   细胞周期   取第3代HD-MSC、AML-MSC以5×105/cm2的密度接种于25 cm2培养瓶中培养24 h，分成4组：HD-MSC组和AML-MSC组继续使用L-DMEM完全培养基培养48 h，CM-THP-1-MSC组和CM-U937-MSC组使用CM-THP-1和CM-U937干预48 h。收集细胞，PBS清洗1次，使用预冷的体积分数70%乙醇固定细胞12 h，离心去除固定液，使用PBS调整细胞浓度为1×109 L-1，取1 mL细胞悬液，离心，加入500 μL染色工作液重悬细胞，染色30 min后上机检测，使用Flowjo进行分析。
1.4.13   RT-qPCR   取第3代HD-MSC、AML-MSC以5×105/cm2的密度接种于25 cm2培养瓶中培养24 h，分成4组：HD-MSC组和AML-MSC组继续使用L-DMEM完全培养基培养48 h，CM-THP-1-MSC组和CM-U937-MSC组使用CM-THP-1和CM-U937干预48 h。收集细胞，采用Trizol法提取总RNA，使用Nanodrop One分光光度计检测RNA浓度及纯度。将RNA反转录为cDNA后进行qPCR检测，反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共45个循环。引物序列如表1所示，以β-actin为内参，2-ΔΔct计算目的基因的相对表达量。

1.5   主要观察指标   HD-MSC、AML-MSC的生物信息学分析以及AML细胞条件培养液对骨髓间充质干细胞分化、细胞状态、细胞周期和Hub基因LGALS3、MYC表达的影响。

1.6   统计学分析   采用GraphPad Prism 8.0.1软件进行数据的统计学处理以及绘图。数据以x±s表示，HD-MSC组与AML-MSC组间比较使用独立样本t检验进行统计分析，HD-MSC组与CM-THP-1-MSC、CM-U937-MSC组间比较使用配对t检验进行统计分析。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过贵州医科大学生物统计学专家审核。

AML细胞可重塑骨髓微环境，从而促进肿瘤发生发展的进程[20]。骨髓间充质干细胞是骨髓微环境的主要细胞组成部分，其可通过多种途径促进AML细胞增殖和增加AML对化疗诱导细胞毒性的抵抗[21-22]。因此，开展肿瘤微环境中骨髓间充质干细胞生物学功能研究，有望进一步解析AML细胞与肿瘤微环境之间的相互作用机制。
AML细胞可主动通过NOX2衍生超氧化物诱导肿瘤微环境的衰老[23]。实验研究显示，衰老的骨髓间充质干细胞表现为细胞形态变化、P53上调、分化功能改变、细胞周期停滞、β-半乳糖苷酶上调、集落形成能力下降以及衰老分泌表型[24]。
该研究表明，与HD-MSC相比，GSEA分析AML-MSC的多个细胞周期相关通路下调，并表现为细胞阻滞。同时，经条件培养液处理的HD-MSC与AML-MSC表现出相同的细胞衰老特征，细胞面积较大、分化能力改变、β-半乳糖苷酶活性以及细胞周期阻滞。这与以往研究中患者来源间充质干细胞P16、P21、P53表达增高[23，25]、增殖速度减慢相符[26]，提示AML-MSC呈衰老状态。
该研究发现，AML-MSC与HD-MSC的差异基因在体细胞干细胞种群维持和脂肪细胞分化中富集，GSEA分析发现AML-MSC在白色和棕色脂肪细胞的分化通路中上调。体外实验结果表明：与HD-MSC相比，CM-THP-1-MSC、CM-U937-MSC和AML-MSC均表现出成脂诱导分化后较多的脂滴积累和成骨诱导分化后较少的钙盐沉积。而目前白血病肿瘤微环境中间充质干细胞的分化功能存在争论[26-27]，该研究为此增加了新的证据，即AML微环境中骨髓间充质干细胞成脂分化能力增强和成骨分化能力减弱，这可能与AML细胞分泌的细胞因子等活性物质相关。既往研究表明初诊AML-MSC成骨分化和钙盐沉积均存在显著缺陷，并且外周血中骨钙素水平较高患者往往具有不良结局[28]。脂肪细胞在造血微环境的动态调节中发挥作用[29]，同时其能够为肿瘤细胞提供游离脂肪酸并改变其细胞周期，从而促进AML细胞增殖和化学抗性[30]，可见微环境中骨髓间充质干细胞衍生的脂肪细胞和成骨细胞发生变化可能会影响正常造血干细胞的功能和肿瘤细胞的进程。
该研究筛选出10个上调的Hub基因，分别为LGALS3、OPTN、STAT1、NPC2、PHYH、CHCHD10、STX7、LUM、RRAGC和F8。由LGALS3编码的蛋白质galectin-3是β-半乳糖苷结合凝集素家族的成员，参与多种细胞功能，在某些疾病和肿瘤的诊断或预后中发挥作用[31]。在其他血液系统恶性肿瘤中，骨髓基质细胞产生的galectin-3在肿瘤细胞迁移和化疗药物抵抗中也发挥关键作用[32]。研究指出，AML-MSC高表达galectin-3[33]，且经AML细胞外囊泡处理后的骨髓间充质干细胞中LGALS3表达增加[34]。OPTN是调节自噬的关键因子，能通过作用于FABP3促进骨髓间充质干细胞的成骨分化和减弱脂肪生成[35]。STAT1参与多种细胞因子的信号传导，在衰老的骨髓间充质干细胞中显著增加并促进破骨细胞活化[36]。NPC2在调节溶酶体功能和线粒体自噬中发挥关键作用，参与调节细胞内的脂质代谢[37]。PHYH是一种在脂肪酸α氧化中发挥重要作用的过氧化物酶体蛋白[38]。CHCHD10是一种核编码的线粒体蛋白，与电子传递链的末端酶活性、ATP水平以及脂肪的分解代谢相关[39-40]。STX7是SNARE家族成员，SNARE家族参与调节细胞的内吞及分泌作用[41]。LUM是细胞外基质成分，参与肿瘤微环境的胶原形成和细胞增殖信号的传导[42]。RAGC是调节mTORC1信号传导的Rag GTP酶的组成部分[43]。F8编码凝血因子Ⅷ，其参与血液凝固的内在途径，同时在多种肿瘤细胞系和肿瘤组织中高表达[44]。
该研究中下调前10的Hub基因包括MYC、CDH2、EGF、NFKBIA、IL1B、CXCL8、ATF3、DUSP1、ZFP36和MET。
MYC是一种原癌基因，其编码的蛋白质在细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡等细胞功能中发挥作用，在骨髓间充质干细胞中，MYC过表达会促进细胞扩增并影响其分化功能[45]。CDH2可介导白血病细胞与骨髓基质细胞之间的黏附作用，并且敲低CDH2会导致细胞活力和成骨分化能力降低[46-47]。EGF可通过激活β-catenin促进骨髓间充质干细胞增殖，并且参与调节骨髓间充质干细胞的分化[48-49]。NFKBIA基因编码NF-κB抑制剂家族的成员，NF-κB广泛参与生物的生长发育、炎症和免疫反应[50]。IL1B是一种促炎细胞因子，能促进多种肿瘤细胞的增殖和转移[51]。CXCL8是中性粒细胞趋化因子，能够促进肿瘤的存活、生长和迁移[52]。此外，研究表明在急性白血病患者来源骨髓间充质干细胞中，IL1B和IL8的表达降低[53]。ATF3是一种适应性反应基因，参与调节葡萄糖和脂质代谢[54]。DUSP1是细胞增殖、存活的关键参与者[55]。ZFP36是参与信使代谢途径的RNA结合蛋白，能下调多种炎症因子的产生[56]。MET编码受体酪氨酸激酶家族蛋白质的成员，参与多种肿瘤的发生发展[57]。
上述Hub基因广泛参与细胞的增殖、分解代谢、分化和氧化磷酸化相关的细胞功能，这与GSEA分析相符。随后通过体外细胞实验发现，AML-MSC的成脂分化能力增强、成骨分化能力减弱、细胞周期改变并呈现衰老相关表现，其LGALS3表达增加、MYC表达降低，进而证明AML-MSC呈现出细胞周期阻滞和分化功能的改变。
该研究采用条件培养液的培养方式是排除细胞间直接接触的影响，结果显示条件培养液能够诱导HD-MSC表现出与AML-MSC功能相似改变，这表明在体外检测到的骨髓间充质干细胞衰老过程和成脂分化倾向在体内具有可能性。
综上所述，该研究结合生物信息学分析和细胞实验，证明AML-MSC与HD-MSC存在细胞功能和分子表达的差异，并且发现造成这种差异的原因可能是其受到肿瘤微环境中AML细胞的影响，实验结果为研究肿瘤微环境中AML和骨髓间充质干细胞的交互作用提供新的方向。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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文题释义：

Hub基因：是从差异基因合集中筛选出的关键基因，在疾病发生和其他生物学过程中发挥重要的调控作用，因而常作为研究疾病和生物学过程的作用靶点。
急性髓系白血病细胞条件培养液：急性髓系白血病细胞在生长过程中会分泌包含细胞因子在内的多种活性物质于培养基中，收集培养急性髓系白血病细胞的培养基，经离心和过滤处理后得到急性髓系白血病细胞条件培养液。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

急性髓系白血病是最常见的成人急性白血病，其异常克隆能够改变骨髓微环境以利于自身的发生发展。骨髓间充质干细胞是骨髓微环境的重要组成成分，可以分化为多种细胞类型，包括成骨细胞和脂肪细胞等。在急性髓系白血病微环境中，骨髓间充质干细胞的功能会发生改变，参与支持肿瘤细胞的存活和耐药。研究急性髓系白血病对微环境中骨髓间充质干细胞的影响有助于更深入地了解肿瘤的演变进程。目前急性髓系白血病与骨髓间充质干细胞的交互作用的研究仍处于初级阶段，该研究重点解析急性髓系白血病条件培养液作用于骨髓间充质干细胞后的生物学特征，有助于进一步认识两者的交互作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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