1.1 设计 细胞学体外观察实验。以多次传代导致的衰老MSCs为模型，用VEGF和bFGF对衰老细胞进行干预，通过观察细胞形态、细胞增殖、衰老标记物等探讨VEGF和bFGF是否能改善MSCs的复制性衰老。
1.2 时间及地点 实验于2021年10月至2023年4月在河南省中医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 2周龄SD雄性大鼠5只，体质量25-30 g，购自北京维通利华实验动物科技有限公(No.11400700270554)，饲养于河南省中医院(河南中医药大学第二临床医学院)中心实验室，许可证：SYXK(豫)2021-0018，12 h光照，室温(25±2) ℃，湿度(45±10)%，自由饮食。实验方案经河南省中医院动物伦理委员会批准，批准号：PZ-HNSZYY-2020-001。
1.3.2 实验试剂 胎牛血清(Gibco，2305262RP)；低糖DMEM培养基(凯基，20220623)；胰蛋白酶(索莱宝，20220904)；青霉素-链霉素溶液100x(Biosharp，21203590)；CD90抗体(Biolegend，202526)；CD44抗体(Thermo，ACVF0220061)；CD31抗体(美天旎，5210706445)；CD45抗体(美天旎，5210706408，PE)；0.2%茜素红染色液(美伦生物，J1205A)；大鼠骨髓MSCs成脂诱导分化试剂盒(OriCell，RAXMX-90031)；VEGF(Peprotech，1107436 L0612)；bFGF(Peprotech，0314432 C2221)；CCK-8(大连美伦生物，MA0218)；β-半乳糖苷酶活性染色试剂盒(北京索莱宝，20211228)；鬼笔环肽(Proteintech，20010345)；DAPI(中国白鲨，22104336)；0.2% TritonX-100(北京索莱宝，20220621)；吉姆萨染色液(Solarbio，G4640)。
1.3.3 实验仪器 CO2培养箱 (型号：3110 系列)、酶标仪(苏州赛默飞世尔仪器有限公司，FC型)；流式细胞仪(美国BD公司，FACS Jazz)；荧光显微镜(日本 Olympus，CKX41)；超微量核酸蛋白测定仪(中国 Onedrop，OD-2000+)；基因扩增仪(美国BIO-RAD，XBCX-S-25)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠骨髓MSCs的提取和培养 两三周龄SPF级雄性SD大鼠5只，脱颈后乙醇浸泡5 min，分离出股骨和胫骨，彻底清除附着的肌肉和筋膜，PBS清洗3次并移入生物超净台，去除两端骨骺，用5 mL注射器吸取含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，将冲洗物装入培养瓶，放入培养箱，48 h后首次换液，以后每3 d换液1次，待细胞长至融合度为80%-90%时用0.25%含EDTA胰酶消化2 min，按1∶2比例传代。
1.4.2 骨髓MSCs鉴定
(1)细胞表面标志物鉴定：将第2代细胞按5×107 L-1的细胞浓度接种于6孔板(每孔2 mL)，待细胞长至融合度为90%时进行流式鉴定：细胞消化后加入PBS，1 500 r/min离心5 min，清洗2次，分别加入CD90抗体5 μL、CD44抗体10 μL、CD31抗体2.5 μL、CD45抗体5 μL，室温避光孵育30 min，离心后弃上清，PBS清洗2次，再次加入1 mL PBS，流式细胞仪上机检测。
(2)成骨诱导分化：用含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养基配置含10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C和100 nmol/L地塞米松的成骨诱导培养液。第2代细胞按5×107 L-1的细胞浓度接种于12孔板中(每孔1 mL)，待细胞长至融合度为60%时更换为成骨诱导培养液，干预21 d后用0.2%茜素红染色，染色方法：PBS清洗2次后用40 g/L多聚甲醛固定30 min，清洗后每孔加入500 μL染色液，室温孵育5 min，PBS清洗2次，镜下观察。
(3)成脂诱导分化：用大鼠骨髓MSCs成脂诱导分化试剂盒进行诱导。具体如下：6孔板每孔加0.1%明胶，放入CO2培养箱1 h，吸去明胶晾干，将第2代细胞按5×107 L-1的细胞浓度接种于6孔板中(每孔2 mL)，待细胞长至融合度为100%时，吸去培养基并加入2 mL成脂诱导分化培养基A液，诱导3 d，吸去A液并加入2 mL成脂诱导分化培养基B液，维持1 d，吸去B液，换回A液，如此A液和B液交替诱导，直至出现脂滴即可染色。染色方法：PBS清洗后用40 g/L多聚甲醛固定30 min，吸去固定液加入油红O工作液2 mL，孵育30 min，PBS清洗3次，镜下观察。
1.4.3 VEGF联合bFGF对衰老骨髓MSCs增殖的影响 细胞分组：正常组(第2代细胞)、模型组(第7代及以后代数细胞)、VEGF组、bFGF组、VEGF联合bFGF组。96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液(5 000个细胞)，置于培养箱中培养，24 h后正常组、模型组更换为低糖DMEM培养基，干预组更换为含50 μg/L VEGF和10 μg/L bFGF的低糖DMEM培养基，每3 d换1次液，分别在第1，3，5，7，9天用CCK-8法在酶标仪450 nm波长处检测每孔的吸光度值。
1.4.4 VEGF联合bFGF对衰老骨髓MSCs表型的影响 细胞分组：正常组(第2代细胞)、模型组(第7代及以后代数细胞)、VEGF联合bFGF组。将细胞按5×107 L-1的细胞浓度接种到6孔板(每孔2 mL)，24 h后正常组、模型组更换为低糖DMEM培养基，干预组更换为含50 μg/L VEGF和10 μg/L bFGF的低糖DMEM培养基，每3 d换1次液，干预14 d，流式检测细胞表型CD90、CD44、CD31、CD45(流式检测方法同1.4.2)。
1.4.5 β-半乳糖苷酶活性染色 细胞分组：正常组(第2代细胞)、模型组(第7代及以后代数细胞)、VEGF联合bFGF组。将细胞按5×107 L-1的细胞浓度接种到6孔板(每孔2 mL)，24 h后正常组、模型组更换为低糖DMEM培养基，干预组更换为含50 μg/L VEGF和10 μg/L bFGF的低糖DMEM培养基，每3 d换1次液，干预14 d 进行β-半乳糖苷酶活性染色：PBS清洗后加入1 mL β-半乳糖苷酶活性固定液，室温15 min，PBS清洗3次，每孔加入1 mL工作液，保鲜膜封闭6孔板后37 ℃孵育过夜，镜下观察并用Image J分析绿染面积。
1.4.6 鬼笔环肽染色 细胞分组：正常组(第2代细胞)、模型组(第7代及以后代数细胞)、VEGF联合bFGF组。将细胞按5×107 L-1的细胞浓度接种到6孔板(每孔2 mL)，24 h后正常组、模型组更换为低糖DMEM培养基，干预组更换为含50 μg/L VEGF和10 μg/L bFGF的低糖DMEM培养基，每3 d换1次液，干预14 d 进行鬼笔环肽染色：PBS清洗3次后用40 g/L多聚甲醛固定15 min；清洗后用含0.2% TritonX-100 室温透化5 min；PBS清洗3次后加入鬼笔环肽溶液(PBS∶鬼笔环肽母液=40∶1)，室温孵育20 min；PBS清洗2次后每孔加入0.5 mL DAPI染色液，室温孵育5 min；PBS清洗2次，荧光显微镜下观察并用Image J分析F-actin荧光面积和细胞核个数。
1.4.7 快速吉姆萨染色 细胞分组：正常组(第2代细胞)、模型组(第7代及以后代数细胞)、VEGF联合bFGF组。将细胞按5×107 L-1的细胞浓度接种到6孔板(每孔2 mL)，24 h后正常组、模型组更换为低糖DMEM培养基，干预组更换为含50 μg/L VEGF和10 μg/L bFGF的低糖DMEM培养基，每3 d换1次液，干预第9天用吉姆萨染色液染色观察集落形成情况：用PBS洗2次，每孔加入0.5 mL染色液，室温放置2 min；直接滴加1 mL的缓冲液，轻摇6孔板后室温放置6 min；PBS洗2次后镜下观察并统计集落个数。
1.4.8 qRT-PCR 细胞分组：正常组(第2代细胞)、模型组(第7代及以后代数细胞)、VEGF联合bFGF组。将细胞按5×107 L-1的细胞浓度接种到6孔板(每孔2 mL)，24 h后正常组、模型组更换为低糖DMEM培养基，干预组更换为含50 μg/L VEGF和10 μg/L bFGF的低糖DMEM培养基，每3 d换1次液，干预14 d后，采用Trizol法提取总RNA，然后进行RNA反转录：①去基因组DNA反应：去基因组DNA反应体系(模板RNA：总RNA 1 μg，gDNA Purge 1 μL，RNase Free Water至10 μL)轻轻混匀，离心；50 ℃孵育15 min，75 ℃孵育5 min，终止反应。②mRNA荧光定量：反应体系包括2×NovoStart® SYBR High-Sensitivy qPCR SuperMix 10 μL，上游引物终浓度0.5 μmol/L，下游引物终浓度0.5 μmol/L，模板1 μL，RNase Free Water加至总体系为20 μL；程序：预变性95 ℃，5 min；扩增(40 cycles)95 ℃，10 s；60 ℃，10 s；72 ℃，10 s。上机，根据2-ΔΔct计算结果并进行分析。基因引物序列见表1。
1.5 主要观察指标 ①CCK-8法观察细胞增殖情况；②β-半乳糖苷酶活性染色观察细胞衰老情况；③鬼笔环肽染色和吉姆萨染色观察细胞骨架大小及集落形成能力；④qRT-PCR检测衰老相关基因P16、P21和P53表达水平。
1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0对数据进行分析，所有数据以x±s表示，方差齐时组间比较采用单因素方差分析，方差不齐时用秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过河南中医药大学统计学专家审核。
