低强度脉冲超声对大鼠急性肌腱损伤早期血管生成的影响及机制

doi:10.12307/2024.496

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (32): 5097-5103.doi: 10.12307/2024.496

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

低强度脉冲超声对大鼠急性肌腱损伤早期血管生成的影响及机制

刘雪丽1，沈丽1，毕文光1，牟杨1，李森2

1四川卫生康复职业学院康复学院，四川省自贡市 643000；2南京大学医学院附属鼓楼医院脊柱外科，江苏省南京市 210000

收稿日期:2023-08-16 接受日期:2023-09-25 出版日期:2024-11-18 发布日期:2023-12-28
通讯作者: 李森，博士，主任医师，南京大学医学院附属鼓楼医院脊柱外科，江苏省南京市 210000
作者简介:刘雪丽，女，1995年生，四川省自贡市人，汉族，2023年西南医科大学毕业，硕士，初级康复治疗师，主要从事肌肉骨骼康复相关研究。
基金资助:
自贡市卫生健康委员会科研课题(21zd001)，项目负责人：刘雪丽

Effect and mechanism of low intensity pulsed ultrasound on early angiogenesis in rats with acute tendon injury

Liu Xueli1, Shen Li1, Bi Wenguang1, Mou Yang1, Li Sen2

1School of Rehabilitation, Sichuan Vocational College of Health and Rehabilitation, Zigong 643000, Sichuan Province, China; 2Department of Spine Surgery, Nanjing Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medicine School, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China

Received:2023-08-16 Accepted:2023-09-25 Online:2024-11-18 Published:2023-12-28
Contact: Li Sen, MD, Chief physician, Department of Spine Surgery, Nanjing Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medicine School, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China
About author:Liu Xueli, Master, Rehabilitation therapist, School of Rehabilitation, Sichuan Vocational College of Health and Rehabilitation, Zigong 643000, Sichuan Province, China
Supported by:
Research Project of Zigong Municipal Health Commission, No. 21zd001 (to LXL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

低强度脉冲超声：是一种以低强度和脉冲波模式输出的特殊类型的治疗性超声波，一般周期为1 kHz，频率为1-3 MHz，强度在0.02-1 W/cm2。与其他高强度超声相比，低强度脉冲超声降低了热效应对机体带来的危害，将高频声压波和机械应力转变为生物学信号，引起细胞膜通透性的改变，进一步发挥其各种生物学效应。
血管内皮生长因子：又称血管通透因子，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。

背景：越来越多研究表明，低强度脉冲超声可以促进急性肌腱损伤的愈合，但其具体机制尚不清楚。

目的：观察低强度脉冲超声对急性肌腱损伤后早期血管生成的影响，并检测与血管内皮生长因子相关信号通路的调控关系，进而揭示其潜在作用机制。
方法：8-12周龄SPF级雄性SD大鼠局部注射Ⅰ型胶原酶3 d建立急性跟腱损伤动物模型，随机分为超声组和对照组。超声组每日使用有效辐射面积为1 cm2的超声小探头垂直于跟腱部位进行低强度脉冲超声治疗，对照组不干预。治疗2周后进行超声影像学检查，观察肌腱早期愈合情况；治疗1，2周后行苏木精-伊红染色和CD31免疫组织化学染色观察组织血管数量变化，Western blot和qRT-PCR检测跟腱组织中血管内皮生长因子相关信号通路分子的表达。

结果与结论：①灰阶超声显示：超声组较对照组跟腱更为连续，回声强度更低且较为均匀，肌腱厚度明显降低(P < 0.05)；②苏木精-伊红染色和CD31免疫组织化学结果一致显示：治疗2周后，超声组的新生血管数量明显较同期对照组增多(P < 0.05)；③Western blot和qRT-PCR结果显示：治疗2周后超声组跟腱中血管内皮生长因子、Yes相关蛋白、血管生成素2、富含半胱氨酸的血管生成素诱导物61的蛋白和mRNA表达均显著高于对照组(P < 0.05)；④结果表明：低强度脉冲超声通过上调血管内皮生长因子表达显著增加了急性肌腱损伤早期血管生成数量，加速了肌腱愈合。

https://orcid.org/0000-0002-7552-7144(刘雪丽)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 低强度脉冲超声, 急性肌腱损伤, 肌腱愈合, 血管生成, 血管内皮生长因子

Abstract: BACKGROUND: In recent years, increasing studies have shown that low-intensity pulsed ultrasound can promote the healing of acute tendon injuries, but the specific mechanism is still unclear.
OBJECTIVE: To observe the effect of low-intensity pulsed ultrasound on early angiogenesis after acute tendon injury, and to detect the regulatory relationship of low-intensity pulsed ultrasound with vascular endothelial growth factor-related signaling pathways, so as to reveal its potential mechanism of action.
METHODS: Animal models of acute Achilles tendon injury were established using local injection of type I collagenase for 3 days in SPF male Sprague-Dawley rats aged 8-12 weeks, and were then randomly divided into ultrasound group and control group. In the ultrasound group, low-intensity pulsed ultrasound was treated daily with a small ultrasonic probe with an effective radiation area of 1 cm2 perpendicular to the Achilles tendon. No intervention was performed in the control group. Ultrasound imaging examination was performed 2 weeks later to observe the early healing of the tendon. Hematoxylin-eosin staining and CD31 immunohistochemical staining were performed to observe the changes in the number of blood vessels in the tissues after 1 and 2 weeks of treatment. The expression of vascular endothelial growth factor-related signaling pathway molecules in Achilles tendon tissues was detected by western blot or qRT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the Achilles tendon in the ultrasound group was more continuous, the echo intensity was lower and more uniform, and the tendon thickness was significantly reduced (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining and CD31 immunohistochemical staining results showed that after 2 weeks of treatment, the number of new vessels in the ultrasound group was significantly increased compared with the control group (P < 0.05). Western blot and qRT-PCR results showed that after 2 weeks of continuous ultrasound intervention, the protein or mRNA expressions of vascular endothelial growth factor, Yes-associated protein, angiopoietin-2 and cysteine-rich angiogenic inducer 61 in the Achilles tendon of the ultrasound group were significantly higher than those of the control group (P < 0.05). These finding indicate that low-intensity pulsed ultrasound significantly increases the number of blood vessels in the early stage of acute tendon injury and accelerate tendon healing by up-regulating vascular endothelial growth factor expression.

Key words: low-intensity pulsed ultrasound, acute tendon injury, tendon healing, angiogenesis, vascular endothelial growth factor

中图分类号:

刘雪丽, 沈丽, 毕文光, 牟杨, 李森. 低强度脉冲超声对大鼠急性肌腱损伤早期血管生成的影响及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5097-5103.

Liu Xueli, Shen Li, Bi Wenguang, Mou Yang, Li Sen. Effect and mechanism of low intensity pulsed ultrasound on early angiogenesis in rats with acute tendon injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(32): 5097-5103.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验中涉及的大鼠均顺利完成实验周期，无死亡大鼠，所有大鼠进食、饮水、排便、精神状况尚可。超声组及对照组大鼠跟腱注射处均未出现流脓等感染情况。
2.2 超声波检查各组跟腱愈合情况超声干预2周后进行灰阶超声拍摄，结果见图1，观察跟腱组织病灶局部组织图像(白色箭头)：正常组(图1C)跟腱组织较薄，连续性强，回声强度低；超声组(图1B)跟腱组织较对照组(图1A)更为连续，回声强度略低且较为均匀，边界更清晰，肌腱厚度明显降低(P < 0.01)；超声组与正常组相比，差异无显著性意义。

2.3 各组大鼠跟腱组织的病理学变化超声干预1周和2周后，取材大鼠跟腱组织进行苏木精-伊红染色，对各组肌腱修复情况进行了组织学评价，见图2。

正常组肌腱组织(图2C)胶原纤维排列平整紧密，肌腱细胞呈纺锤形并平行于纤维，腱周组织少且几乎无血管，其他各组肌腱组织(图2A，B，D，E)均有不同程度的细胞增多、炎性细胞浸润、胶原纤维排列紊乱和血管分布改变。参照国际Bonar评分量表对血管生成数量进行半定量分析，结果显示：与对照组相比，超声组的新生血管数量较同期增多，其中超声组2的新生血管数量显著高于对照组2，差异有显著性意义(P < 0.05)；而超声组1与对照组1之间差异无显著性意义(P > 0.05，图2F)。
2.4 免疫组织化学检测血管标志物CD31的蛋白表达水平各组大鼠跟腱组织免疫组化结果见图3，血管标记物CD31主要分布于腱周的血管内皮组织，部分分布于腱内外膜和肌腱细胞。正常组跟腱组织(图3C)几乎无CD31的阳性表达，对照组和超声组均表现不同程度的CD31蛋白阳性表达增加。与对照组相比，超声组跟腱组织中CD31阳性表达增加，并随着时间呈上升趋势，可见超声组2新生血管数量增多最为明显。

2.5 Western blot检测大鼠跟腱组织中VEGF、YAP的蛋白表达 Western blot检测结果见图4。与正常组相比，经Ⅰ型胶原酶造模的各组受损肌腱中的VEGF、YAP蛋白表达量均有不同程度的增加。其中，超声组的VEGF蛋白表达量均高于同期对照组，但超声组1与对照组1相比，VEGF蛋白表达量无显著性差异(P > 0.05)，超声组2与对照组2和正常组相比均明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。此外，超声组和对照组随时间均有上升趋势，2周时VEGF蛋白表达水平高于1周时，但差异无显著性意义(P > 0.05)。检测Hippo信号通路中关键效应因子YAP蛋白表达水平发现，超声组2明显高于对照组2，差异有显著性意义(P < 0.05)；超声组1高于对照组1，但差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.6 qRT-PCR检测大鼠跟腱组织中VEGF、YAP、Ang-2、CYR61、HIF-1α的mRNA表达 qRT-PCR检测结果见表2和图5。超声组2的VEGF表达量显著高于对照组2，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明LIPUS连续干预2周后肌腱中VEGF基因表达水平明显升高；超声组1的VEGF表达量高于对照组1，但差异无显著性意义(P > 0.05)。

检测Hippo信号通路中关键效应因子YAP的mRNA表达量，发现造模后所有组的YAP基因表达量相比于正常组均有增加。各组间变化与VEGF表达趋势一致，超声组2的YAP基因表达量显著高于对照组2，差异有显著性意义(P < 0.05)。对YAP下游的Ang-2和CYR61的mRNA表达量进行统计，与同期对照组相比，超声组均有增加，但仅超声组2与对照组2之间差异有显著性意义(P < 0.05)。
对比超声组和对照组自身随时间的变化，结果显示随着肌腱愈合过程，超声组2和对照组2的VEGF、YAP、Ang-2和CYR61的mRNA表达量较超声组1和对照组1均有上升趋势，但差异均无显著性意义(P > 0.05)。
与其他因子mRNA表达量不同的是，LIPUS干预1周后超声组1的HIF-1α mRNA表达量相比于对照组1显著上升，差异有显著性意义(P < 0.05)；然而，LIPUS干预2周后超声组2的HIF-1α mRNA表达量相比于对照组2显著降低，且差异有显著性意义(P < 0.05)；对照组2的HIF-1α mRNA表达量相比于对照组1显著增加(P < 0.05)，而超声组2相比于超声组1显著降低(P < 0.05)。

参考文献

[1] NOURISSAT G, BERENBAUM F, DUPREZ D. Tendon injury: From biology to tendon repair. Nat Rev Rheumatol. 2015;11:223-233.
[2] RIBBANS WJ, SEPTEMBER AV, COLLINS M. Tendon and Ligament Genetics: How Do They Contribute to Disease and Injury? A Narrative Review. Life (Basel). 2022;12(5):663.
[3] SNEDEKER JG, FOOLEN J. Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 2017;63:18-36.
[4] ACKERMAN JE, BEST KT, MUSCAT SN, et al. Metabolic Regulation of Tendon Inflammation and Healing Following Injury. Curr Rheumatol Rep. 2021;23(3):15.
[5] LIU X, ZHU B, LI Y, et al. The Role of Vascular Endothelial Growth Factor in Tendon Healing. Front Physiol. 2021;12:766080.
[6] YING ZM, LIN T, YAN SG. Low-intensity pulsed ultrasound therapy: a potential strategy to stimulate tendon-bone junction healing. J Zhejiang Univ Sci B. 2012;13(12):955-963.
[7] ZHANG N, CHOW SK, LEUNG KS, et al. Ultrasound as a stimulus for musculoskeletal disorders. J Orthop Translat. 2017;9:52-59.
[8] LU H, CHEN C, QU J, et al. Initiation Timing of Low-Intensity Pulsed Ultrasound Stimulation for Tendon-Bone Healing in a Rabbit Model. Am J Sports Med. 2016;44(10):2706-2715.
[9] DE OLIVEIRA PERRUCINI PD, POLI-FREDERICO RC, DE ALMEIDA PIRES-OLIVEIRA DA, et al. Anti-Inflammatory and Healing Effects of Pulsed Ultrasound Therapy on Fibroblasts. Am J Phys Med Rehabil. 2020;99(1):19-25.
[10] LAI WC, IGLESIAS BC, MARK BJ, et al. Low-Intensity Pulsed Ultrasound Augments Tendon, Ligament, and Bone-Soft Tissue Healing in Preclinical Animal Models: A Systematic Review. Arthroscopy. 2021; 37(7):2318-2333.
[11] LI Y, LI W, LIU X, et al. Effects of Low-Intensity Pulsed Ultrasound in Tendon Injuries. J Ultrasound Med. 2023;42(9):1923-1939.
[12] APTE RS, CHEN DS, FERRARA N. VEGF in Signaling and Disease: Beyond Discovery and Development. Cell. 2019;176(6):1248-1264.
[13] AZAD T, JANSE VAN RENSBURG HJ, LIGHTBODY ED, et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nat Commun. 2018;9(1):1061.
[14] BOOPATHY GTK, HONG W. Role of Hippo Pathway-YAP/TAZ Signaling in Angiogenesis. Front Cell Dev Biol. 2019;7:49.
[15] HUANG Y, PAN M, SHU H, et al. Vascular endothelial growth factor enhances tendon-bone healing by activating Yes-associated protein for angiogenesis induction and rotator cuff reconstruction in rats. J Cell Biochem. 2020;121(3):2343-2353.
[16] DELCOMBEL R, JANSSEN L, VASSY R, et al. New prospects in the roles of the C-terminal domains of VEGF-A and their cooperation for ligand binding, cellular signaling and vessels formation. Angiogenesis. 2013;16(2):353-371.
[17] SOLCHAGA LA, BENDELE A, SHAH V, et al. Comparison of the effect of intra-tendon applications of recombinant human platelet-derived growth factor-BB, platelet-rich plasma, steroids in a rat achilles tendon collagenase model. J Orthop Res. 2014;32(1):145-150.
[18] TORRES-SILVA R, LOPES-MARTINS RA, BJORDAL JM, et al. The low level laser therapy (LLLT) operating in 660 nm reduce gene expression of inflammatory mediators in the experimental model of collagenase-induced rat tendinitis. Lasers Med Sci. 2015;30(7):1985-1990.
[19] TSAI YP, CHANG CW, LEE JS, et al. Direct radiofrequency application improves pain and gait in collagenase-induced acute achilles tendon injury. Evid Based Complement Alternat Med. 2013;2013:402692.
[20] UEDA Y, INUI A, MIFUNE Y, et al. Molecular changes to tendons after collagenase-induced acute tendon injury in a senescence-accelerated mouse model. BMC Musculoskelet Disord. 2019;20(1):120.
[21] MAFFULLI N, LONGO UG, FRANCESCHI F, et al. Movin and Bonar scores assess the same characteristics of tendon histology. Clin Orthop Relat Res. 2008;466(7):1605-1611.
[22] LIMA KMME, COSTA JÚNIOR JFS, PEREIRA WCA, et al. Assessment of the mechanical properties of the muscle-tendon unit by supersonic shear wave imaging elastography: a review. Ultrasonography. 2018; 37(1):3-15.
[23] ZABRZYŃSKA M, GRZANKA D, ZIELIŃSKA W, et al. The Bonar Score in the Histopathological Assessment of Tendinopathy and Its Clinical Relevance-A Systematic Review. Medicina (Kaunas). 2021;57(4):367.
[24] KING CM, VARTIVARIAN M. Achilles Tendon Rupture Repair: Simple to Complex. Clin Podiatr Med Surg. 2023;40(1):75-96.
[25] GORICK CM, CHAPPELL JC, PRICE RJ. Applications of Ultrasound to Stimulate Therapeutic Revascularization. Int J Mol Sci. 2019;20(12): 3081.
[26] KORNTNER S, LEHNER C, GEHWOLF R, et al. Limiting angiogenesis to modulate scar formation. Adv Drug Deliv Rev. 2019;146:170-189.
[27] WU F, NERLICH M, DOCHEVA D. Tendon injuries: Basic science and new repair proposals. EFORT Open Rev. 2017;2(7):332-342.
[28] ZHANG F, LIU H, STILE F, et al. Effect of vascular endothelial growth factor on rat Achilles tendon healing. Plast Reconstr Surg. 2003;112(6): 1613-1619.
[29] HALL K, RAN S. Regulation of tumor angiogenesis by the local environment. Front Biosci (Landmark Ed). 2010;15(1):195-212.
[30] COPELAND K, PURVIS AR. A Retrospective Chart Review of Chronic Wound Patients Treated with Topical Oxygen Therapy. Adv Wound Care (New Rochelle). 2017;6(5):143-152.
[31] TEMPFER H, TRAWEGER A. Tendon Vasculature in Health and Disease. Front Physiol. 2015;6:330.
[32] 王增涛,郝丽文,李桂石. Wistar大鼠解剖图谱[M].济南:山东科学技术出版社,2009.
[33] FARCIC TS, BALDAN CS, CATTAPAN CG, et al. Treatment time of ultrasound therapy interferes with the organization of collagen fibers in rat tendons. Braz J Phys Ther. 2013;17(3):263-271.
[34] FARCIC TS, BALDAN CS, MACHADO AFP, et al. Collagen Fibers in the Healing Process of Rat Achilles Tendon Rupture Using Different Times of Ultrasound Therapy. Adv Wound Care (New Rochelle). 2018; 7(4):114-120.
[35] JEREMIAS JÚNIOR SL, CAMANHO GL, BASSIT AC, et al. Low-intensity pulsed ultrasound accelerates healing in rat calcaneus tendon injuries. J Orthop Sports Phys Ther. 2011;41(7):526-531.
[36] PEACH CJ, MIGNONE VW, ARRUDA MA, et al. Molecular Pharmacology of VEGF-A Isoforms: Binding and Signalling at VEGFR2. Int J Mol Sci. 2018;19(4):1264.
[37] LAI F, WANG J, TANG H, et al. VEGF promotes tendon regeneration of aged rats by inhibiting adipogenic differentiation of tendon stem/progenitor cells and promoting vascularization. FASEB J. 2022;36(8): e22433.
[38] WU JB, TANG YL, LIANG XH. Targeting VEGF pathway to normalize the vasculature: an emerging insight in cancer therapy. Onco Targets Ther. 2018;11:6901-6909.
[39] BUDEL SJ, PENNING MM, PENNING LC. Hippo signaling pathway in companion animal diseases, an under investigated signaling cascade. Vet Q. 2021;41(1):172-180.
[40] DEY A, VARELAS X, GUAN KL. Targeting the Hippo pathway in cancer, fibrosis, wound healing and regenerative medicine. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(7):480-494.
[41] WU Z, GUAN KL. Hippo Signaling in Embryogenesis and Development. Trends Biochem Sci. 2021;46(1):51-63.

引言

肌腱损伤是运动系统的常见病、多发病，常发生于运动员及日常运动较少的中年人群。急性肌腱损伤多是由于创伤或过度使用所诱发，主要表现为局部疼痛、压痛、肿胀并且活动时疼痛加剧，好发于体内高负荷需求的肌腱，如跟腱、髌腱、肩袖以及肱骨外上髁伸肌腱等，占运动损伤性疾病的30%-50%[1-2]。
目前人们对肌腱损伤疾病的认识仍较为局限。文献表明，肌腱是一个相对缺乏血供的组织，其血供主要依靠滑液扩散，导致肌腱损伤后的自我修复困难，甚至严重影响患者损伤部位的生理功能[3-5]。因此，促进肌腱损伤早期血管生成是提高肌腱损伤修复效果的重要途径。
治疗性超声波疗法是近年来备受关注的一项医疗技术，其中低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)作为一种简便、安全、经济的物理因子治疗方法，可通过皮肤将高频声压波和机械应力传递到生物组织中[4，6]，有部分研究资料表明LIPUS可加速肌腱损伤愈合，提高肌腱力学性能[7-11]，但其具体机制尚不清楚。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管生成过程中的关键生长因子，可刺激血管内皮细胞和血管侵入跟腱内，对血管形成起着重要的调控作用，与肌腱愈合有着密切的关系[5，12]。VEGF可特异性诱导受体VEGFR2的磷酸化，通过激活胞内酪氨酸激酶进而启动下游细胞信号级联，对下游参与调控新生血管形成的Hippo/ Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)信号通路进行调控[13-15]。
基于此，该研究探索了LIPUS对肌腱血管生成的作用，并检测其与VEGF相关信号通路的调控关系，进而揭示LIPUS促进急性肌腱损伤早期血管生成的潜在作用机制，从而为临床治疗急性肌腱损伤提供一定的实验基础和理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2021年9月至2023年1月在西南医科大学动物实验中心和中西医结合实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 8-12周龄的雄性SPF级SD大鼠60只，体质量(250±30) g，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2018-17；实验动物使用许可证号：SYXK(川)2018-065，在实验动物中心屏障系统环境中进行统一标准普通饲养并开展动物实验操作，实验前所有动物均适应性喂养1周。
实验方案经西南医科大学动物实验福利伦理委员会审查，批准号为sumu20220057。
1.3.2 主要实验试剂和仪器 Ⅰ型胶原酶(Sigma-Aldrich)；抗CD31抗体(Affinity Biosciences)；VEGF抗体(Abcam)；YAP1抗体(Abcam)；GAPDH抗体(Affinity Biosciences)；超纯RNA提取试剂盒(康为世纪)；正置显微镜(Leica)；低强度脉冲超声(Sonicator740双频超声波治疗仪，美国)；酶标仪(伯腾)；荧光定量PCR仪(Roche)；Veriti PCR仪(ABI)。
1.4 方法

1.4.1 造模方法从60只SD大鼠中随机抽取48只进行右侧跟腱损伤造模。使用2%戊巴比妥钠(2 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，去毛、常规碘伏消毒右侧跟腱及周围区域。将大鼠踝关节屈曲90°，定位跟腱骨性连接点，用50 μL微量注射器 (30 G注射针头)在跟骨上方斜刺约60°进针进入跟腱内，针头刺进跟腱后平行于跟腱走向缓慢进针约8 mm，将30 μL (10 mg/mL)PBS配制的Ⅰ型胶原酶缓慢注射入右侧跟腱内，注射时缓慢退针，左侧跟腱不作处理。此后放回笼内自由活动，正常饲养。

1.4.2 模型评价造模3 d后，通过超声波影像学检查，可观察到跟腱回声强度改变及跟腱厚度增加即视为造模成功。
1.4.3 实验分组将完成造模的48只大鼠根据时间点和是否进行超声治疗随机分为4组：对照组1、超声组1、对照组2、超声组2，每组12只。其中，超声组1、超声组2在造模成功后早期(胶原酶注射后3 d)分别给予LIPUS干预1，2周；对照组1、对照组2大鼠未进行LIPUS干预，分别于超声干预后1，2周取材。剩余12只大鼠作为正常组不予以造模，不进行任何处理。
1.4.4 LIPUS干预对超声组1和超声组2的大鼠造模跟腱进行LIPUS干预。
LIPUS的具体操作方法：使用大鼠固定器固定大鼠，暴露病变跟腱，右下肢跟腱及附近除毛，于病变跟腱处涂抹超声耦合剂，踝关节屈曲呈90°，使用有效辐射面积(ERA)为1 cm2的超声小探头垂直于大鼠跟腱部位进行LIPUS治疗。LIPUS参数设置：频率为3 MHz，占空比为20%，SATA强度为500 mW/cm2，LIPUS治疗1次/d，5 min/次，并确保每日超声时间固定。
1.4.5 标本采集在干预1，2周后，各组大鼠注射过量2%戊巴比妥钠进行安乐死，备皮消毒，用解剖刀和镊子掀开跟腱上方皮肤，暴露出病变跟腱部位，随后用解剖剪快速剥离、分离跟腱组织(跟骨近端1 mm至肌腱-肌肉结合部)，轻柔去除多余肌肉组织，生理盐水洗涤后用吸水纸擦干多余水分，用于病理观察的跟腱组织直接放入多聚甲醛溶液中进行固定，用于Western blot或RT-PCR的跟腱组织直接放入液氮1 h后于-80 ℃冰箱冻存。
1.5 主要观察指标
1.5.1 超声波检查 LIPUS干预2周后分别对正常组、对照组2和超声组2大鼠进行灰阶超声波检查。腹腔注射2%戊巴比妥钠(2 mL/kg)进行麻醉后，大鼠俯卧位，下肢除毛，跟腱局部涂抹医用耦合剂，使用超声拍摄系统对病变跟腱组织形态进行探查，检测病灶组织的回声强度和肌腱厚度等，采集超声图像并分析。
1.5.2 苏木精-伊红染色观察跟腱的病理变化将在多聚甲醛溶液中的跟腱组织固定48 h后，进行石蜡包埋、切片(厚度4 μm)、烤片、脱蜡水化、常规苏木精-伊红染色、乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，在显微镜下观察各组跟腱的组织学形态，并参照国际Bonar评分量表对血管生成数量进行半定量分析[21]。
1.5.3 免疫组织化学染色检测大鼠跟腱组织中CD31的蛋白表达将上述石蜡包埋大鼠跟腱组织经切片、烤片、脱蜡水化后，使用柠檬酸三钠抗原修复溶液进行抗原修复，随后进行常规免疫组织化学染色[一抗：CD31(1∶400)]，经乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固后，显微镜下观察，采集图像并分析。
1.5.4 Western blot检测大鼠跟腱组织中VEGF、YAP的蛋白表达将跟腱组织从-80 ℃冰箱取出，加入适量RIPA裂解液+PMSF混悬液(比例100∶1)，用眼科剪于冰上剪碎混匀组织。使用超声波细胞破碎仪冰上低温超声破碎组织，离心后取上清液，BCA测量蛋白浓度，制备蛋白样品，进行常规Western blot操作[配胶、上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育(VEGF，1∶1 000；YAP，1∶5 000；GAPDH，1∶1 000)、二抗孵育]，通过ECL化学发光成像系统显影，使用Image J测量灰度值，检测各组跟腱组织中VEGF、YAP蛋白的表达。

1.5.5 实时荧光定量PCR检测大鼠跟腱组织中VEGF、YAP、血管生成素 2(angiopoietin-2，Ang-2)、富含半胱氨酸的血管生成素诱导物 61(cysteine-rich angiogenic inducer 61，CYR61)、缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的mRNA表达将跟腱组织从-80 ℃冰箱取出，按每1 mg组织中加入10 μL Trizol，置于冰上用眼科剪剪碎组织，然后将匀浆样品在室温静置5 min，向EP管中加入200 μL氯仿并剧烈振荡15 s，室温静置3 min，离心后转移上层水相溶液，加入等体积的体积分数70%乙醇，上下颠倒混匀后全部转入吸附柱中；经去蛋白液、漂洗液反复多次离心纯化RNA，晾干以去除残余乙醇；加入30 μL无酶水，2 min后离心，得到跟腱组织总RNA溶液。RT-PCR引物序列见表1。使用Nanodrop 2000分光分度计对总RNA浓度进行测定。将提取的组织RNA反转录为cDNA，进行SYBR Green RT-PCR实验，扩增反应完成后，结果采用相对定量法2-ΔΔCt进行计算分析。

1.6 统计学分析所有数据以x±s表示，采用GraphPad Prism 9 统计软件分析，单因素方差分析(one-way ANOVA)用于比较两组以上组间差异，P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经西南医科大学生物统计学专家审核。

讨论

肌腱是一种组成复杂的组织，连接肌肉和骨骼，是肌肉骨骼系统中传递力量的重要器官，因承受着较大的机械负荷而容易受到损伤，是目前运动医学所面临的主要伤病之一[22-23]。目前，急性肌腱损伤的治疗以经验性居多，主要包括手术治疗和非手术治疗。非手术治疗包括运动疗法、物理因子疗法(包括低强度脉冲超声波、体外冲击波和低水平激光治疗等)、抗炎药物治疗、富血小板血浆注射治疗和自体生长因子注射疗法等[24]。其中，LIPUS是一种简便、安全、经济的物理因子治疗方法，近年来研究证实，LIPUS可以促进急性肌腱损伤的愈合，提高肌腱力学性能[7-9]，但其具体机制并不清楚。有研究表明LIPUS应用早期诱导了血管生成，促进新生血管快速长入肌腱内，加速了血管网的形成，但其具体作用及机制尚不清楚[25]。
按照肌腱愈合过程来分，需经历3个依次重叠的阶段：炎症阶段、增殖阶段和重塑阶段[5，26-27]。在炎症阶段(通常持续数天)，伤口部位被红细胞、白细胞和血小板浸润，形成纤维蛋白凝块以提供暂时的硬度，巨噬细胞消化坏死碎片，肌腱细胞被募集到受伤区域并刺激增殖，然后通过释放促进因子刺激血管生成，促进后期形成毛细血管网。
按照愈合方式来看，整个肌腱修复由来自肌腱本身的固有肌腱细胞和外部周围成纤维细胞共同完成。内源性愈合发生在肌腱内，主要来自肌腱细胞的活动和肌腱内的血液供应；外源性愈合来自成纤维细胞、血浆、炎性细胞的长入和肌腱外血管侵袭，受到来自肌腱外部的物质的调节[28]。
由此可见，早期新生血管的形成是肌腱愈合过程中重要的生理过程。新血管的形成可促使成纤维细胞和炎症细胞运送到伤口部位，帮助输送肌腱愈合必需的氧气和营养物质，清除代谢废物，运输调节因子及控制免疫反应[12，29]。肌腱修复中胶原合成是一个高度氧依赖性过程，提示重建血管网对氧气输送至修复部位的重要性[30]。然而，正常肌腱本身是缺少血管的组织，导致肌腱损伤后细胞代谢率低，自我愈合能力差，肌腱再生潜力受限[3，31]。
该研究采用跟腱内Ⅰ型胶原酶注射的方法，构建了急性跟腱损伤动物模型，结合大鼠跟腱的解剖结构[32]，并参考相关文献[16-20]，确定了具体注射操作方法和用量，该模型操作简单便捷且重复性较好。该研究应用LIPUS对急性跟腱损伤大鼠进行早期干预，根据低强度脉冲的特征和跟腱距皮肤的厚度，并参考了以往相关文献，确定了LIPUS的具体参数[33-35]。
实验结果表明，LIPUS干预2周后，与未进行超声治疗的对照组相比，超声组跟腱更为连续，回声强度较低且更为均匀，边界更为清晰，且肌腱厚度明显降低。实验结果表明LIPUS的早期应用减轻了急性损伤肌腱的肿胀程度，加速了肌腱的早期愈合。
此外，分别在LIPUS连续干预1，2周后通过苏木精-伊红染色、血管标志物CD31免疫组织化学染色等技术检测肌腱内血管数量和密度，结果一致显示：与对照组相比，超声组跟腱组织中新生血管数量增加，并随着时间呈上升趋势，尤其连续干预2周的超声组血管数量最为丰富，具有显著性差异。而对照组虽然没有进行LIPUS干预，但肌腱内血管随着时间仍然有上升趋势，说明肌腱损伤后存在一定的自我愈合能力，而LIPUS可加速肌腱愈合过程。上述研究结果表明，在急性肌腱损伤早期利用LIPUS连续干预2周促进了肌腱愈合早期的新生血管生成。
为进一步明确LIPUS的具体作用机制，对血管相关通路进行了研究。在调节血管方面，大量血管生成刺激因子如生长因子、整合素和生物活性脂质起着调控作用，其中VEGF是调控新生血管形成的最主要的血管通透因子，肌腱中VEGF表达上调在新生血管形成和肌腱修复过程中起着重要的作用[36-37]。在缺氧应激下，VEGF由HIF-1α和HIF-1α异二聚体激活，可在体内诱导血管生成[38]。而Hippo信号通路是VEGF下游重要的调控新生血管形成的信号通路，其中YAP是Hippo信号通路的关键效应因子，YAP磷酸化水平可以影响YAP蛋白在细胞中的分布，进而调控下游目的基因的转录激活以及改变内皮细胞血管生成[39-41]。
该实验通过Western blot和qRT-PCR检测发现，在肌腱损伤早期，超声组和对照组肌腱内VEGF、YAP的蛋白和mRNA表达量均随时间逐渐上升；与对照组相比，经LIPUS干预的超声组表现出更明显的上升趋势，超声组2的VEGF和YAP蛋白表达水平均显著高于对照组2，而超声组1与对照组1相比无显著性差异。该结果提示LIPUS显著上调VEGF的基因和蛋白表达，并激活了Hippo信号通路中关键效应因子YAP，且对比各组随时间的具体变化趋势，发现该趋势与苏木精-伊红染色半定量评价和CD31免疫组化反应的血管数量变化一致，再次表明VEGF和YAP参与了肌腱修复过程中血管生成，并且呈现正向调控，提示LIPUS促进了该信号通路的调控，且连续干预2周时对血管生成的效果最为明显。
此外，通过qRT-PCR还检测Hippo下游相关因子，发现超声组2中的Ang-2和CYR61基因表达水平较同期对照组均有明显上升，且具有显著差异，说明LIPUS对Hippo信号通路具有调控作用。缺氧是导致VEGF上调的最重要因素之一，HIF-1α上调是缺氧的重要体现。该实验中发现HIF-1α的mRNA表达与VEGF和Hippo信号通路中的因子变化不同，超声组1的HIF-1α mRNA表达量相比于对照组1显著上升，而超声组2的HIF-1α mRNA表达量相比于对照组2显著降低。该结果可能反映了1周的超声干预通过上调HIF-1α引起了VEGF的上调，而随着VEGF的增多，形成的新生血管为肌腱带来了更多的氧气和营养物质，进而改善了缺氧的状态，故2周时超声干预的跟腱组织中HIF-1α降低。
综上所述，LIPUS促进了大鼠急性肌腱损伤早期新生血管形成，对肌腱愈合具有一定的治疗作用，该机制可能与LIPUS上调VEGF，激活Hippo通路中的关键效应因子YAP蛋白，并促进其下游Ang-2和CYR61的表达有关。然而，该研究仍存在许多问题和不足之处：首先，动物实验采用Ⅰ型胶原酶注射诱导急性肌腱损伤模型，但是这种模型不能完全模拟急性肌腱损伤的自然发病过程；其次，体内研究了肌腱损伤早期的血管生成情况，未能反映2周后长期的愈合状态以及后续血管数量及相关分子的改变；最后，实验未利用抑制剂或敲低干扰等技术手段，进一步验证LIPUS上调VEGF激活Hippo/YAP通路的具体调控机制，该调控关系仍需进一步证实和深入研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

低强度脉冲超声对大鼠急性肌腱损伤早期血管生成的影响及机制

Effect and mechanism of low intensity pulsed ultrasound on early angiogenesis in rats with acute tendon injury

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[1]	杨玉芳, 杨芷姗, 段棉棉, 刘毅恒, 唐正龙, 王宇. 促红细胞生成素在骨组织工程中的应用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1443-1449.
[2]	张娅, 牟秋菊, 王自林, 刘宏杰, 祝丽丽. 负载富血小板血浆的水凝胶促进糖尿病大鼠创面愈合[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 690-696.
[3]	王业元, 杜易朗, 于德浩, 宁凤婷, 白冰. 微弧氧化处理对医用金属生物活性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 771-776.
[4]	王嘉旎, 陈俊宇. 金属离子促血管生成机制及在骨组织工程中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 804-812.
[5]	买斯吐热木·黑力力, 张婉霞, 尼加提·努尔穆罕默德, 买买提吐逊·吐尔地. 关节腔注射医用臭氧对早期颞下颌骨关节炎模型大鼠髁突组织学的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 505-509.
[6]	杨雨晴, 陈志宇. 早期短暂M1巨噬细胞在骨组织工程中的作用及应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 594-601.
[7]	熊洋, 周世博, 俞兴, 毕连涌, 杨济洲, 王逢贤, 曲弋, 杨永栋, 赵丁岩, 赵赫, 仇子叶, 姜国正. 获得性异位骨化的分子生物学机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(30): 4881-4888.
[8]	李斯锦, 冯骁腾, 王怡茹, 刘萍. 巨噬细胞特异性启动子SP146-C1增强血管内皮生长因子C在动脉粥样硬化小鼠中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4202-4208.
[9]	董心雨, 董馨月, 王婉婷, 范海霞, 程焕芝. 中药有效成分结合支架材料促进骨组织再生[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3240-3245.
[10]	汪饶开卷, 赵立星. 去铁胺在骨组织再生中的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3272-3280.
[11]	方源, 康志杰, 王海燕, 李筱贺, 张凯. 骨组织工程中促血管支架应用的可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(17): 2708-2715.
[12]	高丽, 刘浏, 任文燕, 刘雪, 王一宇. 石墨烯及其衍生物对血管生成和血管化骨的影响机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(17): 2716-2722.
[13]	郭宇昕, 王浩, 李明奇, 陈粤瑛, 潘桔红, 黄鑫, 王治文, 周青. 超声优化水凝胶支架用于促进金纳米粒子的经皮递送[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(15): 2330-2337.
[14]	钟思扬, 廖晴, 周星宇, 李先楹, 卫晶晶, 杨琳. 骨微环境对组织工程骨再生过程的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(15): 2452-2460.
[15]	潘成镇, 陈锋, 林宗汉, 莫坚, 张驰, 韦沅汛, 韦宗波. 萜类中药单体调控核转录因子κB信号通路防治骨质疏松症的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(14): 2234-2241.