长期传代培养对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

doi:10.12307/2024.702

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (31): 4926-4930.doi: 10.12307/2024.702

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长期传代培养对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

赵文静，刘百坤，李秋莲，陈曦

吉林省肝胆病医院，吉林省长春市 130062

收稿日期:2023-07-21 接受日期:2023-09-28 出版日期:2024-11-08 发布日期:2024-01-22
通讯作者: 陈曦，主任医师，吉林省肝胆病医院，吉林省长春市 130062
作者简介:赵文静，女，1973年生，吉林省吉林市人，汉族，2009年吉林大学毕业，博士，主任技师，主要从事间充质干细胞衰老研究。
基金资助:
吉林省卫生健康科技能力提升项目(2020J082)，项目参与人：赵文静；吉林省卫生健康科技能力提升项目(2022JC072)，项目参与人：赵文静

Effects of long-term subculture on biological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells

Zhao Wenjing, Liu Baikun, Li Qiulian, Chen Xi

Hepatobiliary Hospital of Jilin, Changchun 130062, Jilin Province, China

Received:2023-07-21 Accepted:2023-09-28 Online:2024-11-08 Published:2024-01-22
Contact: Chen Xi, Chief physician, Hepatobiliary Hospital of Jilin, Changchun 130062, Jilin Province, China
About author:Zhao Wenjing, MD, Chief technician, Hepatobiliary Hospital of Jilin, Changchun 130062, Jilin Province, China
Supported by:
Jilin Province Health Technology Capability Enhancement Project, No. 2020J082 (to ZWJ); Jilin Province Health Technology Capability Enhancement Project, No. 2022JC072 (to ZWJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

细胞衰老：2019年国际细胞衰老协会将细胞衰老定义为由应激性损伤和某些生理过程触发的一种细胞状态，其特征是长期且通常不可逆的细胞周期停滞，伴随分泌特征、大分子损伤和新陈代谢改变。
β-半乳糖苷酶：是一种水解酶，可催化衰老细胞中β-半乳糖苷水解为单糖，形成蓝色产物，是细胞衰老的生物标志物。

背景：人骨髓间充质干细胞体外长期传代培养后是否能保持其生物学特性、能量代谢方式和多向分化潜能等仍存在争议，有待于进一步全面系统研究。

目的：观察体外长期传代培养对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。
方法：人骨髓间充质干细胞体外培养至第5，10，15代，MTT法检测细胞增殖能力，流式细胞仪检测细胞周期；成脂、成骨、成软骨诱导分化检测细胞多向分化潜能；划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力；能量代谢分析仪检测细胞线粒体氧化磷酸化和糖酵解能力；β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况；Western blot检测细胞衰老标记蛋白p21、p16、p53表达。

结果与结论：第5，10，15代骨髓间充质干细胞均呈贴壁生长，第15代细胞体积增大，增殖能力降低，S期细胞百分比减少(P < 0.05)；随着传代次数的增加，细胞划痕愈合和侵袭能力逐渐减弱(P < 0.05)，成脂、成骨和成软骨分化潜能未见显著性差异，细胞线粒体氧化磷酸化和糖酵解能力逐渐降低(P < 0.05)。随着传代次数的增加，β-半乳糖苷酶染色阳性细胞增多(P < 0.05)，衰老标记蛋白p21、p16、p53表达逐渐增加(P < 0.05)。结果表明：长期传代培养的骨髓间充质干细胞的生物学特性发生变化，第10代以后骨髓间充质干细胞可能由于衰老导致活性降低。采用第10代以内的骨髓间充质干细胞更适合于临床研究/治疗。

https://orcid.org/0000-0002-0841-9362 (赵文静)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓间充质干细胞, 传代, 长期培养, 能量代谢, 衰老

Abstract: BACKGROUND: There is still controversy whether human bone marrow mesenchymal stem cells can maintain their biological characteristics, energy metabolism patterns, and multidirectional differentiation potential after long-term expression in vitro. Further comprehensive and systematic research is needed.
OBJECTIVE: To evaluate the effects of long-term expansion in vitro on the biological characteristics of mesenchymal stem cells.
METHODS: Human bone marrow mesenchymal stem cells cultured to passage 5, 10, and 15 in vitro. MTT assay was used to detect cell proliferation ability. Flow cytometry was used to detect cell cycle. The multi-differentiation potential of mesenchymal stem cells was detected by inducing to adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation. Cell migration and invasion abilities were detected by scratch test and Transwell assay. The mitochondrial oxidative phosphorylation and glycolysis function were analyzed using energy metabolism analyzer. The cell senescence was detected by senescence-associated β-galactosidase staining. The expression levels of p21, p16, and p53 proteins were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells at passages 5, 10, and 15 grew adherently; the volume of passage 15 mesenchymal stem cells increased and its proliferation ability decreased; the percentage of S-phase cells decreased (P < 0.05). With the increase of culture passages, the migration and invasion abilities decreased gradually (P < 0.05). There was no significant difference in the differentiation potential, demonstrated by adipogenic, osteogenic and chondrogenesis induction. The ability of oxidative phosphorylation of mitochondria and glycolysis decreased gradually (P < 0.05). The number of senescence-associated β-galactosidase-positive cells increased with the increase of passages (P < 0.05), and the expression of senescence protein p21, p16, and p53 increased gradually (P < 0.05). The results indicated that the biological characterization of mesenchymal stem cells changed after long-term in vitro expansion. Mesenchymal stem cells cultured over 10 passages may have a reduced activity due to increasing senescence. Therefore, bone marrow mesenchymal stem cells cultured less than 10 passages are suitable for clinical research/therapy.

Key words: bone marrow mesenchymal stem cell, passage, long-term culture, energy metabolism, senescence

中图分类号:

赵文静, 刘百坤, 李秋莲, 陈曦. 长期传代培养对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 4926-4930.

Zhao Wenjing, Liu Baikun, Li Qiulian, Chen Xi. Effects of long-term subculture on biological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(31): 4926-4930.

图/表（结果） 7

2.1 骨髓间充质干细胞形态学变化第5，10，15代骨髓间充质干细胞均贴壁生长，第5代细胞表面光滑，呈纺锤形旋涡状生长，类似于成纤维细胞，见图1A；第10代细胞形态和排列方式与第5代基本相同，但局部细胞胞体增大，呈多边形，见图1B；第15代细胞体积增大，边界模糊，细胞呈扁平状或煎蛋状，排列紊乱，见图1C。

2.2 骨髓间充质干细胞增殖能力第5，10代骨髓间充质干细胞的生长曲线大体呈拉伸的“S”形。接种第1，2天为细胞生长潜伏期，第3-6天细胞增殖明显，第7天细胞生长变慢进入平台期。第15代骨髓间充质干细胞的增殖能力明显低于第5，10代。细胞周期检测结果显示，S期细胞比例从(12.58±1.62)%(第5代)减少到(11.02±1.74)% (第10代)和(5.53±1.12)% (第15代)，各代次S期细胞比例差异有显著性意义(P < 0.05)；G1期细胞比例从(79.24±3.18)%(第5代)增加到(84.32±6.25)% (第10代)和(87.69±5.62)% (第15代)，第15代G1期细胞增加，但各代次G1期细胞比例差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2。

2.3 骨髓间充质干细胞多向分化潜能成脂诱导分化后油红O染色结果显示，第5，10，15代细胞阳性率分别为(40.8±2.0)%，(38.7±2.7)%和(34.5±1.9)%，差异无显著性意义(P > 0.05)；成骨诱导分化后碱性磷酸酶染色结果显示，第5，10，15代细胞阳性率分别为(94.1±5.3)%，(83.4±7.3)%和(82.4±8.7)%，差异无显著性意义(P > 0.05)；成软骨诱导分化后番红O染色结果显示，第5，10，15代细胞阳性率分别为(94.3±5.5)%，(86.2±8.8)%和(84.5±9.5)%，差异无显著性意义(P > 0.05)；与第5，10代比较，第15代骨髓间充质干细胞诱导分化后细胞密度低，细胞间距较大，见图3。

2.4 骨髓间充质干细胞迁移和侵袭能力划痕实验结果显示，24 h后，第5，10，15代细胞划痕愈合率分别为(71.7±2.7)%，(56.4±3.4)%和(26.8±2.7)%，与第5代比较，第10，15代细胞划痕愈合率明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；Transwell 侵袭实验结果显示，第5，10，15代细胞穿过基质胶到达小室底层膜的数量分别为182.3±18.9，117.3±9.0和19.2±5.0，与第5代比较，第10，15代细胞到达小室底层膜的数量明显减少，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.5 骨髓间充质干细胞线粒体氧化磷酸化和糖酵解能力细胞耗氧率代表细胞线粒体氧化磷酸化能力，与第5，10代比较，第15代细胞基础有氧呼吸能力、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸储备和ATP产生量均明显降低(P < 0.05)，见图5；细胞外酸化率代表细胞糖酵解能力，第5，10代比较，第15代细胞糖酵解和糖酵解容量显著降低(P < 0.05)，但第5，10，15代细胞的糖酵解储备差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6。

2.6 长期传代培养对骨髓间充质干细胞衰老的影响 β-半乳糖苷酶染色结果显示，第15代细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率为(58.4±4.5)%，与第5代(4.2±1.7)%和第10代(19.4±3.3)%比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。Western blot检测结果显示，第5代细胞p53蛋白的相对表达量为0.39±0.04，与第10代(0.80±0.05)和第15代(1.01±0.09)比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；第5代细胞p21蛋白的相对表达量为0.43±0.08，与第10代(1.06±0.16)和第15代(1.33±0.36)比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；第5代细胞p16蛋白的相对表达量为0.29±0.05，与第10代(0.90±0.04)和第15代(0.99±0.06)比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。见图7。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，实验数据采用方差分析与 t 检验。
1.2 时间及地点实验于2019年9月至2022年12月在吉林省肝胆病医院中心实验室完成。
1.3 材料人骨髓间充质干细胞(第2代)购自赛业生物科技有限公司，货号：HUXMA-01001；低糖DMEM培养基(美国Hyclone)；胎牛血清(Gibco)；能量分析专用培养基(美国Seahorse Bioscience公司)；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒和细胞胞浆蛋白提取试剂盒(江苏碧云天生物技术有限公司)；鼠抗人p21、p16、p53、β-actin单克隆抗体(美国Santa Cruz 公司)；线粒体压力和糖酵解压力检测试剂盒(美国Seahorse Bioscience公司)；成脂、成骨、成软骨诱导分化培养基(广州赛业生物科技有限公司)；CO2培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 骨髓间充质干细胞的传代培养第2代骨髓间充质干细胞解冻后，接种于含体积分数10%胎牛血清、青链霉素的低糖DMEM培养基中培养，待细胞生长融合达到80%-90%，用0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶3比例传代，每3-5 d传代1次。
1.4.2 骨髓间充质干细胞的体外增殖能力第5，10，15代骨髓间充质干细胞接种于 96 孔板(4×103个/孔)，连续培养7 d。每天同一时间点每孔加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h，酶标仪检测490 nm波长吸光度值，以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
1.4.3 流式细胞仪检测细胞周期严格按照说明书操作，收集第5，10，15代骨髓间充质干细胞，加入1 mL 体积分数70%冰乙醇-20 ℃固定24 h，1 500 r/min离心5 min，收集细胞，加入500 μL PI/RNase A 染色工作液，室温避光30 min，过滤后流式细胞仪检测细胞周期，实验重复3次。
1.4.4 骨髓间充质干细胞三系分化潜能评估第5，10，15代骨髓间充质干细胞接种于6孔培养板(2×105个/孔)，细胞生长至70%融合时更换为成脂、成骨和成软骨诱导分化培养基，体外培养21 d。油红O染色鉴定脂肪细胞，碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞，番红O染色鉴定成软骨细胞。显微镜下观察细胞染色情况，高倍镜下随机挑选5个视野，计数染色阳性细胞数，计算阳性细胞率。实验重复3次。
1.4.5 划痕实验检测细胞迁移能力第5，10，15代骨髓间充质干细胞接种于6孔板中(1×106个/孔)，细胞生长至100%融合时，用200 μL枪头在6孔板中垂直划痕，PBS洗去漂浮细胞团块，更换含体积分数1%胎牛血清的低糖DMEM培养基，24 h后观察划痕愈合情况。使用Image J软件测量划痕宽度，计算划痕愈合率。划痕愈合率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。实验重复3次。
1.4.6 侵袭实验检测细胞侵袭能力将150 μL第5，10，15代骨髓间充质干细胞悬液(含1×105个细胞)接种于Transwell小室上室中，下室加入含体积分数20%胎牛血清的低糖DMEM培养基，24 h后取出小室，用体积分数4%中性甲醛固定，0.1%结晶紫染色，显微镜下观察小室下层膜细胞数量。随机选取5个视野拍照，使用Image J软件计数Transwell小室下层膜细胞数。实验重复3次。
1.4.7 骨髓间充质干细胞线粒体氧化磷酸化和糖酵解检测细胞耗氧率(cellular oxygen consumption rate，OCR)和细胞外酸化率(extracellular acidification rate，ECAR)评价细胞线粒体氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)和糖酵解能力。第5，10，15代骨髓间充质干细胞接种于Seahorse XFp专用板(1×104个/孔)，培养24 h后更换能量分析专用培养基，按照线粒体压力测定试剂盒说明书配制试剂，能量代谢分析仪检测细胞耗氧率，并根据细胞耗氧率分析基础有氧呼吸能力、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸储备能力和ATP产生量；按照糖酵解测定试剂盒说明书配制试剂，能量代谢分析仪检测细胞外酸化率，并根据细胞外酸化率分析糖酵解、糖酵解容量和糖酵解储备。实验重复3次。
1.4.8 β-半乳糖苷酶活性检测第5，10，15代骨髓间充质干细胞接种于6孔板(2×105个/孔)，细胞生长至80%融合时，β-半乳糖苷酶染色固定液固定15 min，按照β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书配置染色液，每孔加入2 mL染色液，于37 ℃、无CO2环境中孵育过夜，显微镜下观察细胞染色情况，随机选取5个视野，计算阳性细胞率。实验重复3次。
1.4.9 Western blot法检测细胞p21、p16、p53蛋白表达提取第5，10，15代骨髓间充质干细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳后，蛋白转移到PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭4 h，用p21、p16、p53、β-actin一抗(1∶500-1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，结合辣根过氧化物酶标记二抗(1∶5 000稀释)，ECL化学发光法检测蛋白的表达，使用Image J 软件分析其灰度值，以β-actin为内参蛋白，采用目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值表示p21、p16、p53的相对表达水平。实验重复3次。
1.5 主要观察指标 ①各代骨髓间充质干细胞的形态和生长增殖能力；②各代骨髓间充质干细胞的细胞周期；③各代骨髓间充质干细胞的分化潜能；④各代骨髓间充质干细胞的侵袭和迁移能力；⑤各代骨髓间充质干细胞的线粒体氧化磷酸化和糖酵解能力；⑥各代骨髓间充质干细胞的衰老情况；⑦各代骨髓间充质干细胞的p21、p16、p53表达水平。
1.6 统计学分析实验数据均经过3次独立重复实验获得，采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。实验数据用x±s表示，多组间比较采用方差分析(ANOVA)，两组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法经过吉林省肝胆病医院生物统计学专家审核。

讨论

骨髓含有不同类型干细胞，其中最重要的是间充质干细胞[15]，骨髓间充质干细胞除具有多向分化的潜能外，还为外源基因的表达和转染提供了条件[16]。研究显示，骨髓间充质干细胞所携带的外源基因表达组织特异性明显，是组织和遗传工程的理想靶细胞[17]。有研究提出干细胞必须达到百万到数十亿才能满足临床治疗，骨髓中间充质干细胞含量仅0.001%-0.01%，体外传代扩增培养获得足够数量的细胞是其临床应用的前提条件[18-19]。有研究表明，间充质干细胞在体外长期传代培养过程中其生物学特性可能发生变化[20-21]。该研究首先观察体外连续传代培养人骨髓间充质干细胞的形态和增殖能力变化，结果显示第15代骨髓间充质干细胞体积增大，呈扁平状或煎蛋状，其S期细胞明显减少，G1期细胞阻滞，体外增殖能力明显下降。实验结果与WAGNER等[22]研究结果一致。多向分化潜能是间充质干细胞的重要生物学特性，TRUONG等[21]和WAGNER等[22]研究显示第5-15代间充质干细胞具有成脂、成骨和成软骨分化潜能，SEO等[23]认为体外长期传代培养间充质干细胞逐渐失去了自我更新能力和多向分化潜能。该研究结果显示第5，10，15代骨髓间充质干细胞保持正常的成脂、成骨和成软骨分化的能力，研究结果与TRUONG等[21]的报道一致。但该研究结果显示第15代骨髓间充质干细胞成骨、成软骨和成脂分化后细胞密度低，细胞间距较大。在干细胞移植的临床应用中，组织修复过程同时受干细胞迁移能力的影响[18]，有研究报道，与低代次间充质干细胞比较，衰老间充质干细胞的迁移能力明显降低[24]。该研究细胞划痕和Transwell侵袭实验结果显示，随着传代次数的增加骨髓间充质干细胞的体外迁移和侵袭能力逐渐减弱。长期传代培养间充质干细胞在相同的基础条件下增殖和迁移能力受损，将影响间充质干细胞移植治疗效果。
近年来，越来越多的证据表明，线粒体动力学和功能在间充质干细胞的生物学功能中起着关键作用[25]。线粒体是真核细胞中重要的细胞器，负责产生细胞能量，对维持组织稳态至关重要。线粒体能量代谢支持细胞的生存和增殖，并决定不同的细胞状态[26]。线粒体通过氧化磷酸化产生ATP，并通过产生TCA循环代谢产物(如柠檬酸盐)支持合成代谢[27]。该研究通过测量细胞耗氧率和细胞外酸化率来评估基础和压力条件下骨髓间充质干细胞线粒体氧化磷酸化功能和糖酵解功能，与第5代比较，第10，15代骨髓间充质干细胞的线粒体氧化磷酸化和糖酵解能力明显下降，表明骨髓间充质干细胞长期传代培养过程中能量代谢发生了一系列变化。间充质干细胞主要依靠糖酵解产生ATP，同样需要功能完整的线粒体，间充质干细胞通过整合糖酵解和线粒体代谢产生的不同代谢产物调节其命运和功能[28]。衰老标志物如p16、p53和β-半乳糖苷酶等均可用于早期识别衰老细胞[29]，该研究结果显示β-半乳糖甘酶活性和衰老蛋白表达从第10代开始呈现轻微增加，至第15代显著增强，结果表明体外长期传代培养可引起细胞早衰，导致细胞衰老的机制目前尚不完全清楚，但DNA损伤、端粒缩短、氧化应激、自噬障碍和线粒体功能障碍在间充质干细胞衰老中发挥了关键作用，是间充质干细胞衰老的主要公认机制[11]。
综上所述，骨髓间充质干细胞的生物学特性随着传代次数的增加发生改变，过度长期培养有可能导致骨髓间充质干细胞能量代谢障碍和衰老。深入探索间充质干细胞衰老的形成机制有助于进一步明确间充质干细胞功能障碍的驱动因素和效应因素，为缓解间充质干细胞功能障碍以及提升临床级间充质干细胞疗效方面提出可行性方案。课题组将继续深入研究长期传代培养骨髓间充质干细胞的能量代谢变化，能否通过能量代谢重编程逆转骨髓间充质干细胞的衰老是今后研究的重点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

长期传代培养对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

Effects of long-term subculture on biological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells

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