镉暴露激活PI3K/Akt信号通路诱导椎间盘纤维环细胞衰老

doi:10.12307/2023.990

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (8): 1217-1222.doi: 10.12307/2023.990

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镉暴露激活PI3K/Akt信号通路诱导椎间盘纤维环细胞衰老

刘鑫1，2，胡满2，3，赵文杰2，3，张钰1，2，孟博2，3，杨盛2，3，彭晴1，2，张亮1，2，王静成1，2

1扬州大学临床医学院，江苏省扬州市 225001；2江苏省苏北人民医院，江苏省扬州市 225001；3大连医科大学，辽宁省大连市 116044

收稿日期:2022-12-12 接受日期:2023-02-08 出版日期:2024-03-18 发布日期:2023-07-18
通讯作者: 王静成，博士生导师，主任医师，扬州大学临床医学院，江苏省扬州市 225001；江苏省苏北人民医院，江苏省扬州市 225001
作者简介:刘鑫，男，1993年生，山东省曹县人，汉族，扬州大学在读硕士，主要从事椎间盘退变的研究。

Cadmium promotes senescence of annulus fibrosus cells via activation of PI3K/Akt signaling pathway

Liu Xin1, 2, Hu Man2, 3, Zhao Wenjie2, 3, Zhang Yu1, 2, Meng Bo2, 3, Yang Sheng2, 3, Peng Qing1, 2, Zhang Liang1, 2, Wang Jingcheng1, 2

1Clinical Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China; 2Northern People’s Hospital of Jiangsu Province, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China; 3Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China

Received:2022-12-12 Accepted:2023-02-08 Online:2024-03-18 Published:2023-07-18
Contact: Wang Jingcheng, Doctoral supervisor, Chief physician, Clinical Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China; Northern People’s Hospital of Jiangsu Province, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China; Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China
About author:Liu Xin, Master candidate, Clinical Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China; Northern People’s Hospital of Jiangsu Province, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China; Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

镉：是一种有毒重金属，生物半衰期长，容易在体内蓄积，镉及镉化合物已被列入有毒有害水污染物名录。
纤维环细胞：纤维环在结构上的完整性对于限制髓核和维持椎间盘在负重时承受的生理压力非常关键，纤维环细胞的衰老可能是椎间盘退变的重要原因之一。

背景：镉是一种常见的环境污染物，可对肾脏、骨骼等多种器官和组织产生损害，但目前镉对纤维环细胞的影响知之甚少。

目的：探讨氯化镉对椎间盘纤维环细胞衰老的影响及PI3K/Akt信号通路在其中的作用。
方法：获取SD大鼠椎间盘纤维环细胞，以不同浓度(0，1，5，10，20 μmol/L)的氯化镉干预第3代纤维环细胞，CCK-8法检测细胞活力及增殖情况。对加入或不加入氯化镉的纤维环细胞进行转录组测序及京都基因与基因组百科全书生物信息学分析。将第3代纤维环细胞分为对照组、氯化镉组及PI3K/Akt通路抑制剂LY294002组，通过EdU法检测细胞增殖率，衰老相关β-半乳糖苷酶染色检测阳性细胞率，Western blot、RT-PCR及免疫荧光检测衰老相关蛋白(p16、p21及p53)及p-Akt的蛋白和mRNA表达水平。

结果与结论：①5 μmol/L氯化镉可以抑制纤维环细胞增殖。②京都基因与基因组百科全书功能富集结果显示，主要参与的信号转导途径有PI3K/Akt信号通路、cell cycle信号通路、p53信号通路等，与细胞增殖及衰老相关。选取差异表达明显的PI3K/Akt信号通路进行验证。③与对照组比较，氯化镉组的EdU染色阳性率下降(P < 0.05)，β-半乳糖苷酶染色阳性率、衰老相关蛋白(p16、p21及p53)及p-Akt表达增加(P < 0.05)。与氯化镉组比较，LY294002组的EdU染色阳性率下降(P < 0.05)，β-半乳糖苷酶染色阳性率、衰老相关蛋白(p16、p21及p53)表达增加(P < 0.05)，p-Akt表达下降(P < 0.05)。④结果表明，氯化镉可以通过激活PI3K/Akt信号通路导致纤维环细胞衰老，进而诱发椎间盘退变的发生和发展。

https://orcid.org/0000-0003-2689-1414(刘鑫)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 镉, 纤维环细胞, 椎间盘退变, 衰老, PI3K/Akt, 信号通路

Abstract: BACKGROUND: Cadmium is a common environmental pollutant, which can damage multiple organs and tissues, such as the kidney and bone, but its effect on annulus fibrosus cells in the intervertebral disc has been less reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of cadmium chloride on the senescence of annulus fibrosus cells and the role of PI3K/Akt signaling pathway.
METHODS: Annulus fibrosus cells from Sprague-Dawley rat intervertebral discs were harvested and passage 3 cells were intervened with different concentrations of cadmium chloride (0, 1, 5, 10, 20 μmol/L). Cell viability and proliferation were detected by cell counting kit-8 assay. Transcriptome sequencing and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes functional enrichment analysis were performed on annulus fibrosus cells with or without cadmium chloride addition. Passage 3 annulus fibrosus cells were divided into control group, cadmium chloride group and LY294002 group. Cell proliferation rate was detected by EdU method, positive cell rate was detected by senescence-associated β-galactosidase staining, and expressions of senescence-associated proteins (p16, p21 and p53) and p-Akt at protein and mRNA levels were measured by western blot, RT-PCR and immunofluorescence.
RESULTS AND CONCLUSION: 5 μmol/L cadmium chloride could inhibit the proliferation of annulus fibrosus cells. Results from the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes functional enrichment analysis showed that the main signal transduction pathways included PI3K/Akt, cell cycle and p53 signaling pathways, which were related to cell senescence and proliferation. PI3K/Akt signaling pathways with significant differential expression were selected for validation. Compared with the control group, the EdU-positive rate was significantly decreased in the cadmium chloride group (P < 0.05), while the β-galactosidase-positive rate, the expression of senescence-associated proteins (p16, p21 and p53) and p-Akt significantly increased (P < 0.05). Compared with the cadmium chloride group, the EdU-positive rate and p-Akt expression were significantly decreased in the LY294002 group (P < 0.05), while the β-galactosidase-positive rate and the expression of senescence-associated proteins (p16, p21 and p53) significantly increased (P < 0.05). To conclude, cadmium chloride can regulate the senescence of annulus fibrosus cells by activating the PI3K/Akt signaling pathway, thereby inducing the occurrence and progression of intervertebral disc degeneration.

Key words: cadmium, annulus fibrosus cell, intervertebral disc degeneration, senescence, PI3K/Akt, signaling pathway

中图分类号:

刘鑫, 胡满, 赵文杰, 张钰, 孟博, 杨盛, 彭晴, 张亮, 王静成. 镉暴露激活PI3K/Akt信号通路诱导椎间盘纤维环细胞衰老[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1217-1222.

Liu Xin, Hu Man, Zhao Wenjie, Zhang Yu, Meng Bo, Yang Sheng, Peng Qing, Zhang Liang, Wang Jingcheng. Cadmium promotes senescence of annulus fibrosus cells via activation of PI3K/Akt signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(8): 1217-1222.

图/表（结果） 7

2.1 氯化镉对纤维环细胞增殖的影响通过CCK-8检测细胞增殖活力，结果发现随着氯化镉浓度(0，1，5，10，20 μmol/L)的增加，细胞活力呈现浓度依赖性下降(P < 0.05)，见图1。因此5 μmol/L被选择为最佳干预浓度用于后续研究。

2.2 转录组测序分析差异表达基因聚类热图，见图2；GO富集分析柱状图，见图3。KEGG富集散点图，见图4。从KEGG富集结果中选取显著的15个KEGG通路绘制散点图，若不足15个，则绘制所有通路。在转录组差异表达基因中，Akt表达显著增加。通过KEGG通路富集分析，发现PI3K/Akt信号通路有强显著性，因此选择该通路进行验证。

2.3 氯化镉对纤维环细胞衰老的影响通过β-半乳糖苷酶染色发现氯化镉组细胞阳性率明显增加，并且LY294002组细胞阳性率进一步增加 (P < 0.05)。EdU染色发现氯化镉组细胞阳性率明显下降，LY294002组细胞阳性率进一步下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.4 氯化镉对纤维环细胞中衰老相关蛋白表达的影响通过免疫荧光及Western blot检测p16、p21及p53蛋白表达，RT-PCR检测p16、p21及p53 mRNA表达。结果发现，与对照组比较，氯化镉组的衰老相关蛋白p16、p21及p53在蛋白水平及mRNA水平显著增加，差异均有显著性意义(P < 0.05)。与氯化镉组比较，LY294002组的p16、p21及p53蛋白及mRNA表达进一步增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

2.5 氯化镉对PI3K/Akt通路蛋白及mRNA表达的影响与对照组比较，氯化镉组p-Akt蛋白水平显著增加，差异有显著性意义(P < 0.05)；与氯化镉组比较，LY294002组p-Akt蛋白水平减少，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图7。

参考文献

[1] HOY D, MARCH L, BROOKS P, et al. Measuring the global burden of low back pain. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2010;24(2):155-165.
[2] FOSTER NE, ANEMA JR, CHERKIN D, et al. Prevention and treatment of low back pain: evidence, challenges, and promising directions. Lancet. 2018;391(10137):2368-2383.
[3] HOY D, MARCH L, BROOKS P, et al. The global burden of low back pain: estimates from the Global Burden of Disease 2010 study. Ann Rheum Dis. 2014;73(6):968-974.
[4] FREBURGER JK, HOLMES GM, AGANS RP, et al. The rising prevalence of chronic low back pain. Arch Intern Med. 2009;169(3):251-258.
[5] SATARUG S, GARRETT SH, SENS MA, et al. Cadmium, environmental exposure, and health outcomes. Environ Health Perspect. 2010;118(2): 182-190.
[6] LE MAITRE CL, FREEMONT AJ, HOYLAND JA. Accelerated cellular senescence in degenerate intervertebral discs: a possible role in the pathogenesis of intervertebral disc degeneration. Arthritis Res Ther. 2007;9(3):R45.
[7] ROBERTS S, EVANS EH, KLETSAS D, et al. Senescence in human intervertebral discs. Eur Spine J. 2006;15 Suppl 3(Suppl 3):S312-316.
[8] DAI X, CHEN Y, YU Z, et al. Advanced oxidation protein products induce annulus fibrosus cell senescence through a NOX4-dependent, MAPK-mediated pathway and accelerate intervertebral disc degeneration. PeerJ. 2022;10:e13826.
[9] NAKAMICHI R, ITO Y, INUI M, et al. Mohawk promotes the maintenance and regeneration of the outer annulus fibrosus of intervertebral discs. Nat Commun. 2016;7:12503.
[10] WANG T, YUAN Y, ZOU H, et al. The ER stress regulator Bip mediates cadmium-induced autophagy and neuronal senescence. Sci Rep. 2016; 6:38091.
[11] LUO H, GU R, OUYANG H, et al. Cadmium exposure induces osteoporosis through cellular senescence, associated with activation of NF-kappaB pathway and mitochondrial dysfunction. Environ Pollut. 2021;290:118043.
[12] ZHANG Y, CAI W, HAN G, et al. Panax notoginseng saponins prevent senescence and inhibit apoptosis by regulating the PI3K‑AKT‑mTOR pathway in osteoarthritic chondrocytes. Int J Mol Med. 2020;45(4): 1225-1236.
[13] WANG Z, WANG L, JIANG R, et al. Ginsenoside Rg1 prevents bone marrow mesenchymal stem cell senescence via NRF2 and PI3K/Akt signaling. Free Radic Biol Med. 2021;174:182-194.
[14] NI BB, LI B, YANG YH, et al. The effect of transforming growth factor β1 on the crosstalk between autophagy and apoptosis in the annulus fibrosus cells under serum deprivation. Cytokine. 2014;70(2):87-96.
[15] JING D, WU W, DENG X, et al. FoxO1a mediated cadmium-induced annulus fibrosus cells apoptosis contributes to intervertebral disc degeneration in smoking. J Cell Physiol. 2021;236(1):677-687.
[16] MELROSE J, SMITH S, LITTLE CB, et al. Spatial and temporal localization of transforming growth factor-beta, fibroblast growth factor-2, and osteonectin, and identification of cells expressing alpha-smooth muscle actin in the injured anulus fibrosus: implications for extracellular matrix repair. Spine (Phila Pa 1976). 2002;27(16):1756-1764.
[17] 张广智,武作龙,贺学岗,等.细胞衰老与椎间盘退变的相关性研究进展[J].生命科学研究,2021,25(1):58-63,94.
[18] JIN H, WANG Q, WU J, et al. Baicalein Inhibits the IL-1β-Induced Inflammatory Response in Nucleus Pulposus Cells and Attenuates Disc Degeneration In vivo. Inflammation. 2019;42(3):1032-1044.
[19] LIU Y, LIN J, WU X, et al. Aspirin-Mediated Attenuation of Intervertebral Disc Degeneration by Ameliorating Reactive Oxygen Species In Vivo and In Vitro. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:7189854.
[20] FENG C, LIU H, YANG M, et al. Disc cell senescence in intervertebral disc degeneration: Causes and molecular pathways. Cell Cycle. 2016; 15(13):1674-1684.
[21] YURUBE T, BUCHSER WJ, MOON HJ, et al. Serum and nutrient deprivation increase autophagic flux in intervertebral disc annulus fibrosus cells: an in vitro experimental study. Eur Spine J. 2019;28(5): 993-1004.
[22] CAVALLI G, HEARD E. Advances in epigenetics link genetics to the environment and disease. Nature. 2019;571(7766):489-499.
[23] BERNHARD D, ROSSMANN A, WICK G. Metals in cigarette smoke. IUBMB Life. 2005;57(12):805-809.
[24] COSSELMAN KE, NAVAS-ACIEN A, KAUFMAN JD. Environmental factors in cardiovascular disease. Nat Rev Cardiol. 2015;12(11):627-642.
[25] NAWROT TS, MARTENS DS, HARA A, et al. Association of total cancer and lung cancer with environmental exposure to cadmium: the meta-analytical evidence. Cancer Causes Control. 2015;26(9):1281-1288.
[26] YANG S, ZHANG F, MA J, et al. Intervertebral disc ageing and degeneration: The antiapoptotic effect of oestrogen. Ageing Res Rev. 2020;57:100978.
[27] 张文捷,张勇,史明,等. 淫羊藿苷调控髓核来源间充质干细胞凋亡修复椎间盘退变[J].中国组织工程研究,2023,27(24):3803-3809.
[28] 王以典. N-乙酰血清素通过激活PI3K/AKT信号通路减轻大鼠髓核细胞的氧化应激损伤[D].兰州:兰州大学,2022.
[29] 牛海名,李建伟,陈妙莲,等.外源性硫化氢通过PI3K/Akt/eNOS通路改善过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞衰老[J].中山大学学报(医学科学版),2021,42(4):535-542.
[30] 赵丽东,丛淋淋,徐瑶,等.IGF-1通过PI3K/Akt通路对大鼠软骨细胞衰老的影响[J].动物医学进展,2019,40(10):64-68.
[31] 王静欢,刘珂,万东,等.梓醇对大脑皮质神经元的抗衰老保护作用研究[J].中国药理学通报,2017,33(12):1691-1697.
[32] MAIDARTI M, ANDERSON RA, TELFER EE. Crosstalk between PTEN/PI3K/Akt Signalling and DNA Damage in the Oocyte: Implications for Primordial Follicle Activation, Oocyte Quality and Ageing. Cells. 2020; 9(1):200.
[33] WANG F, CAI F, SHI R, et al. Aging and age related stresses: a senescence mechanism of intervertebral disc degeneration. Osteoarthritis Cartilage. 2016;24(3):398-408.

引言

2016年《Lancet》杂志报道腰痛已成为全球范围内患者就医及致残的第二大病因，给人类带来极大的经济负担和社会负担[1-3]。椎间盘退变是引起腰痛的最主要病因，但目前椎间盘退变的病理机制尚未阐明，一般认为各种异常因素导致的椎间盘细胞衰老与凋亡增加是其始动因素[4]。
镉是一种常见的环境和工业污染物，更是一种全球性的重金属污染物，联合国环境规划在1984年提出的具有全球意义的12种危害物质中镉被列为首位。由于工业的迅速发展，镉在全球范围内的排放量日益增多，由此造成镉污染愈发严重。从事重金属矿的开采和冶炼的职业人群极易造成高水平镉暴露，非职业人群主要通过吸烟以及摄入受污染的水及食物等途径暴露于环境镉[5]。研究发现镉作为烟草中的主要成分(1.0-2.0 µg/g)，在吸烟者的肺组织及血液标本中发现高浓度的镉聚集残留[6]。另外，基于中国长江三角洲地区3 234名居民的调查结果显示男性血液中镉质量浓度为1.80 µg/L(0.60-3.42 µg/L)，女性为1.40 µg/L(0.52-3.10 µg/L)，其结果高于发达国家[7]。镉暴露可造成人体多个器官及系统的损害，而骨骼则是镉损伤的主要靶器官之一，可引起骨关节炎及骨质疏松等骨骼相关疾病。研究发现脊柱骨关节炎患者血液中镉浓度显著高于对照组，这表明镉毒性与脊柱疾病密切关系[8]。
椎间盘组织包括髓核、纤维环及软骨终板，纤维环组织在维持椎间盘的稳定性方面发挥重要作用，因此其对椎间盘退变的发生发展至关重要[9]。研究发现镉暴露可显著诱导神经元细胞及骨髓间充质干细胞衰老[10-11]。ZHANG等[12]研究发现PI3K/Akt途径与骨关节炎软骨细胞的衰老密切相关。此外，WANG等[13]研究发现PI3K/Akt信号通路也参与调节骨髓间充质干细胞的衰老。目前镉是否可以导致椎间盘退变尚不清楚。PI3K/Akt通路是一条促进细胞生存相关的信号通路，对纤维环细胞的活性有重要作用，可能在镉诱导椎间盘退变中发挥重要作用[14-15]。该研究通过转录组测序分析发现，氯化镉处理后的纤维环细胞PI3K/Akt通路发生显著性差异表达，因此，氯化镉可能通过PI3K/Akt信号途径参与椎间盘纤维环细胞衰老。但目前镉对纤维环细胞的影响知之甚少。
该实验在体外分离培养大鼠椎间盘纤维环细胞，探讨镉对纤维环细胞衰老的影响及PI3K/Akt信号通路在其中的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，纤维环细胞衰老、增殖和活力检测数据采用单因素方差分析进行统计分析。
1.2 时间及地点实验于2021年7月至2022年10月在扬州大学临床医学院骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 8周龄清洁级SD大鼠20只，体质量(260±30) g，雌雄不限，由江苏大学动物中心提供，合格证号：SYXK(苏)2018-0012。该实验经扬州大学临床医学院动物实验伦理委员会批准，审批号为SBYY2020-013。
1.3.2 实验试剂和仪器无水氯化镉(Aladdin，Cat No: 10108-64-2，中国)；一抗：p16、p21、p53、p-Akt及GAPDH抗体(Proteintech，Cat No: 10883-1-AP，Cat No: 10355-1-AP，Cat No: 10442-1-AP，Cat No: 66444-1-Ig，Cat No: 10494-1-AP，中国)；二抗山羊抗兔IgG(Proteintech，Cat No: SA00001-2，中国)；PI3K/Akt通路抑制剂LY294002(MedChemExpress，Cat No: LY294002，美国)；Ⅰ型胶原酶(Sigma，Cat No: 9001-12-1，美国)；PBS及胰蛋白酶 (Solaibo，Cat No: P1022，Cat No: T1300，美国)；CCK-8检测试剂盒及 EdU-488细胞增殖检测试剂盒(Beyotime，Cat No: C0071L，中国)；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(凯基生物，Cat No: KGPAG001，中国)；胎牛血清(Clark Bioscience，Cat No:FB15015，美国)；DMEM培养基(Gibco，Cat No:11885500BT，美国)；Trizol试剂(Invitrogen，Cat No: 15596026，美国)；全蛋白提取试剂盒(Keygen，Cat No: KGP2100，中国)。
1.4 实验方法

1.4.1 纤维环细胞的分离与培养纤维环细胞取自SD大鼠尾椎的椎间盘组织，在无菌条件下将纤维环从椎间盘组织中分离出来，用0.25%的Ⅰ型胶原酶处理8-10 h，再将消化后的组织接种在含体积分数为15%胎牛血清和抗生素(1%青霉素/链霉素)的DMEM培养液中，在体积分数为5%CO2的37 ℃培养箱中培养3-5 d后，去除组织碎片和悬浮细胞，贴壁细胞为纤维环细胞。当细胞融合度为80%-90%时进行传代培养，第3代细胞用于后续实验。

1.4.2 细胞活力检测按CCK-8试剂盒说明书进行相关操作：第3代纤维环细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，分为5组，每组设5个复孔。细胞完全贴壁后，加入含不同浓度(0，1，5，10，20 μmol/L)氯化镉的DMEM培养基分别培养6，12，24，48 h，各孔加入10 μL CCK-8溶液，同时设置阴性对照组，在37 ℃细胞培养箱中避光孵育2 h后，用酶标仪测量450 nm处吸光度值，计算细胞活力[细胞活力=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%。
1.4.3 转录组测序分析将第3代纤维环细胞不加入或加入氯化镉(5 μmol/L)处理24 h后，由上海吉凯基因化学技术有限公司完成RNA提取、文库构建、转录组测序及生物信息学分析等。转录组测序基于Illumina平台，进行样品收集和准备(RNA提取与检测、文库构建与质检、上机测序)及数据分析。使用 featureCounts(1.5.0-p3)软件确定每个样本中各个基因表达的 FPKM值，使用DESeq2软件(1.16.1)进行两个比较组合之间的差异表达分析(每组2个生物学重复)。通过clusterProfiler(3.4.4)软件分析京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路中差异表达基因的富集统计。
1.4.4 实验分组及干预第3代纤维环细胞以1×106个/孔的密度接种于100 mm培养皿中，待细胞完全贴壁后开始干预，分为对照组(DMEM培养基培养)、氯化镉组(5 μmol/L氯化镉+DMEM培养基)及LY294002组(10 μmol/L PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002预处理2 h +5 μmol/L氯化镉+DMEM培养基)，24 h后进行后续检测。
1.4.5 EdU法检测细胞增殖能力将第3代纤维环细胞(1×105个/孔)接种于6孔板中培养，按照前述方法分组干预后，与EdU工作液孵育2 h，40 g/L多聚甲醛室温固定15 min，0.3% Triton X-100室温孵育10 min，每孔加入0.5 mL Click反应液，室温孵育30 min，再用DAPI避光孵育10 min，最后用荧光显微镜观察和记录细胞，Image J软件进行分析。
1.4.6 β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况第3代纤维环细胞接种于6孔板中培养，按照前述方法分组干预后继续培养24 h，每孔加入500-1 000 μL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定10-15 min，每孔滴加 500-1 000 μL β-半乳糖苷酶染色工作液，置于37 ℃无CO2温箱中避光孵育过夜，普通光学显微镜下观察，Image J软件进行分析。

1.4.7 RT-PCR检测相关mRNA表达按照前述方法分组干预后收集纤维环细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，酶标仪检测RNA浓度及纯度，以反转录获得的cDNA为模板，GAPDH为内参进行扩增，RT-PCR 检测Akt、p16、p21及 p53 的 mRNA 表达。根据2-ΔΔCt法计算靶基因的mRNA相对表达水平，每个样品重复3次。引物序列具体信息见表1。

1.4.8 免疫荧光检测相关蛋白表达按照前述方法分组干预后收集纤维环细胞，40 g/L多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗涤后0.3% Triton X-100室温通透15 min，PBS洗涤后用5% BSA封闭1 h，分别加入一抗(p16、p21、p53及p-Akt)(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，PBS洗涤后加入荧光二抗山羊抗兔IgG (1∶5 000)室温条件下孵育1 h，PBS洗涤3次，DAPI避光孵育10 min，通过荧光显微镜观察并获取图像。
1.4.9 Western blot检测相关蛋白的表达按照前述方法分组干预后收集纤维环细胞，低温PBS洗涤细胞3次，使用总蛋白提取试剂盒在冰上提取总蛋白，然后用BCA试剂盒定量蛋白浓度，随后使用5×Loading Buffer将蛋白样品稀释至合适浓度并煮沸，上样浓度为3 μg/μL，通过SDS-PAGE分离样品并转移到PVDF膜上，使用5% BSA室温封闭2 h。将PVDF膜与一抗(p16、p21及p53，稀释比例1∶2 000)
4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，10 min/次，使用对应二抗山羊抗兔IgG(1∶5 000)室温孵育2 h，TBST洗涤3次，10 min/次，最后进行显影曝光，使用ImageJ软件进行分析。
1.5 主要观察指标 ①不同浓度氯化镉对纤维环细胞增殖活力的影响；②EdU及β-半乳糖苷酶染色检测纤维环细胞增殖及衰老情况；③Western blot、免疫荧光及RT-PCR检测p16、p21、p53及p-Akt的蛋白及mRNA表达。
1.6 统计学分析数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析，并使用GraphPad Prism 9制作统计图。计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，进一步两两比较采用LSD法，P < 0.05表示差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过扬州大学生物统计学专家审核。

讨论

纤维环细胞作为一种成纤维细胞，通过细胞增殖和分泌大量Ⅰ型胶原和其他细胞外基质维持椎间盘结构稳定，参与椎间盘修复过程[16]。在椎间盘退变过程中，纤维环细胞发生衰老后，局部代谢状态发生改变，表现为合成代谢降低及分解代谢加强，导致细胞外基质降解增加及纤维环弹性降低，最终导致脊柱稳定性下降、纤维环撕裂、髓核组织突出等一系列病理改变[17]。多项研究表明，机体炎症反应、氧化应激反应、线粒体功障碍、端粒缩短和DNA损伤、营养剥夺、机械载荷异常及表观遗传学改变等与椎间盘退变密切相关[18-22]。因此，探究纤维环细胞的功能机制仍是近年来的研究热点。镉是一种有毒重金属，已被证明对人类有害，与多种疾病有关，包括心脑血管疾病、骨质疏松症和多种癌症[23-25]。近年来，国内已有学者对于镉诱导椎间盘退变的作用及其机制进行研究。研究发现镉通过线粒体相关途径诱导纤维环细胞凋亡，进而导致椎间盘退变，并且PI3K/Akt信号通路参与其中[15]。该研究从健康大鼠中分离培养出纤维环细胞并施加不同浓度的氯化镉干预，结果证实氯化镉以浓度依赖性方式抑制纤维环细胞的活力，进一步研究还发现氯化镉可以增加纤维环细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率及p16、p21和p53等衰老相关蛋白表达，并抑制细胞的增殖。因此，镉暴露能够促进纤维环细胞衰老，从而可能通过影响纤维环的结构稳定性，进而在镉致椎间盘退变中发挥作用。
PI3K/Akt信号通路是一条常见的影响细胞增殖的通路，涉及细胞增殖、氧化损伤、自噬以及衰老[26]。课题组前期研究发现PI3K/Akt信号通路参与调节髓核来源间充质干细胞及髓核细胞的衰老与凋亡，进而一定程度上影响椎间盘退变[27-28]。另外有研究发现大鼠软骨细胞、人脐静脉内皮细胞、人脑微血管内皮细胞及神经元细胞的衰老均与PI3K/Akt信号通路有关[29-31]。MAIDARTI等[32]研究发现卵巢衰老导致的DNA修复蛋白相互作用受损与PI3K/Akt通路的激活密切相关。同时，该研究转录组测序结果表明镉可能通过激活PI3K/Akt信号通路影响纤维环细胞的生物学功能。因此，PI3K/Akt信号通路的激活可能会参与镉诱导的纤维环细胞衰老。该研究结果表明，PI3K/Akt信号通路在氯化镉作用下被激活，该通路的关键蛋白p-Akt的表达水平增加，通过RT-PCR、Western blot及免疫荧光检测p16、p21及p53的mRNA和蛋白表达水平，发现氯化镉干预后纤维环细胞p16、p21及p53的表达量明显上调，同时细胞衰老增加，通过PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002处理后可以进一步增加细胞衰老。因此，这些结果说明氯化镉可能激活了PI3K/Akt信号通路的细胞保护作用，但使用LY294002后这种保护作用受到抑制，纤维环细胞衰老进一步增加，进而说明PI3K/Akt信号通路的激活可能在镉诱导的纤维环细胞衰老中发挥重要作用。
然而，该研究也存在一些局限性：首先，该研究没有直接评估镉暴露对椎间盘组织及细胞的影响，尽管有证据证明椎间盘退变与镉暴露有关[15，33]；其次，该研究未进行体内实验，这一定程度上限制了镉毒性对椎间盘组织影响的理解。因此，需要进一步研究来确定镉暴露对椎间盘组织的影响。
综上所述，镉暴露可以诱导椎间盘纤维环细胞发生衰老，从而加速椎间盘退变。PI3K/Akt介导的信号通路可能参与镉诱导的纤维环细胞衰老。因此，PI3K/Akt信号通路可能是今后预防镉暴露导致椎间盘退变的一个靶基因。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

镉暴露激活PI3K/Akt信号通路诱导椎间盘纤维环细胞衰老

Cadmium promotes senescence of annulus fibrosus cells via activation of PI3K/Akt signaling pathway

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[1]	岳云, 王佩佩, 袁兆鹤, 何生存, 贾戌生, 刘倩, 李占涛, 付慧玲, 宋斐, 贾孟辉. 巴豆霜干预脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区JNK/p38 MAPK及神经元凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1186-1192.
[2]	魏娟, 李婷, 郇梦婷, 谢颖, 谢舟煜, 韦庆波, 吴云川. 静力性训练改善2型糖尿病骨骼肌胰岛素抵抗的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1271-1276.
[3]	潘小龙, 樊飞燕, 应春苗, 刘飞祥, 张运克. 中药抑制间充质干细胞衰老的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1091-1098.
[4]	张克凡, 石辉. 细胞因子治疗骨关节炎的研究现状及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 961-967.
[5]	韦沅汛, 陈锋, 林宗汉, 张驰, 潘成镇, 韦宗波. Notch信号通路与骨质疏松症及中医药防治[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 587-593.
[6]	刘潞兴, 狄鸣远, 杨强. 中药有效成分治疗骨关节炎机制中的信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 609-614.
[7]	曹胜, 孔令伟, 徐昆, 孙志杰. 负载丹酚酸B甲基丙烯酰化明胶水凝胶对椎间盘退变的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 380-386.
[8]	刘宝方, 徐斌, 陈雷. 葛根汤治疗骨关节炎的网络药理学分析及动物实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 193-199.
[9]	王倩, 卢子昂, 李利和, 吕超亮, 王盟, 张存鑫. 青藤碱可有效抑制白细胞介素1β介导的髓核细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 224-230.
[10]	尹林伟, 黄夏荣, 屈萌艰, 杨璐, 王金玲, 贾飞阳, 廖阳, 周君. 跑台运动对老年大鼠骨质疏松及wnt/β-catenin信号通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 231-236.
[11]	谢鹏, 张江, 邓小磊, 魏波, 侯德才. 肌少症小鼠模型构建的系统回顾[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 263-266.
[12]	王京峰, 文登台, 王士杰, 高颖晖. Atg介导的自噬、运动和骨骼肌衰老[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 295-301.
[13]	程浩天, 赵晓峰, 陆向东, 赵轶波, 范志峰, 齐德泰, 王晓楠, 周润田, 靳鑫杰, 赵斌. 单细胞转录组测序技术与椎间盘退变的发病机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 93-99.
[14]	杨婷, 丁智斌, 江楠, 韩红霞, 侯苗苗, 马存根, 宋丽娟, 李新毅. 星形胶质细胞调节缺血性脑卒中的胶质瘢痕形成[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 131-138.
[15]	张丽, 杨文君, 桑晓红, 韩媛媛, 冒智捷, 王顺, 陆晨. 过表达线粒体蛋白磷酸酶2C对人肾小管上皮细胞转录组的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 68-73.