巴豆霜干预脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区JNK/p38 MAPK及神经元凋亡的机制

doi:10.12307/2023.997

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (8): 1186-1192.doi: 10.12307/2023.997

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

巴豆霜干预脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区JNK/p38 MAPK及神经元凋亡的机制

岳云1，王佩佩2，袁兆鹤1，何生存1，贾戌生3，刘倩4，李占涛2，付慧玲2，宋斐1，贾孟辉2，4

1宁夏医科大学中医学院，宁夏回族自治区银川市 750000；2银川市第一人民医院中医科，宁夏回族自治区银川市 750000；3宁夏少数民族医药现代化教育部重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750000；4宁夏医科大学临床医学院，宁夏回族自治区银川市 750000

收稿日期:2022-12-26 接受日期:2023-02-04 出版日期:2024-03-18 发布日期:2023-07-18
通讯作者: 贾孟辉，教授，主任医师，银川市第一人民医院中医科，宁夏回族自治区银川市 750000；宁夏医科大学临床医学院，宁夏回族自治区银川市 750000
作者简介:岳云，男，1994年生，宁夏回族自治区中卫市人，汉族，2019年大连医科大学中山学院毕业，主要从事中医药防治脑血管病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(8176150449)，项目负责人：贾孟辉

Effects of croton cream on JNK/p38 MAPK signaling pathway and neuronal apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion injury rats

Yue Yun1, Wang Peipei2, Yuan Zhaohe1, He Shengcun1, Jia Xusheng3, Liu Qian4, Li Zhantao2, Fu Huiling2, Song Fei1, Jia Menghui2, 4

1College of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750000, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Department of Traditional Chinese Medicine, the First People’s Hospital of Yinchuan, Yinchuan 750000, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 3Ningxia Key Laboratory of Modernization of Minority Medicine, Ministry of Education, Yinchuan 750000, Ningxia Hui Autonomous Region, China;

Received:2022-12-26 Accepted:2023-02-04 Online:2024-03-18 Published:2023-07-18
Contact: Jia Menghui, Professor, Chief physician, Department of Traditional Chinese Medicine, the First People’s Hospital of Yinchuan, Yinchuan 750000, Ningxia Hui Autonomous Region, China; School of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750000, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Yue Yun, College of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750000, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 8176150449 (to JMH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

巴豆霜：巴豆的炮制加工品，主要治疗峻下积滞，逐水消肿，豁痰利咽。用于寒积便秘、乳食停滞、下腹水肿、二便不通、喉风及喉痹。研究显示巴豆霜成分作用的核心靶点主要作用于神经系统。
脑缺血再灌注损伤：是指脑组织持续一定时间的缺血后恢复血流再灌注，其功能不但得不到恢复，还会出现更为严重的脑组织结构及功能损害。目前认为，脑缺血再灌注损伤的发生机制主要和自由基生成、脑内Ca2+超载、兴奋性氨基酸毒性作用、白细胞大量聚集和ATP合成减少等密切相关。

背景：巴豆霜能够激活ERK通路、对神经元细胞具有抗凋亡作用，是否具有抑制JNK、p38通路的激活而发挥抗凋亡的协同效应尚不清楚。

目的：探讨巴豆霜对脑缺血再灌注损伤大鼠缺血侧皮质区神经元损伤和凋亡的影响及机制。
方法：①将90只SD大鼠随机分为假手术组，模型组，巴豆霜低、中、高剂量组，尼莫地平组，每组15只，除假手术组外，剩余各组均采取线栓法制备大脑中动脉栓塞大鼠模型，巴豆霜各组大鼠分别按剂量20 ，40，60 mg/kg灌胃；假手术组和模型组大鼠给予等量生理盐水，1次/d，连续给药7 d。运用神经功能缺损评分、TTC染色、脑组织含水量、苏木精-伊红染色及尼氏染色筛选出最佳浓度即巴豆霜高剂量。②将120只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、巴豆霜组、JNK抑制剂组、巴豆霜+JNK抑制剂组、p38 MAPK抑制剂组、巴豆霜+p38 MAPK抑制剂组和尼莫地平组，每组15只，除假手术组外，剩余各组大鼠均制备大脑中动脉栓塞大鼠模型，在造模之前30 min，将10 μL JNK抑制剂SP600125或10 μL p38 MAPK抑制剂SB203580分别注射到大鼠侧脑室，巴豆霜各组大鼠灌胃60 mg/kg巴豆霜，7 d 后，采用Western Blot、TUNEL染色及流式细胞术检测各组大鼠脑组织JNK/p38 MAPK信号通路及凋亡相关蛋白水平及细胞凋亡情况。

结果与结论：①与假手术组相比，模型组神经功能缺损评分、脑含水量、脑梗死体积、细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)，神经细胞呈散乱分布；与模型组相比，巴豆霜中、高剂量组和尼莫地平组大鼠神经功能缺损评分、脑组织含水量、脑梗死体积显著降低(P < 0.05)，神经细胞病理形态明显改善；②与JNK抑制剂组相比，巴豆霜+抑制剂组大鼠脑组织p-JNK/JNK、p-p38/p38、Bax表达显著降低(P < 0.05)，细胞凋亡率显著降低(P < 0.05)，而Bcl-2表达显著升高(P < 0.05)；③结果提示，巴豆霜可能通过抑制JNK/p38 MAPK信号通路的激活、减少神经元凋亡等途径，达到对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用。

https://orcid.org/0000-0001-6982-5308(岳云)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 巴豆霜, 脑缺血再灌注损伤, 神经元凋亡, 信号通路, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Croton cream can activate ERK pathways and have anti-apoptotic effects on neuronal cells. It is not clear whether it synergistically exerts anti-apoptotic effects by inhibiting the activation of JNK and p38 pathways.
OBJECTIVE: To explore the effects and mechanisms of croton cream on neuronal damage and apoptosis in the ischemic cortex of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury.
METHODS: (1) Ninety Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group, model group, croton cream low-dose group, croton cream medium-dose group, croton cream high-dose group and nimodipine group, with 15 rats in each group. Except for the sham operation group, animal models of middle cerebral artery occlusion were prepared in rats by the thread method. Rats in the three croton cream groups were given 20, 40, and 60 mg/kg croton cream, respectively. Rats in the sham operation and model groups were given the same amount of normal saline, once a day, for 7 consecutive days. The optimal concentration of croton cream, namely the high dose of croton cream, was selected based on neurological deficit score, TTC staining, brain tissue water content, hematoxylin-eosin staining and Nissl staining. (2) Another 120 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group, model group, croton cream group, JNK inhibitor group, croton cream+JNK inhibitor group, p38 MAPK inhibitor group, croton cream+p38 MAPK inhibitor group, and nimodipine group, with 15 rats in each group. Animal models of middle cerebral artery occlusion were prepared using the thread method in all the groups except in the sham operation group. Thirty minutes before modeling, 10 μL of SP600125 (JNK inhibitor) and 10 μL of SB203580 (p38 MAPK inhibitor) were injected into the lateral ventricle of the rats, respectively. Rats in croton cream groups were intragastrically given 60 mg/kg croton cream. Seven days later, the JNK/p38 MAPK signaling pathway, apoptosis-related proteins and cell apoptosis were detected by western blot, TUNEL staining and flow cytometry, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the sham operation group, neurological deficit score, cerebral water content, cerebral infarction volume and apoptosis rate were significantly increased in the model group (P < 0.05), where nerve cells showed scattered distribution. Compared with the model group, neurological deficit score, water content of brain tissue and cerebral infarction volume were significantly decreased in the croton cream medium-dose group, high-dose group and nimodipine group (P < 0.05), and the pathological morphology of nerve cells was significantly improved. (2) Compared with the JNK inhibitor group, p-JNK/JNK, p-p38/p38 and Bax expressions in rat brain tissue and the apoptotic rate were significantly decreased in the croton cream+inhibitor groups (P < 0.05), while the expression of and Bcl-2 was significantly increased (P < 0.05). To conclude, croton cream may inhibit the activation of JNK/p38 MAPK signaling pathway and reduce neuronal apoptosis to achieve neuroprotective effects in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury.

Key words: croton cream, cerebral ischemia-reperfusion injury, neuronal apoptosis, signaling pathway, rat

中图分类号:

岳云, 王佩佩, 袁兆鹤, 何生存, 贾戌生, 刘倩, 李占涛, 付慧玲, 宋斐, 贾孟辉. 巴豆霜干预脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区JNK/p38 MAPK及神经元凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1186-1192.

Yue Yun, Wang Peipei, Yuan Zhaohe, He Shengcun, Jia Xusheng, Liu Qian, Li Zhantao, Fu Huiling, Song Fei, Jia Menghui. Effects of croton cream on JNK/p38 MAPK signaling pathway and neuronal apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion injury rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(8): 1186-1192.

图/表（结果） 10

2.1 第一部分结果
2.1.1 实验动物数量分析造模成功78只及假手术12只进入结果分析。
2.1.2 巴豆霜对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损评分的影响假手术组未出现神经功能损伤，神经功能缺损评分为0；与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分明显增加(P < 0.01)；与模型组比较，巴豆霜低、中、高剂量组和尼莫地平组大鼠神经功能缺损评分均不同程度降低(P < 0.01)，巴豆霜高剂量组大鼠神经功能缺损评分与尼莫地平组大鼠相近。说明巴豆霜可改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能，且高剂量组效果明显，见图1。

2.1.3 巴豆霜对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织含水量的影响与假手术组比较，模型组大鼠脑组织含水量增多(P < 0.01)；与模型组比较，巴豆霜低、中、高剂量组及尼莫地平组大鼠脑组织含水量均减少，提示巴豆霜可以减轻脑缺血再灌注损伤大鼠脑水肿，尤以高剂量组效果明显，见图2。

2.1.4 巴豆霜对脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积的影响假手术组大鼠脑组织TTC染色后均呈深红色，无梗死灶形成；其他各组大鼠均可见不同程度的白色梗死灶；与模型组比较，巴豆霜低、中、高剂量组和尼莫地平组大鼠梗死灶范围缩小，尤以高剂量组明显，见图3。

与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死体积百分比显著增加(P < 0.01)，提示大鼠脑缺血再灌注损伤模型建立成功；与模型组相比，巴豆霜中、高剂量组和尼莫地平组大鼠脑梗死体积百分比均显著降低(P < 0.01)，结果说明巴豆霜可以明显减小脑梗死体积，见图4。

2.1.5 巴豆霜对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织皮质区病理形态的影响假手术组细胞形态结构正常，边缘清晰，细胞核和细胞间物质染色均匀，细胞间隙致密；模型组细胞排列混乱，胞质内形成筛网状，细胞间隙疏松，伴有细胞坏死；与模型组比较，各给药组皮质区病理形态明显改善，见图5。

2.1.6 巴豆霜对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织皮质区神经元损伤的影响假手术组脑组织神经元细胞尼氏小体形态正常；模型组可见神经元细胞呈空泡样，细胞核固缩，尼氏小体明显减少，间隙变大，排列混乱，轮廓模糊不清；与模型组比较，各给药组神经元细胞结构相对完整，尼氏小体排列有序，轮廓清晰，胞浆内可见尼氏小体，见图6。

2.2 第二部分结果
2.2.1 实验动物数量分析实验选用的120只小鼠分为8组，全部进入结果分析。
2.2.2 巴豆霜对脑缺血再灌注损伤大鼠JNK/p38 MAPK信号通路及凋亡相关蛋白的影响假手术组p-JNK及p-p38蛋白低水平表达；与假手术组比较，模型组p-JNK及p-p38蛋白表达显著增加(P < 0.05)，说明模型组大鼠JNK/p38 MAPK信号通路处于活化状态；与模型组相比，巴豆霜组、SP600125组、巴豆霜+SP600125组p-JNK蛋白均显著降低(P < 0.01或P < 0.001)；与模型组相比，巴豆霜组、SB203580组、巴豆霜+SB203580组p-p38蛋白均显著降低(P < 0.01或P < 0.001)，见图7。

与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中Bax蛋白表达显著上调(P < 0.001)，而Bcl-2蛋白表达显著下调(P < 0.001)；与模型组相比，巴豆霜组、SP600125组、巴豆霜+SP600125组大鼠脑组织Bax 蛋白表达显著下调(P < 0.001)，而Bcl-2 蛋白表达明显上调(P < 0.05)，见图8。

2.2.3 巴豆霜对脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质区神经元凋亡的影响通过TUNEL染色发现，绿色代表凋亡细胞，蓝色代表细胞核染色。假手术组大鼠脑组织皮质区可见极少数凋亡神经细胞；模型组大鼠可见凋亡数目增加；巴豆霜组、SP600125组、巴豆霜+SP600125组大鼠脑组织皮质区凋亡数目减少，见图9。

2.2.4 巴豆霜对脑缺血再灌注损伤大鼠缺血侧皮质区脑细胞凋亡的影响与假手术组相比，模型组的细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，巴豆霜组、SP600125组、巴豆霜+SP600125组的细胞凋亡率显著降低(P < 0.001)，见图10。

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引言

巴豆(Croton tiglium)为大戟科植物巴豆树的干燥成熟果实，其主要成分有巴豆苷(C10H13N5O5)[1-4]，具有抗炎、泻下、镇痛、抗肿瘤、抗病原微生物以及免疫调节等药理作用[5]。古代医家运用巴豆治疗中风均有记载，如宋·唐慎微《证类本草》中：“治中风，巴豆七枚，去皮烂研。左涂右手心，右涂左手心……”；清·杨时泰《本草述钩元》：“治中风痰厥气厥中恶喉痹，一切急病……以巴豆研烂，绵纸包，压取油……即时出涎或恶血，便苏”[6]。从古代文献记载可知，巴豆治疗中风的疗效是值得肯定的。近年来，巴豆霜对脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)的的神经保护作用逐渐受到人们的关注。基于网络药理学研究发现，网络拓扑分析和富集结果显示巴豆霜成分作用的核心靶点主要作用于神经系统[7]，且有研究表明，巴豆生物碱通过抑制炎症损伤、调控相关信号通路而抑制神经细胞凋亡等多种途径来治疗脑缺血再灌注损伤[8]。
课题组前期研究发现，巴豆霜干预后对脑缺血再灌注损伤大鼠具有保护作用[1，9]，证实巴豆霜能够使脑缺血再灌注大鼠缺血脑组织中ERK1/2、ERK5蛋白激酶的表达上调[10]，激活ERK1/2、ERK5信号通路，其激活对神经元细胞具有抗凋亡作用，并且能够促进神经元细胞增殖分化，表明巴豆霜可以改善神经功能缺损症状，达到脑神经保护作用。同为MAPK通路下游的ERK通路和JNK、p38通路，其在脑缺血再灌注损伤的神经细胞凋亡病理过程中分别发挥着抗凋亡和促凋亡的相反作用，即ERK通路的激活能够抗凋亡，而JNK、p38通路的激活却能促进凋亡。那么对于能够激活ERK通路、具有抗凋亡的巴豆霜，是否具有抑制JNK、p38通路的激活而发挥抗凋亡的协同效应呢？此次实验在进一步验证巴豆霜对脑缺血再灌注损伤大鼠具有神经保护作用的基础上，着重研究该作用与脑组织神经元凋亡及JNK/p38 MAPK信号通路的关系，探讨其作用机制，为脑缺血再灌注损伤的临床治疗提供更多的理论基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。组间比较进行单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 法。
1.2 时间及地点实验于2022年1-11月在宁夏医科大学动物实验中心和宁夏少数民族医药现代化教育部重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠210只，体质量260-280 g，宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(宁) 2020-0001。动物饲养于宁夏医科大学实验动物中心，通风良好，自由饮食饮水，适应性饲养1周后进行实验。
实验经过宁夏医科大学动物伦理委员会批准(批准号为IACUC-NYLAC-2022-010)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 药品、试剂与仪器巴豆由银川市第一人民医院药剂科提供，经银川市第一人民医院中医科首席专家贾孟辉教授鉴定为大戟科植物巴豆(Croton tiglium L)干燥成熟果实。将巴豆去皮研泥，内用滤纸外用纱布分层包裹，酒精灯烘烤后压榨去油制为巴豆霜，制霜在宁夏医科大学药学院老师的协助下完成，并达到此次实验用药标准。
尼莫地平片(30 mg/片，德国拜耳公司，批准文号：H2003010)；TTC染色液(R20618，源叶生物)；兔抗JNK单克隆抗体(9252T)、兔抗p-JNK单克隆抗体(9255S)、兔抗p38单克隆抗体(54470SF)、兔抗p-p38单克隆抗体(4511T)(Cell Signaling Technology )；兔抗Bax单克隆抗体(ab32503)、兔抗Bcl-2单克隆抗体(ab32124)(英国Abcam公司)；JNK抑制剂SP600125、p38 MAPK抑制剂SB203580(美国Selleck公司)；线栓(A5-263650，北京西浓科技有限公司)；TUNEL染色试剂盒(C1098，上海碧云天试剂公司)；ACEA NovoCyte流式细胞仪(美国艾森生物)。
1.4 实验方法
1.4.1 分组及给药
(1)第一部分：将90只雄性SD大鼠随机分为假手术组15只、模型组15只、巴豆霜低剂量组15只、巴豆霜中剂量组15只、巴豆霜高剂量组15只及尼莫地平组15只；筛选出巴豆霜最佳浓度为高剂量60 mg/kg。
(2)第二部分：再将120只SD大鼠重新造模，缺血2 h后取线栓实现再灌注，分为假手术组、模型组、巴豆霜组(60 mg/kg)、JNK抑制剂组(SP600125组)、巴豆霜+JNK抑制剂组(巴豆霜+SP600125组)、p38 MAPK抑制剂组(SB203580组)、巴豆霜+p38 MAPK抑制剂组(巴豆霜+SB203580组)及尼莫地平组(10.8 mg/kg)，每组15只。
造模成功后24 h开始灌胃。实验中巴豆霜剂量是依据课题组的国家自然科学基金项目中设定的剂量，低、中、高剂量相当于临床等效剂量的1，2，3倍。豆霜组按低剂量20 mg/kg，中剂量40 mg/kg，高剂量按60 mg/kg灌胃；假手术组和模型组给予等量生理盐水，灌胃剂量10 mL/kg，1次/d，连续给药7 d。在造模之前30 min，将10 μL SP600125和10 μL SB203580分别溶于1%二甲基亚砜，质量浓度为30 mg/mL，分别注射到大鼠侧脑室(囟门后1 mm，正中线左侧1 mm，硬膜下4 mm)。

1.4.2 模型制备采用LONGA法制备大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型[11]。术前禁食12 h，不禁水。3%异氟烷吸入麻醉大鼠后固定。对颈部中部进行常规消毒，并在纵向切开一个2 cm的切口。分离左侧颈总动脉、左侧颈内动脉和颈外动脉。然后，在颈内动脉和颈外动脉的分叉处结扎颈外动脉的分支和翼状动脉。靠近心脏的颈总动脉近端用尼龙钓线结扎。在结扎处的远端做一个小开口，方便线栓通过颈内动脉插入大脑中动脉，通过大脑中动脉阻塞诱发脑缺血。缺血2 h后取出线栓，重新缝合。假手术组仅分离出左侧颈总动脉，但不做任何处理。

1.4.3 大鼠神经功能评分在缺血2 h再灌注7 d 后，分别对每组大鼠进行神经功能缺损评分，评分方法采取盲法，参照Garica神经功能缺损评分表(表1)[12]，神经功能评分为0-18分，评分越高，说明神经功能损伤越严重，假手术组大鼠得分为0。

1.4.4 脑含水量测定在缺血2 h再灌注7 d 后，每组随机取6只大鼠，3%异氟烷麻醉后断头取脑放置于冰面上，用精密电子天平称量左脑和全脑的湿质量，并计算脑含水量。脑含水量(%)=[左侧脑组织湿质量-(全脑组织湿质量-左侧脑组织湿质量)]/(全脑组织湿质量-左侧脑组织湿质量)×100%。
1.4.5 TTC染色每组随机选取6只大鼠进行脑梗死体积测定。麻醉大鼠后断头取脑，去除嗅球、低位脑干和小脑，-20 ℃冰冻30 min后，于冰块上行连续6片冠状切片(2 mm)，将脑组织放置于2%的TTC染色液中，37 ℃避光水浴染色30 min，孵育期间定时翻动脑片，使其充分接触溶液。染色后经40 g/L多聚甲醛固定脑组织24 h，摄片。采用Adobe Photoshop CS5分析软件计算6片脑组织梗死体积之和，并计算梗死体积百分比，即脑梗死体积百分比=左侧脑梗死体积/全脑体积(%)。
1.4.6 苏木精-伊红染色将大鼠麻醉后，迅速断头取脑，置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定48 h，在冠状面由前向后将脑组织平均分成6份，每份脑组织厚度大约2 mm，依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋，蜡块凝固后，固定于石蜡切片机上连续切片(4 μm)，完成切片后，置于电热干燥箱中(65 ℃)烤片4-6 h，冷却后将石蜡切片依次脱蜡复水、苏木精染色、分化、返蓝、伊红染色、脱水、透明，中性树胶封固，光学显微镜下观察脑组织并拍照记录。
1.4.7 Nissl染色各组大鼠脑组织石蜡切片，经脱蜡、复水后，置于Nissl染色液中，室温下染色1 h，经分化液分化后，以无水乙醇脱水1 min，以二甲苯透明10 min，中性树胶封固，最后放于显微镜下观察脑组织并拍照。
1.4.8 Western blot 检测JNK/p38 MAPK信号通路及凋亡相关蛋白表达取大鼠缺血侧大脑皮质约100 mg，加入预冷的组织裂解液后进行研磨，充分裂解后，离心(12 000 r/min，10 min)后吸取上清液为总蛋白。另取脑组织，使用核质蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白。配制10%SDS-PAGE凝胶，分离80 μg蛋白上样，恒压电泳，电转，脱脂奶粉常温封闭2 h，PVDF膜与Bcl-2抗体( 1∶1 000) 、Bax抗体(1∶2 000)、JNK抗体(1∶1 000)、p-JNK抗体(1∶2 000)、p38 抗体(1∶2 000 )、p-p38抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。TBST漂洗(10 min×3次)后与Anti -beta Actin Rabbit pAb(1∶2 000)在37 ℃孵育1 h。TBST漂洗(10 min×3次)后凝胶成像仪扫描免疫印迹，并用软件(Image J)进行灰度分析。
1.4.9 TUNEL染色除SB203580组和巴豆霜+SB203580组外，将各组大鼠脑组织石蜡切片进行脱蜡复水后，加入50 μL蛋白酶K溶液，37 ℃恒温孵育15 min；用PBS洗涤3次，将蛋白酶K溶液清洗干净；样本上均匀滴加50 μL的TUNEL反应混合物，37 ℃避光孵育1 h；取出切片后PBS洗涤3次，滴加抗荧光淬灭封片液，封固，在荧光显微镜下观察脑组织。于20倍物镜下选择皮质区不重叠的5个视野拍照观察。
1.4.10 流式细胞术检测细胞凋亡情况除SB203580组和巴豆霜+SB203580组外，取各组大鼠缺血侧皮质区脑组织，将脑组织粉碎后加入胰蛋白酶进行消化，离心(3 500 r/min，15 min)，弃上清液后加入预冷的磷酸盐缓冲液，根据凋亡试剂盒说明书加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，避光反应15 min，上流式细胞仪进行检测。细胞凋亡率为 Q1+Q4 区细胞所占的比率(Q1 位于第一象限，表示晚期凋亡细胞；Q2 位于第二象限，表示机械损伤细胞；Q3 位于第三象限，表示正常细胞；Q4 位于第四象限，表示早期凋亡细胞)。
1.5 主要观察指标 ①大鼠神经功能缺损评分；②脑组织含水量；③脑梗死体积；④脑组织皮质区病理形态；⑤脑组织皮质区神经元损伤情况；⑥JNK/p38 MAPK信号通路及凋亡相关蛋白表达；⑦脑皮质区神经元凋亡情况；⑧缺血侧皮质区脑细胞凋亡情况。
1.6 统计学分析用Graphpad Prism 8软件进行数据处理及分析，各组数值以x±s表示，采用单因素方差分析进行组间比较，两两比较用LSD-t法，P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法经宁夏医科大学统计学专家审核。

讨论

脑卒中是一种急性脑血管疾病[13]，由于大脑血管突然破裂或血管阻塞导致大脑缺血缺氧而引发的脑组织损伤[14]，包括出血性卒中和缺血性卒中，而缺血性卒中占中国脑卒中的69.6%-70.8% [15]，其主要临床特征为神经功能损伤、肢体运动障碍、认知障碍以及言语障碍等[16]，具有高发病率、高致残率、高复发率及高死亡率等特点[17]。目前，及时使缺血区的血流恢复灌注是治疗缺血性卒中的首要方法。然而，脑缺血再灌注后可引起继发性损伤，导致更严重的神经损伤和脑功能障碍，即脑缺血再灌注损伤[18-19]。因此，寻求缓解缺血性脑卒中的有效方法和药物具有深远意义。巴豆治疗脑病历史悠久，作者所在的课题组长期研究宁夏经验要方失荅剌知丸中的君药巴豆霜对脑缺血再灌注损伤的影响，其主要成分包括生物碱类、有机酸类和二萜类，目前常用取仁蒸煮后去油制霜来降低毒性。
此次研究采用大鼠MCAO模型观察巴豆霜对脑缺血再灌注损伤的作用，结果显示巴豆霜干预不但能够改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能障碍及脑组织含水量，而且能够减小脑梗死体积，病理切片也能够表明巴豆霜可以明显改善脑缺血后脑组织病理形态，巴豆霜高剂量改善最明显，筛选出最佳剂量即巴豆霜高剂量(60 mg/kg)。说明巴豆霜的干预可能对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。
脑缺血再灌注损伤的病理过程与多个因素有关，包括细胞凋亡、炎症反应、氧化应激、细胞内钙过载、兴奋性氨基酸中毒和能量代谢障碍等[20]，其中神经细胞凋亡是导致脑缺血再灌注损伤的主要因素之一[21]。研究发现，当发生脑缺血再灌注损伤后，大脑损伤进一步加重并且出现大量凋亡细胞。Bcl-2家族在凋亡中起着至关重要的作用，其包括抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax[22]。Bcl-2是研究最广泛的抗凋亡基因[23]，其高表达可以防止细胞凋亡，最后改善缺血诱导的神经元凋亡[24]；而Bax可以激活线粒体膜上的离子通道，一些小分子物质如细胞色素C泄露到细胞质中，造成细胞损伤[25]。正常情况下，Bax/Bcl-2的比例保持在一定的范围内，当它们的比例失衡会导致细胞凋亡[26]。有研究表明，白藜芦醇可以上调Bcl-2和下调Bax的表达，抑制神经元的凋亡[27]。此次研究结果显示，巴豆霜高剂量组可以降低Bax/Bcl-2的表达，其与文献报道一致。TUNEL染色及流式细胞术结果显示，高剂量的巴豆霜能够抑制神经元的凋亡，说明巴豆霜可能通过抑制神经元凋亡从而改善大鼠脑缺血再灌注损伤。
相关研究表明，MAPK信号通路在脑缺血再灌注损伤中尤为重要[28]，调控脑缺血再灌注损伤后神经细胞的修复或凋亡[29]。在脑缺血再灌注损伤过程中，MAPK信号通路的相关蛋白JNK和p38几乎参与了脑缺血再灌注损伤的全部生理病理过程[30]，这些通路在调控细胞凋亡中至关重要。JNK/p38 MAPK信号通路的激活，可以诱导神经元凋亡的发生，而阻断该信号通路，有助于缓解脑缺血再灌注损伤[31]。有研究证明，全反式维甲酸通过抑制JNK和p38的磷酸化，降低p-JNK和p-p38的蛋白水平来保护大鼠脑缺血再灌注损伤[32]。抑制JNK/p38 MAPK信号通路的激活是没食子酸丙酯保护大鼠脑缺血再灌注损伤作用的主要机制[33]。此次研究发现，适当剂量的巴豆霜可降低p-JNK、p-p38水平，JNK抑制剂SP600125与p38 MAPK抑制剂SB203580处理对脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞的改善效果与巴豆霜高剂量处理呈现相似趋势，高剂量巴豆霜联合SP600125处理对脑缺血再灌注损伤诱导神经元细胞凋亡改善效果更加显著，说明巴豆霜对脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区神经元改善作用可能与调节JNK/p38 MAPK信号通路有关。
综上所述，巴豆霜对脑缺血再灌注损伤大鼠具有神经保护作用，适当剂量巴豆霜处理可以改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损症状，降低脑含水量，减轻脑梗死面积和神经元凋亡，该作用可能与抑制JNK/p38 MAPK信号通路的激活进而减少神经元凋亡有关，为临床治疗提供一定的理论基础，以及改变中药剂型做准备。此次研究的不足之处在于只在整体上进行了验证，并未在细胞实验上验证，在接下来的实验中进行更深入的研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

巴豆霜干预脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区JNK/p38 MAPK及神经元凋亡的机制

Effects of croton cream on JNK/p38 MAPK signaling pathway and neuronal apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion injury rats

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