蒙药额尔敦-乌日勒修复骨关节炎大鼠模型的机制

doi:10.12307/2023.953

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (8): 1193-1199.doi: 10.12307/2023.953

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蒙药额尔敦-乌日勒修复骨关节炎大鼠模型的机制

赵嘎日达，任逸众，韩长旭，孔令跃，贾岩波

内蒙古医科大学第二附属医院运动医学中心，内蒙古自治区呼和浩特市 010030

收稿日期:2022-09-19 接受日期:2022-12-26 出版日期:2024-03-18 发布日期:2023-07-18
通讯作者: 贾岩波，博士，副主任医师，副教授，硕士生导师，内蒙古医科大学第二附属医院运动医学中心，内蒙古自治区呼和浩特市 010030
作者简介:赵嘎日达，男，1980年生，内蒙古自治区呼和浩特市人，蒙古族，博士，医师，主要从事运动损伤相关研究。任逸众，男，1974年生，内蒙古自治区呼和浩特市人，汉族，博士，主任医师，教授，硕士生导师，主要从事运动损伤相关研究。
基金资助:
内蒙古自治区自然科学基金项目 (2020MS08121)，项目负责人：赵嘎日达

Mechanism of Mongolian Medicine Erden-uril on osteoarthritis in rats

Zhao Garida, Ren Yizhong, Han Changxu, Kong Lingyue, Jia Yanbo

Sports Medicine Center, the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2022-09-19 Accepted:2022-12-26 Online:2024-03-18 Published:2023-07-18
Contact: Jia Yanbo, MD, Associate chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Sports Medicine Center, the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Zhao Garida, MD, Physician, Sports Medicine Center, the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China Ren Yizhong, MD, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Sports Medicine Center, the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region, No. 2020MS08121 (to ZG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

蒙药额尔敦-乌日勒：可有效降低碘乙酸钠诱导的大鼠骨关节炎骨与软骨代谢指标和炎性指标，而这一变化与蒙药额尔敦-乌日勒用药剂量与用药时间长短有关联，剂量越大、用药时间越长，上述变化越明显。
骨关节炎：是一种关节软骨被侵蚀、骨质增生、软骨下骨硬化以及滑膜和关节腔的一系列病理生理改变而引起的骨关节退行性病变。

背景：传统蒙医临床应用蒙药额尔敦-乌日勒治疗骨关节炎的疗效肯定，但其治疗作用及相关机制尚不明确。

目的：观察蒙药额尔敦-乌日勒对大鼠骨关节炎的修复过程，分析其作用机制。
方法：将30只8周龄SD大鼠，采用单侧膝关节腔内注射碘乙酸钠溶液建立骨关节炎模型。造模 2周后，采用随机数字表法将大鼠分为3组：对照组(6只)灌胃给予生理盐水，低、高剂量组(各12只)分别灌胃给予蒙药额尔敦-乌日勒1.4，2 g，3次/d。连续给药2，4周后，取大鼠血液样本、关节软骨及关节周围骨质，检测软骨代谢标志物(软骨寡聚基质蛋白、蛋白聚糖)、骨代谢标志物(骨碱性磷酸酶、硫酸盐角蛋白)、炎性标志物(白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)、脂代谢标志物(总胆固醇、三酰甘油)等相关因子的变化，同时进行病理组织学观察。

结果与结论：①给药2，4周后的qRT-PCR检测结果显示，与对照组比较，低、高剂量组大鼠膝关节软骨组织中寡聚基质蛋白、蛋白聚糖及关节周围骨质中骨碱性磷酸酶、硫酸盐角蛋白的mRNA表达均显著降低(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，其中以高剂量组降低更显著；②给药2，4周后，与对照组比较，低、高剂量组大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平降低(P < 0.01，P < 0.001)，总胆固醇、三酰甘油水平升高(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，其中以高剂量组改善更显著；③苏木精-伊红染色显示，对照组大鼠膝关节软骨组织表层有较大缺损区，组织结构不明，炎症细胞浸润严重；低剂量组给药2周后大鼠膝关节软骨表面粗糙，细胞排列紊乱，软骨结构改善不明显，给药4 周后大鼠膝关节软骨炎性细胞减少，结构有所恢复；高剂量组给药2周后大鼠膝关节软骨组织结构较清晰，炎症明显减轻，给药4周后大鼠膝关节软骨组织结构更清晰；④结果表明，蒙药额尔敦-乌日勒有较好的抗炎及改善软骨代谢等功效，对大鼠骨关节炎有明显的改善作用。

https://orcid.org/0000-0002-5342-7505(赵嘎日达)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 蒙药, 额尔敦-乌日勒, 骨关节炎, 软骨代谢, 软骨损伤, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: The clinical application of Mongolian Medicine Erdun -uril in the treatment of osteoarthritis is effective, but its therapeutic effect and related mechanism are still unclear.
OBJECTIVE: To observe the repairing process of osteoarthritis in rats by Mongolian Medicine Erdun-uril and analyze its mechanism.
Methods: Thirty male Sprague-Dawley rats (8 weeks of age) were selected to establsih an osteoarthritis model using intraarticular injection of sodium iodoacetate solution into the unilateral knee joint. Two weeks after modeling, the model rats were randomly divided into three groups: control group (n=6) was given normal saline by gavage, and low and high dose groups (n=12 per group) were given Erdun-uril 1.4 and 2 g, respectively, 3 times per day. After 2 and 4 weeks of continuous administration, blood samples, articular cartilage and periarticular bone tissue were taken from rats to detect changes in cartilage metabolic markers (cartilage oligomeric matrix protein, proteoglycan), bone metabolic markers (bone alkaline phosphatase, keratan sulfate), inflammatory markers (interleukin 6, tumor necrosis factor α), lipid metabolic markers (total cholesterol, triacylglycerol). Histopathological changes were also observed.
ResultS and CONCLUSION: qRT-PCR results showed that after 2 and 4 weeks of administration, the mRNA expression of cartilage oligomeric matrix protein, proteoglycan and bone alkaline phosphatase and keratan sulfate in knee cartilage of rats were significantly reduced in the low and high dose groups compared with the control group (P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001), with the reduction being more significant in the high dose group. After 2 and 4 weeks of administration, compared with the control group, serum tumor necrosis factor α and interleukin 6 levels were decreased (P < 0.01, P < 0.001) and total cholesterol and triacylglycerol levels were increased (P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001) in the low and high dose groups, with the improvement being more significant in the high dose group. Hematoxylin-eosin staining results showed that in the control group, there were large defective areas on the surface of the knee cartilage with unknown structure and severe inflammatory cell infiltration; in the low dose group, the surface of the knee cartilage was rough with disordered cell arrangement and the cartilage structure did not improve significantly after 2 weeks of administration, while the number of inflammatory cells in the knee cartilage was reduced and the cartilage structure was restored to some extent after 4 weeks of administration; in the high dose group, the structure of the knee cartilage become clear after 2 weeks of administration and even clearer after 4 weeks of administration, and the inflammation was significantly reduced after 2 weeks of administration. To conclude, Mongolian Medicine Erdun-uril with better anti-inflammatory properties can improve cartilage metabolism and obviously alleviate osteoarthritis in rats.

Key words: Mongolian Medicine, Erden-uril, osteoarthritis, cartilage metabolism, cartilage damage, rat

中图分类号:

赵嘎日达, 任逸众, 韩长旭, 孔令跃, 贾岩波. 蒙药额尔敦-乌日勒修复骨关节炎大鼠模型的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1193-1199.

Zhao Garida, Ren Yizhong, Han Changxu, Kong Lingyue, Jia Yanbo. Mechanism of Mongolian Medicine Erden-uril on osteoarthritis in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(8): 1193-1199.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 30只大鼠全部进入结果分析。
2.2 各组大鼠骨与软骨代谢标志物比较给药2周后，各组大鼠膝关节软骨组织中软骨寡聚基质蛋白、蛋白聚糖及关节周围骨质中骨碱性磷酸酶、硫酸盐角蛋白的mRNA表达水平，见图1。qRT-PCR检测结果显示，与对照组相比，低、高剂量组大鼠膝关节软骨组织中寡聚基质蛋白、蛋白聚糖及关节周围骨质中骨碱性磷酸酶、硫酸盐角蛋白的mRNA表达水平均显著降低(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，其中以高剂量组降低更显著。

给药4周后，各组大鼠膝关节软骨组织中寡聚基质蛋白、蛋白聚糖及关节周围骨质中骨碱性磷酸酶、硫酸盐角蛋白的mRNA表达水平，见图2。qRT-PCR检测结果显示，与对照组相比，低、高剂量组大鼠关节软骨组织中寡聚基质蛋白、蛋白聚糖及关节周围骨质中骨碱性磷酸酶、硫酸盐角蛋白的mRNA表达水平均显著降低(P < 0.01，P < 0.001)，其中以高剂量组降低更显著。

2.3 各组大鼠血清炎性标志物及脂代谢情况比较给药2，4周后，各组大白鼠血清中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、总胆固醇、三酰甘油水平检测结果，见图3，4。

给药2周后，与对照组相比，低、高剂量组大鼠血清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平均显著降低(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，总胆固醇、三酰甘油水平均显著升高(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，其中以高剂量组变化更显著。给药4周后，与对照组相比，低、高剂量组大鼠血清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平均显著降低(P < 0.01，P < 0.001)，总胆固醇、三酰甘油水平均显著升高(P < 0.01，P < 0.001)，其中以高剂量组改善更显著。
2.4 各组大鼠膝关节软骨结构变化各组大鼠膝关节软骨组织苏木精-伊红染色结果，见图5。对照组大鼠膝关节软骨组织表层有较大缺损区，组织结构不明，炎症细胞浸润严重。低剂量组给药2 周后大鼠膝关节软骨表面粗糙，细胞排列紊乱，软骨结构改善不明显；给药4 周后大鼠膝关节软骨炎性细胞减少，结构有所恢复。高剂量组给药2 周后大鼠膝关节软骨组织结构较清晰，炎症明显减轻；给药4 周后大鼠膝关节软骨组织结构更清晰。

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引言

骨关节炎是一种关节软骨被侵蚀、骨质增生、软骨下骨硬化以及滑膜和关节腔的一系列病理生理改变而引起的骨关节的退行性病变[1-2]。随着老年人口的增加，骨关节炎患者数量在逐年上升，给患者家庭和社会造成严重经济负担。王斌等[3]对中国77 957例膝骨关节炎患者进行的综合分析显示，膝骨关节炎总患病率为18%，其中男性占11%，女性占19%。XIE等[4]报道在老年群体当中，骨关节炎的发病率高且与其肥胖度密切相关。在骨关节炎的发病部位中，以膝、髋等大关节最容易累及。在西医治疗骨关节炎方面，应用非类固醇抗炎药的内服及外用或糖皮质激素关节腔内注射等方法，虽然疼痛缓解效果佳，但很大程度上存在不良反应及安全隐患。目前国际上对该病的发病机制尚未有准确的定论，临床上虽然有多种多样的治疗手段，但缺乏公认的有效药物，因此发病机制的进一步研究及研发有效的治疗药物是十分必要的。骨关节炎目前所公认的病因有肥胖、遗传因素、年龄、炎症及创伤等，以上因素的共同作用导致关节软骨退变是骨关节炎发病机制的核心环节[5-7]。因此，如何维持软骨细胞的生存是防治骨关节炎的关键之一。
蒙医药学是蒙古族人民在长期的游牧生活中逐渐摸索出来的具有鲜明的民族特色和独特理论体系的民族传统医学。蒙医传统理论认为，骨关节炎属于蒙医“协日乌素病”范畴，是“协日乌素”增多，与“巴达干”“琪索”相协，汇聚于关节及其周围，使其周围气血循环受阻而引起的局部红肿、热痛、功能障碍等为主要症状、体征的病症[8]。
蒙药额尔敦-乌日勒，别名索布德乌日勒(珍珠丸)、桑丕勒诺日布等，在《中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册》(中华人民共和国卫生部药典委员会编1998年版)里，额尔敦-乌日勒还称为珍宝丸或如意珍宝丸[9]。蒙古族人民在长期的实践中证明，蒙药额尔敦-乌日勒具有除“协日乌素”、舒筋活络、抗炎镇痛、降血脂、清陈热、安神等功效，临床上主要用于治疗骨关节炎、骨质疏松、脂代谢异常疾病、心脑血管疾病、神经系统疾病等多种病症，且获得了满意的疗效[8-10]。ASGHAR等[11]的一项回顾性研究指出，骨关节炎是最常见的肌肉骨骼系统疾病，虽然关节软骨变性是其关键的特征，但其越来越被认为是整个机体复杂病变过程在关节部位的体现。蒙药额尔敦-乌日勒由多种名贵的动植物药材组成，含多种对身体有利的活性成分，可同时作用于多个信号通路多个靶点，这也符合蒙药多靶点作用特点，将人体视为一个整体来进行调理的理论，充分体现了传统蒙药的优势。传统蒙医临床应用本方治疗骨关节炎，疗效肯定，但其治疗作用及相关机制尚不明确。从作用机制来看，仍有很多蛋白和通路需要进一步的考证，确定其活性成分及作用，为骨关节炎的临床治疗提供理论依据。实验从蒙药额尔敦-乌日勒的抗炎、降脂、骨与软骨修复作用等方面入手，分析大鼠骨关节炎治疗过程中蒙药额尔敦-乌日勒的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计完全随机对照动物实验，分子生物学分析，组间比较采用t检验和方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年11月至2022年4月在南京贝林格生物医药研究院(南京)有限公司动物实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物及分组选用无特定病原体的雄性SD大鼠30只，8周龄，体质量220-250 g，购自常州卡文斯实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK(苏)2016-0010。大鼠适应性饲养1周后开始实验。所有大鼠在温度、湿度可控，12 h明暗循环的环境下，用基础饲料喂养，自由活动、饮水和摄食。采用单侧膝关节腔内注射碘乙酸钠溶液建立骨关节炎模型，造模 2周后，采用随机数字表法将30只大鼠分为3组：对照组(6只)及低、高剂量组(各12只)。动物实验获得内蒙古医科大学第二附属医院伦理委员会批准，伦理决议编号：EFY20200032。
1.3.2 主要仪器和试剂蒙药额尔敦-乌日勒(内蒙古自治区国际蒙医医院蒙药制剂中心)；生理盐水(安徽双鹤药业)；碘乙酸钠(美国Gibco，10888022)；大鼠白细胞介素6 ELISA试剂盒(北京Solarbio，SEKR0005)；大鼠肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒(北京Solarbio，SEKR0009)；三酰甘油试剂盒(北京Solarbio，BC0620)；总胆固醇试剂盒(北京Solarbio，BC1980)；多聚甲醛(上海阿拉丁，30525-89-4)；EDTA脱钙液(武汉博士德，AR1071)；PBS(0.01 mol/L，自行配制)；切片石蜡(北京索莱宝，YA0011)；二甲苯(上海国药集团化学试剂，10023418)；无水乙醇(上海国药集团化学试剂，10009218)；苏木精-伊红染色试剂盒(上海碧云天生物，C0105M)；中性树胶(北京索莱宝，G8590)。
超纯水仪(美国密理博公司，Milli-Q synthesis)；4 ℃冰箱(青岛Haier集团，BCD-416)；-80 ℃超低温冰箱(澳柯玛AUCMA，DW-86L500)；离心机(美国Eppendorf，5417R)；涡旋混合器(天悦电子，TYXH-II)；37 ℃孵育箱(北京福意联医疗设备，FYL-YS-50LK)；水浴锅(姜堰市天力医疗器械厂有限公司，TL-420D)；酶标仪(美国ThermoFisher，Multiskan 51119000)；组织脱水机(上海徕卡仪器有限公司，ASP300)；全自动包埋机(上海徕卡仪器有限公司，EG1140H)；石蜡切片机(上海徕卡仪器有限公司，RM2235)；摊片机(上海徕卡仪器有限公司，HI1210)；烤片机(上海徕卡仪器有限公司，HI1220)；烘箱(上海福玛实验设备有限公司，DGX-9003B)；光学显微镜(日本奥林巴斯，BX51)。
1.4 方法

1.4.1 动物造模及蒙药额尔敦-乌日勒干预大鼠适应性喂养1周后，按照TAKAHASHI等[12]报道的方法建立骨关节炎模型。取3组大鼠，单侧膝关节腔内注射30 µL的碘乙酸钠溶液(1 mg碘乙酸钠溶于30 µL生理盐水中)，1次/d，连续注射7 d。注射7 d后，适应性喂养大鼠1周，对照组灌胃给予生理盐水5 mL，低、高剂量组分别灌胃给予1.4，2 g蒙药额尔敦-乌日勒(将1.4，2 g的蒙药额尔敦-乌日勒捣碎后制成5 mL糊剂)，3次/d。

1.4.2 取材对照组连续灌胃1周后腹腔注射戊巴比妥钠处死，低、高剂量组连续灌胃给药2，4周后各处死6只大鼠，采集大鼠血液、关节软骨、关节周围骨质等标本，检测软骨代谢标志物(软骨寡聚基质蛋白、蛋白聚糖)、骨代谢标志物(骨碱性磷酸酶、硫酸盐角蛋白)、炎性标志物(白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)、脂代谢标志物(总胆固醇、三酰甘油)等相关因子的变化，同时苏木精-伊红染色观察骨软骨组织的病理结构变化。

1.4.3 qRT-PCR检测软骨代谢标志物与骨代谢标志物的表达用分析天平分别称取50 mg大鼠关节软骨、关节周围骨质标本，放入干净无酶的2 mL离心管中，加入1 000 μL的Trizol，用匀浆机匀浆；向离心管内加入200 μL氯仿，剧烈振荡30 s后于室温放置5 min；4 ℃下12 000×g离心15 min，将上清液转移到新的2 mL离心管中；向离心管中加入等体积的异丙醇(-20 ℃预冷)，上下颠倒混匀几次后于室温放置10 min；4 ℃下12 000×g离心15 min，使RNA充分沉淀；然后水解RNA，使用分光光度计检测核糖核酸浓度和纯度，当A260/A280在1.8-2.0之间时说明核糖核酸质量较好；随后进行反转录反应。进行荧光定量聚合酶链反应，反应体系：cDNA 2 µL，PCR上游引物(10 µmol/L) 0.4 µL，PCR下游引物(10 µmol/L) 0.4 µL，SYBR Green solution 10 µL，灭菌双蒸水7.2 µL，总量20 µL；反应条件：预变性95 ℃30 s；变性95 ℃5 s，退火55 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，40个循环；熔解曲线：95 ℃15 s，60 ℃15 s，95 ℃15 s。反应结束后，由熔解曲线分析确认聚合酶链反应产物特异性，有无杂带、引物二聚体。所得各样品Ct值通过公式2-ΔΔCt法计算出各样品信使核糖核酸的相对表达量。引物序列见表1。

1.4.4 大鼠血清中炎性标志物及脂代谢标志物水平检测

炎性标志物：将冻存的大鼠血清样本提前12 h从-20 ℃低温冰箱中取出，然后置于4 ℃冰箱复温12 h，依次进行试剂回温、配制洗涤液、标准品梯度稀释、生物素化抗体工作液配制、酶结合物工作液配制及酶标板洗涤；加入100 μL标准品及检测样本至反应孔中，封板后于37 ℃孵箱孵育90 min，之后拍板、洗板4次；加入100 μL生物素化抗体工作液至反应孔中，封板后于37 ℃孵箱孵育60 min，之后拍板、洗板4次；加入100 μL酶结合物工作液至反应孔中，封板后于37 ℃孵箱孵育30 min，之后拍板、洗板5次；加入100 μL显色底物至反应孔中，封板后于37 ℃避光显色15 min；加入50 μL终止液，即刻用酶标仪450 nm波长下测量吸光度值(5 min内)。以标准品吸光度值为横坐标，标准品浓度为纵坐标，用软件绘制标准曲线，样品含量可通过对应吸光度值由标准曲线换算出相应的浓度。
总胆固醇水平检测：将冻存的大鼠血清样本提前12 h从-20 ℃低温冰箱中取出，然后置于4 ℃冰箱复温12 h；按照试剂盒说明书操作配制提取液、标准品、工作液等试剂，进行标准品梯度稀释；在1.5 mL离心管中依次加入下列试剂，标准管：100 μL标准液+900 μL工作液，空白管：100 μL提取液+900 μL工作液，测定管：100 μL样本+900 μL工作液，充分混匀，37 ℃静置15 min，反应完成后于1 mL玻璃比色皿，测定500 nm处吸光度值(分别记为A测定管、A标准管和A空白管，ΔA=A测定管-A空白管，ΔA标准=A标准管-A空白管)。以各个标准溶液的浓度为y轴，其对应的ΔA标准为x轴，绘制标准曲线，得到标准方程式，将ΔA带入方程得到测定管样本浓度(μmol/mL)。
按样本质量计算：总胆固醇含量(μmol/g)=样本浓度×V提取/W=样本浓度/W(W：样本质量)。
三酰甘油水平检测：将冻存的大鼠血清样本提前12 h从-20 ℃低温冰箱中取出，然后置于4 ℃冰箱复温12 h；按照试剂盒说明书操作配制标准品、试剂等；分光光度计预热30 min，调节波长到420 nm，蒸馏水调零；水浴锅预热到65 ℃，在空白管、标准管、测定管加入相应试剂，剧烈振荡30 s，静置3-5 min后再剧烈振荡30 s，如此反复3次，常温静置一定时间分层后取上层溶液75 μL，置于新微型离心管中；加入相应试剂后充分混匀，65 ℃水浴15 min，冷却；于420 nm处比色，记为A空、A标和A测。三酰甘油质量浓度=C标准品×V×(A测-A空)/(A标-A空)/W=(A测-A空)/(A标-A空)/W。其中，C标准品=1 mg/mL，W为样本质量，V为加入试剂一的体积1 mL。
1.4.5 苏木精-伊红染色所有大鼠膝关节软骨组织固定、脱水、包埋好后进行切片，二甲苯Ⅰ脱蜡 5 min→二甲苯Ⅱ脱蜡 5 min→二甲苯Ⅲ脱蜡 5 min→甲苯Ⅳ脱蜡 5 min→梯度乙醇脱水→自来水洗涤 3 次→苏木精染色 5-10 min→自来水洗片 3 次→1%盐酸乙醇分化 5-10 s→自来水水洗 3 次→37 ℃恒温水浴箱中返蓝10 min→伊红染色2.0-3.0 min→自来水快速清洗→体积分数80%乙醇脱水 10 s，最后进行封固处理。

1.5 主要观察指标各组大鼠软骨代谢标志物(软骨寡聚基质蛋白、蛋白聚糖)、骨代谢标志物(骨碱性磷酸酶、硫酸盐角蛋白)、炎性标志物(白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)、脂代谢标志物(总胆固醇、三酰甘油)等相关因子的变化，以及关节软骨、关节周围骨质病理组织学观察。

1.6 统计学分析实验获得数据采用平均数±标准误表示，所有的数据均使用GraphPad Prism 6处理及统计分析。两组样本均值之间的比较采用t检验，多组样本均值之间的比较采用方差分析，P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经内蒙古师范大学数学科学学院统计学系布和额尔敦教授审核。

讨论

相关调查研究显示，骨关节炎的发生常与生活环境、生活习惯、人种、年龄、性别、肥胖、遗传易感性、创伤、下肢力线改变和机械负荷等因素有关，上述高危因素相互交错，加速关节的退变，从而产生一系列临床症状[13-15]。关节软骨衰老和凋亡是骨关节炎发病过程中的核心环节[5-7]，因此，如何保存软骨细胞是防治骨关节炎的关键之一。近年来，越来越多关于骨关节炎的研究把目光锁定在中医药领域。软骨细胞自噬水平在关节软骨细胞的新陈代谢中非常关键，使软骨维持在正常水平并延缓骨关节炎的发展。目前生物碱类、皂苷类、多糖类、多酚类、类固醇类、萜类、黄酮类、香豆素类等中药有效成分，可通过调节丝裂原活化蛋白激酶、核因子κB、Wnt/β连环蛋白、磷脂酰肌醇-3-蛋白激酶等信号通路延缓骨关节炎的进展。皂苷类、生物碱类化合物还可上调Bcl-2/Bax蛋白比值，从而阻止软骨细胞衰老凋亡，达到防止软骨细胞变性的目的[16-17]。但目前通过中医药调控来治疗骨关节炎这一途径还未成熟，尽管对一些调控因子以及信号通路的研究已经取得一定进展，但还未找到一种靶点药物来干预软骨细胞凋亡。传统蒙医药(包括按摩、针灸及其他一些特殊疗法)也可提高软骨细胞活性，缓解骨关节炎症状，延缓其发展，但是蒙药的研发相对于中药以及其他民族医药进展缓慢，尤其是蒙药的作用机制方面缺乏系统性的深入研究。
前期研究证明，股骨头坏死晚期骨关节炎患者的关节液中骨和软骨代谢标志物基质金属蛋白酶3、骨碱性磷酸酶、硫酸盐角蛋白水平明显高于先天性髋关节发育不良患者，证明股骨头坏死发展的各个过程中骨与软骨代谢非常活跃，并贯穿整个发病过程，阐述了骨与软骨代谢是骨关节炎发展的伴随者和积极参与者[18]。软骨寡聚基质蛋白、蛋白聚糖、骨碱性磷酸酶、硫酸盐角蛋白是公认的骨与软骨代谢标志物，蛋白聚糖是主要的细胞外基质成分，几乎存在于所有哺乳动物细胞表面，蛋白聚糖的多功能性质主要是由其各自的硫酸糖胺聚糖链基团介导的，其中主要成分是硫酸盐角蛋白，说明在关节炎的发展过程中硫酸盐角蛋白和蛋白聚糖是相辅相成的关系[19]。COPPELMAN等[20]用酶联免疫吸附法测得马跗跖关节滑液中骨代谢标志物骨碱性磷酸酶的值明显高于对照组，证明骨碱性磷酸酶值与骨关节炎严重程度呈正相关。关于膝骨关节炎的病例随机对照研究报道，软骨寡聚基质蛋白浓度与患者年龄呈正相关，表明软骨寡聚基质蛋白在关节炎患者的关节液中明显升高，与膝关节骨性关节炎的分级显著相关，且与骨性关节炎的严重程度呈正相关[21]。MALY等[22]的实验研究证明，软骨寡聚基质蛋白可以吸引软骨细胞，通过促进了Ⅱ、Ⅸ、Ⅻ胶原蛋白的合成而抑制Ⅰ和Ⅹ胶原蛋白的合成，从而有助于损伤软骨区域的再生，保护软骨细胞表型稳定。蛋白聚糖合成和降解失去平衡是骨关节炎发生发展过程中必不可少的程序，而识别和降解蛋白聚糖的药物可能有利于骨关节炎的治疗[23]。此次实验中，蒙药额尔敦-乌日勒干预之后关节炎大鼠的膝关节软骨结构有明显的改善，并且血清中软骨寡聚基质蛋白、蛋白聚糖、骨碱性磷酸酶、硫酸盐角蛋白等软骨及骨代谢标志物都有明显降低，而且这一变化与给药时间长短及药物剂量有明显的相关性。此次实验结果再次证明，骨与软骨代谢是关节炎发展过程中的主要环节之一，且蒙药额尔敦-乌日勒有延缓甚至改善软骨代谢的作用，蒙药额尔敦-乌日勒干预之后的软骨组织病理切片结果也能证明这一点。
潘建科等[24]报道龙鳖胶囊可降低关节炎大鼠白细胞介素1β、白细胞介素6等炎性细胞因子的表达，抑制关节炎大白鼠软骨和滑膜中P38 MAKP和核因子κB信号通路的活化，缓解炎性反应，亦可通过调控 toll样受体4/髓样分化因子88信号通路抑制干扰素调节因子7异常表达，使白细胞介素6分泌水平下降，从而减少基质金属蛋白13的表达，缓解炎症并延缓关节破坏，进而发挥治疗关节炎的作用。SIU等[25]报道，白芍、牛膝、杜仲、补骨脂为主要成分的中药糊剂通过核因子κB通路抑制IκB激酶的磷酸化和环氧合酶2蛋白表达，证实了该中药糊剂减轻骨关节炎炎症反应从而起到了局部疼痛抑制延缓关节炎发展。大量报道证明炎性标志物与关节炎的发生、发展有着密不可分的关系，在关节炎的进展过程中扮演着举足轻重的角色[26-28]。白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等炎性因子可诱发脂代谢异常，血脂变化与炎症程度密切相关，且在关节炎软骨退变过程中起着重要的作用[29-31]。有研究报道，高脂血症的骨关节炎患者关节滑液中炎性因子、趋化因子明显高于对照组，表示高脂血症与骨关节炎有相关性，而慢性炎症又可以引起血脂代谢紊乱[32-34]。胆固醇可诱导小鼠软骨自发性损伤，引起膝关节脂肪垫脂肪组织代谢紊乱从而产生炎性因子，促进膝骨关节炎的发展[35]。但也有一些流行病学研究报道指出，高脂血症并不会增加骨关节炎的发病率[36]。
前期研究证实，他汀类降脂药能够有效预防激素性股骨头坏死的发病率及骨关节炎的进展[37-38]，因此，作者推测蒙药额尔敦-乌日勒能够有效预防和治疗骨关节炎，不但与调节骨与软骨代谢有关联，也可能与它的降血脂、抗炎等作用有关联。此次实验结果表明，关节炎大鼠血清白细胞介素6、肿瘤坏死因子α水平在蒙药额尔敦-乌日勒干预之后有明显降低，表明蒙药额尔敦-乌日勒具有潜在的抗炎功效。同时血清中总胆固醇、三酰甘油有不同程度的升高，且随着给药时间延长，这一变化更加明显，这与以往蒙药额尔敦-乌日勒的相关文献不相符[8-10]。从这一结论推测，在骨关节炎的发生发展过程中炎症递质介导的影响因素可能是直接因素，随着蒙药额尔敦-乌日勒的干预，白细胞介素6、肿瘤坏死因子α水平有明显的减低趋势，最终的病理组织结果证明大鼠关节软骨有明显的修复现象。CHIU等[39]首次发现JAK抑制剂通过小核糖核酸-149-5p调节JAK1/肿瘤坏死因子α/白细胞介素6信号通路抑制骨关节炎进一步恶化，而JAK抑制剂的主要用途是筛选血液系统疾病及类风湿性关节炎等疾病的治疗药物，蒙药额尔敦-乌日勒也是治疗血液系骨统疾病、骨关节炎等的常规药物，而具体的药理机制还不清楚，需要进一步的实验来证明。此次实验结果显示，总胆固醇和三酰甘油水平随着蒙药额尔敦-乌日勒用药时间的延长而逐渐升高。关于血脂与骨关节炎发病之间的关系，有很多相互矛盾的结果。现代医学认为骨关节炎是多种代谢综合征共同存在的结果，然而，对于这些代谢改变在骨关节炎进展中的具体作用知之甚少。有研究报道，在体质量指数大于45 kg/m2的人当中，体内脂肪细胞释放前列腺素E2的量显著增大，高脂血症的膝关节炎患者膝关节脂肪垫中微粒体前列腺素E2合成酶1表达增加了1倍，也有动物实验证实，抑制微粒体前列腺素E2合成酶1可以缓解犬骨关节炎模型的疼痛[35，40]。而蒙药额尔敦-乌日勒关于降血脂、防止骨关节炎的药理机制尚不清楚，需要进一步的研究来证实这一点，并阐明是如何影响骨关节炎发病过程的。
蒙药额尔敦-乌日勒是个经典的蒙药方剂，是蒙医药领域的璀璨明珠，有着悠久的历史和实际使用记载，但相关的研究还仅处在临床疗效观察及药物成分分析等水平，远远达不到中医药及其他民族医药的研究层次，需要更深入、系统地研究其药物活性成分及相关作用机制，为这一经典蒙药方剂的临床应用提供科学的实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

蒙药额尔敦-乌日勒修复骨关节炎大鼠模型的机制

Mechanism of Mongolian Medicine Erden-uril on osteoarthritis in rats

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