早期创伤性膝骨关节炎动物模型构建方案的比较

doi:10.12307/2024.275

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (4): 542-549.doi: 10.12307/2024.275

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

早期创伤性膝骨关节炎动物模型构建方案的比较

刘宇涵1，樊渝江1，2，王启光2

1广西医科大学再生医学与医用生物资源开发应用省部共建协同创新中心，广西壮族自治区南宁市 530021；2四川大学生物材料中心，四川省成都市 610064

收稿日期:2023-02-25 接受日期:2023-04-04 出版日期:2024-02-08 发布日期:2023-07-14
通讯作者: 樊渝江，男，教授，博士生导师，广西医科大学再生医学与医用生物资源开发应用省部共建协同创新中心，广西壮族自治区南宁 530021；四川大学生物材料中心，四川省成都市 610064
作者简介:刘宇涵，男，1994年生，辽宁省锦州市人，汉族，主要从事骨关节炎方向的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(32071353)，项目名称：基于单细胞封装的软骨细胞周基质(PCM)仿生构建及其作用机理研究，项目负责人：王启光

Comparison of protocols for constructing animal models of early traumatic knee osteoarthritis

Liu Yuhan1, Fan Yujiang1, 2, Wang Qiguang2

1Province-Ministry Collaborative Innovation Center for Regenerative Medicine and Medical Bioresource Development and Application, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Center for Biomaterials, Sichuan University, Chengdu 610064, Sichuan Province, China

Received:2023-02-25 Accepted:2023-04-04 Online:2024-02-08 Published:2023-07-14
Contact: Fan Yujiang, Professor, Doctoral supervisor, Province-Ministry Collaborative Innovation Center for Regenerative Medicine and Medical Bioresource Development and Application, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Center for Biomaterials, Sichuan University, Chengdu 610064, Sichuan Province, China
About author:Liu Yuhan, Province-Ministry Collaborative Innovation Center for Regenerative Medicine and Medical Bioresource Development and Application, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 32071353 (to WQG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

前交叉带横断手术：通过手术横断前交叉韧带会引起胫骨上前方不稳及膝关节旋转稳定性的降低，术后辅以过量运动加重关节力学改变，由于关节力学改变和炎性结合作用诱发骨关节炎。由于前交叉韧带损伤也是目前骨关节炎的重要诱因之一，目前研究也将该法作为骨关节炎手术造模方案的选择之一。
内侧半月板前角切除手术：通过手术切除内侧半月板前角将引起膝关节内关节面失去原有的光滑面，加重关节面摩擦，诱发骨关节炎。该手术通常与前交叉带横断手术联合开展，以达到在关节失稳的前提下进一步加重关节软骨摩擦，从而加速骨关节炎的形成，也是目前骨关节炎研究的常用造模方案之一。在手术实施上，由于完整剔除内侧半月板前角需要暴露更大范围术野且切除范围相对较大，更容易造成其他副损伤，导致造模效果差异性较大，所以该法需要更高的手术技巧。

背景：现有骨关节炎的有创造模方法包括前交叉韧带横断手术和前交叉韧带横断联合内侧半月板前角切除手术，前交叉韧带横断术后需要过量运动，而完整切除内侧半月板前角可能造成副损伤并增加造模结果的差异性，对术者手术技巧要求较高。

目的：对传统的骨关节炎有创造模手段进行改良和简化，并比较不同方案在无高负荷运动环境下的造模效果。
方法：采用随机数字表法将48只SD大鼠分为4组，每组12只：假手术组完全暴露左侧后肢膝关节腔后缝合关节腔及皮肤；横断组、横断+切除组、横断+撕裂组左侧后肢分别进行前交叉韧带横断手术、前交叉韧带横断联合内侧半月板前角切除手术、前交叉韧带横断联合内侧半月板前角撕裂手术。术后4周取膝关节标本，进行大体、X射线片、CT扫描、病理组织切片观察及PCR检测。

结果与结论：①大体观察：横断组可见半月板处轻度磨损；横断+撕裂组可见外侧髁关节面严重磨损、内侧髁关节面轻度磨损、半月板严重磨损，内侧半月板全层磨损；横断+切除组可见外侧髁关节面严重磨损、内侧髁关节面轻度磨损、半月板内侧前角缺如，半月板磨损面积> 50%；②X射线片与CT扫描：4组无明显差异，其中3个手术组可见胫骨前移，横断+切除组内侧半月板前角缺失；③病理组织切片观察：苏木精-伊红、甲苯胺蓝、天狼猩红染色显示，假手术组与横断组关节面光滑平整；横断+撕裂组、横断+切除组可见明显的软骨损伤及基质降解，其中横断+撕裂组软骨损伤及基质降解情况较轻；④PCR检测：横断+撕裂组、横断+切除组白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3的mRNA表达量高于假手术组、横断组(P < 0.05)，聚集蛋白聚糖的mRNA表达量低于假手术组、横断组(P < 0.05)；横断+切除组白细胞介素6、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3的mRNA表达量高于横断+撕裂组(P < 0.05)；⑤单纯的前交叉韧带横断手术较难诱发明显的骨关节炎，前交叉韧带横断联合内侧半月板前角切除或者内侧半月板前角撕裂手术均能诱发明显的骨关节炎，且造模效果相近。

https://orcid.org/0009-0006-1321-9919(刘宇涵)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, 前交叉韧带横断术, 内侧半月板失稳术, 创伤后骨关节炎, 实验造模

Abstract: BACKGROUND: Current osteoarthritis modeling methods include anterior cruciate ligament transection (ACLT) and ACLT combined with medial meniscal anterior horn resection. ACLT requires excessive postoperative exercise, which is time and labor-intensive. Complete removal of anterior horn of the medial meniscus can cause collateral damage and increase variability in modeling outcomes, requiring higher surgical skills from the surgeon.
OBJECTIVE: To modify and simplify the traditional method to create animal osteoarthritis model and compare osteoarthritis symptoms of different modeling methods under a low-load exercise environment.
METHODS: Forty-eight Sprague-Dawley rats were randomly assigned in four groups (n=12 per group): sham operation (complete exposure of the knee cavity of the left hind limb followed by suturing the joint cavity and skin), ACLT, ACLT+anterior horn resection (removal of the anterior horn of the medial meniscus) and ACLT+anterior horn tear (anterior horn tear of the medial meniscus). At 4 weeks after modeling, the rats were euthanized and their knee specimens were collected for gross observation, X-ray and CT scans, pathological observation, and PCR detection.
RESULTS AND CONCLUSION: Gross observation: Mild meniscal wear was observed in the ACLT group. In the ACLT+anterior horn tear group, severe wear of the lateral condyle articular surface, mild wear of the medial condyle articular surface, severe meniscal wear, and full wear of the medial meniscus were observed. The ACLT+resection group showed severe wear of the lateral condyle articular surface, mild wear of the medial condyle articular surface, absence of the anterior horn of the medial meniscus, and meniscus wear area > 50%. Imaging examinations showed no significant difference among the four groups. However, the anterior tibial translocation sign was observed in the three operation groups and the anterior horn of the medial meniscus was missing in the ACLT+anterior horn resection group. Histopathological section observation: Hematoxylin-eosin, toluidine blue, and Sirius red staining showed smooth joint surfaces in the sham operation group and ACLT group; cartilage damage and matrix degradation were evident in the ACLT+anterior horn tear and ACLT+anterior horn transection groups, with less cartilage damage and matrix degradation in the ACLT+anterior horn tear group. PCR results showed higher mRNA expressions of interleukin 1β, interleukin 6, interleukin 8, tumor necrosis factor α, matrix metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 3 and lower mRNA expressions of aggrecan in the ACLT+anterior horn tear group and ACLT+anterior horn resection group than in the sham operation group and ACLT group (P < 0.05). The mRNA expressions of interleukin 6, matrix metalloproteinase 1, and matrix metalloproteinase 3 were higher in the ACLT + anterior horn resection group than in the ACLT +anterior horn tear group (P < 0.05). To conclude, ACLT alone is less likely to induce osteoarthritis with obvious cartilage wear. ACLT combined with anterior horn resection or tear of the medial meniscus can induce obvious symptoms of osteoarthritis and achieve similar modeling effects.

Key words: osteoarthritis, anterior cruciate ligament transection, medial meniscus instability, post-traumatic osteoarthritis, experimental modeling

中图分类号:

刘宇涵, 樊渝江, 王启光. 早期创伤性膝骨关节炎动物模型构建方案的比较[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 542-549.

Liu Yuhan, Fan Yujiang, Wang Qiguang. Comparison of protocols for constructing animal models of early traumatic knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(4): 542-549.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析 48只大鼠全部进入结果分析，无脱失。
2.2 各组大鼠膝关节影像学检查结果目前常见的影像学评分如Fairbank评分及K&L评分，均为主观性评分，他们所包含的个别标准很难定义[18]。尽管目前K&L评分仍被认为是影像学评价骨关节炎进展程度的金标准，但其仍缺乏准确性，特别是在骨关节炎早期[18]，其对于骨关节炎的分级主要考虑以下4个指标：关节间隙、骨赘存在与否、软骨下硬化和骨畸形[19]。研究者普遍认为，站立位膝关节X射线片比仰卧位X射线片能更准确地反映关节软骨的损失，关节软骨损失是骨关节炎的一个标志[20-22]。但如果检测动物为大鼠，由于其并非直立行走，关节间隙无法因重力作用而出现狭窄，导致其关节间隙如图2A所示的衡量指标不具有特异性，此次实验4组大鼠膝关节下X射线片无明显差异。
CT扫描结果如图2B-D所示，横断+切除组内侧半月板前角缺如，横断组、横断+切除组、横断+撕裂组均可见胫骨前移，说明前交叉韧带被完全横断，图中未见其他骨组织损伤，说明以上造模方案均无副损伤，并达到手术预期损伤效果。

2.3 各组大鼠膝关节大体观察结果大体观察选择了3个关节软骨磨损的易发区域：内外侧髁髌面、内外侧髁以及半月板，并观察是否出现骨赘，如图3所示。假手术组内外侧髁髌骨面、关节面及半月板光滑，无磨损迹象；横断组内外侧髁髌骨面、关节面光滑，仅在半月板处见轻度磨损；横断+撕裂组内外侧髁髌面粗糙，外侧髁关节面可见较严重磨损，内侧髁关节面可见轻度磨损，单侧损伤面积> 25%，半月板磨损严重，内侧半月板全层磨损；横断+切除组内外侧髁髌面可见串珠样改变，外侧髁关节面可见较严重磨损，内侧髁关节面可见轻度磨损，单侧损伤面积> 25%，半月板内侧前角缺如为手术所致，总体可见半月板磨损面积> 50%。横断组与假手术组大体观察并无明显差异，可能无法达到大部分实验需求；横断+撕裂组、横断+切除组造模方案与假手术组均存在较大差异，且两者所达到的效果相近，均可达到骨关节炎造模软骨损伤要求。

对各组膝关节大体观察进行半定量评分，横断+撕裂组、横断+切除组评分大于假手术组、横断组(P < 0.01)，其余组间评分比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.4 各组大鼠膝关节病理学切片观察结果苏木精-伊红染色：各组大鼠膝关节苏木精-伊红染色结果如图5所示，假手术组关节面光滑平整；与假手术组对比，横断组略有轻度磨损，但总体上关节面较光滑；横断+切除组与横断+撕裂组关节面较粗糙，有明显的磨损，且二者磨损程度较接近。

甲苯胺蓝染色：各组大鼠膝关节甲苯胺蓝染色结果如图6所示，假手术组关节面着色饱满，证明关节面软骨组织基质分泌良好，且与骨组织着色分界线明显；横断组关节面软骨相关基质的染色接近于假手术组，软骨基质着色略淡，软骨与骨组织着色分界线明显；横断+撕裂组关节面软骨组织着色明显变淡，表明软骨基质明显较少，且与骨组织染色分界线基本消失；横断+切除组关节面软骨组织着色进一步变浅，且软骨组织着色不及骨组织着色，表明软骨基质破坏明显。

各组大鼠膝关节病理学切片天狼猩红染色如图7所示，各组胶原沉积情况与甲苯胺蓝染色结果相近，通过偏振光显微镜可以观察到假手术组的胶原主要以Ⅰ型(红色)、Ⅱ型胶原(多种颜色，呈疏松网状)为主，横断组以Ⅰ型胶原为主，横断+切除组与横断+撕裂组均以Ⅲ型胶原(绿色)为主。

综上所述，可以从病理学切片的数据分析判断单纯的前交叉韧带横断术后膝关节组织学有一定变化，骨关节炎程度并不明显，而两种前交叉韧带横断联合内侧半月板失稳的手术方案可达到相近的骨关节炎效果。
2.5 各组大鼠膝关节PCR定量分析结果从基因层面可知，相关的炎症因子在骨关节炎的发生发展中起着重要作用，其对关节软骨的退变以及骨关节炎的发展有重要影响，因此实验着重对相关炎性基因的表达进行了PCR表征，如图8所示。在骨关节炎发展中较为重要的炎症因子(白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8和肿瘤坏死因子α)表达呈现出了较为相近的趋势，横断组白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8及肿瘤坏死因子α的mRNA表达量高于假手术组(P < 0.005，P < 0.000 1)，横断+撕裂组白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8及肿瘤坏死因子α的mRNA表达量高于横断组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.005，P < 0.000 1)，横断+切除组白细胞介素6的mRNA表达量高于横断+撕裂组(P < 0.05)。

此外，各组大鼠膝关节软骨相关的基质以及基质降解酶的基因表达，如图9所示。与假手术组相比，横断组基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3的mRNA表达量升高(P < 0.01，P < 0.005)，聚集蛋白聚糖的mRNA表达量降低(P < 0.000 1)；与横断组相比，横断+撕裂组基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3的mRNA表达量升高(P < 0.000 1)，聚集蛋白聚糖的mRNA表达量降低(P < 0.000 1)；与横断+撕裂组相比，横断+切除组基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3的mRNA表达量升高(P < 0.01，P < 0.000 1)，聚集蛋白聚糖的mRNA表达量无明显变化(P > 0.05)。

参考文献

[1] CARBONE A, RODEO S. Review of current understanding of post-traumatic osteoarthritis resulting from sports injuries. J Orthop Res. 2017;35(3):397-405.
[2] SRIKANTH VK, FRYER JL, ZHAI G, et al. A meta-analysis of sex differences prevalence, incidence and severity of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2005;13(9):769-781.
[3] DE BOER TN, VAN SPIL WE, HUISMAN AM, et al. Serum adipokines in osteoarthritis; comparison with controls and relationship with local parameters of synovial inflammation and cartilage damage. Osteoarthritis Cartilage. 2012;20(8):846-853.
[4] BROWN TD, JOHNSTON RC, SALTZMAN CL, et al. Posttraumatic osteoarthritis: a first estimate of incidence, prevalence, and burden of disease. J Orthop Trauma. 2006;20(10):739-744.
[5] THOMAS AC, HUBBARD-TURNER T, WIKSTROM EA, et al. Epidemiology of Posttraumatic Osteoarthritis. J Athl Train. 2017;52(6):491-496.
[6] FOY CG, PENNINX BW, SHUMAKER SA, et al. Long-term exercise therapy resolves ethnic differences in baseline health status in older adults with knee osteoarthritis. J Am Geriatr Soc. 2005;53(9):1469-1475.
[7] MESSIER SP, MIHALKO SL, LEGAULT C, et al. Effects of intensive diet and exercise on knee joint loads, inflammation, and clinical outcomes among overweight and obese adults with knee osteoarthritis: the IDEA randomized clinical trial. JAMA. 2013;310(12):1263-1273.
[8] TARUC-UY RL, LYNCH SA. Diagnosis and treatment of osteoarthritis. Prim Care. 2013;40(4):821-536.
[9] MENENDEZ MI, HETTLICH B, WEI L, et al. Feasibility of Na18F PET/CT and MRI for Noninvasive In Vivo Quantification of Knee Pathophysiological Bone Metabolism in a Canine Model of Post-traumatic Osteoarthritis. Mol Imaging. 2017;16:1536012117714575.
[10] RIORDAN EA, LITTLE C, HUNTER D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2014; 28(1):17-30.
[11] LAMPROPOULOU-ADAMIDOU K, LELOVAS P, KARADIMAS EV, et al. Useful animal models for the research of osteoarthritis. Eur J Orthop Surg Traumatol. 2014;24(3):263-271.
[12] TEEPLE E, JAY GD, ELSAID KA, et al. Animal models of osteoarthritis: challenges of model selection and analysis. AAPS J. 2013;15(2):438-446.
[13] VINCENT TL, WILLIAMS RO, MACIEWICZ R, et al. Arthritis Research UK animal models working group. Mapping pathogenesis of arthritis through small animal models. Rheumatology (Oxford). 2012;51(11): 1931-1941.
[14] MILLER RE, MALFAIT AM. Osteoarthritis pain: What are we learning from animal models? Best Pract Res Clin Rheumatol. 2017;31(5):676-687.
[15] LIEBERTHAL J, SAMBAMURTHY N, SCANZELLO CR. Inflammation in joint injury and post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(11):1825-1834.
[16] LIM CY, IN J. Randomization in clinical studies. Korean J Anesthesiol. 2019;72(3):221-232.
[17] CHAMBERS MG, BAYLISS MT, MASON RM. Chondrocyte cytokine and growth factor expression in murine osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 1997;5(5):301-308.
[18] BRANDT KD, FIFE RS, BRAUNSTEIN EM, et al. Radiographic grading of the severity of knee osteoarthritis: relation of the Kellgren and Lawrence grade to a grade based on joint space narrowing, and correlation with arthroscopic evidence of articular cartilage degeneration. Arthritis Rheum. 1991;34(11):1381-1386.
[19] FELSON DT, NIU J, GUERMAZI A, et al. Defining radiographic incidence and progression of knee osteoarthritis: suggested modifications of the Kellgren and Lawrence scale. Ann Rheum Dis. 2011;70(11):1884-1886.
[20] AHLBÄCK S. Osteoarthrosis of the knee. A radiographic investigation. Acta Radiol Diagn (Stockh). 1968:Suppl 277:7-72.
[21] LEACH RE, GREGG T, SIBER FJ. Weight-bearing radiography in osteoarthritis of the knee. Radiology. 1970;97(2):265-268.
[22] ALTMAN RD, FRIES JF, BLOCH DA, et al. Radiographic assessment of progression in osteoarthritis. Arthritis Rheum. 1987;30(11):1214-1225.
[23] XIA B, DI CHEN, ZHANG J, et al. Osteoarthritis pathogenesis: a review of molecular mechanisms. Calcif Tissue Int. 2014;95(6):495-505.
[24] GOLDRING SR, GOLDRING MB. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nat Rev Rheumatol. 2016;12(11):632-644.
[25] GOLDRING MB, GOLDRING SR. Articular cartilage and subchondral bone in the pathogenesis of osteoarthritis. Ann N Y Acad Sci. 2010;1192: 230-237.
[26] ZHEN G, CAO X. Targeting TGFβ signaling in subchondral bone and articular cartilage homeostasis. Trends Pharmacol Sci. 2014;35(5):227-236.
[27] LI G, YIN J, GAO J, et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Res Ther. 2013; 15(6):223.
[28] FUNCK-BRENTANO T, COHEN-SOLAL M. Subchondral bone and osteoarthritis. Curr Opin Rheumatol. 2015;27(4):420-426.
[29] LOESER RF, GOLDRING SR, SCANZELLO CR, et al. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 2012;64(6):1697-1707.
[30] MARTEL-PELLETIER J, BARR AJ, CICUTTINI FM, et al. Osteoarthritis. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16072.
[31] SWINGLER TE, NIU L, SMITH P, et al. The function of microRNAs in cartilage and osteoarthritis. Clin Exp Rheumatol. 2019;37 Suppl 120(5):40-47.
[32] ILAS DC, CHURCHMAN SM, MCGONAGLE D, et al. Targeting subchondral bone mesenchymal stem cell activities for intrinsic joint repair in osteoarthritis. Future Sci OA. 2017;3(4):FSO228.
[33] PRIMORAC D, MOLNAR V, ROD E, et al. Knee Osteoarthritis: A Review of Pathogenesis and State-Of-The-Art Non-Operative Therapeutic Considerations. Genes (Basel). 2020;11(8):854.
[34] PRATTA MA, SU JL, LEESNITZER MA, et al. Development and characterization of a highly specific and sensitive sandwich ELISA for detection of aggrecanase-generated aggrecan fragments. Osteoarthritis Cartilage. 2006;14(7):702-713.
[35] LOESER RF. Molecular mechanisms of cartilage destruction: mechanics, inflammatory mediators, and aging collide. Arthritis Rheum. 2006; 54(5):1357-1360.
[36] HARKEY MS, LUC BA, GOLIGHTLY YM, et al. Osteoarthritis-related biomarkers following anterior cruciate ligament injury and reconstruction: a systematic review. Osteoarthritis Cartilage. 2015; 23(1):1-12.
[37] MOBASHERI A, HENROTIN Y. Biomarkers of (osteo)arthritis. Biomarkers. 2015;20(8):513-518.
[38] BOEHME KA, ROLAUFFS B. Onset and Progression of Human Osteoarthritis-Can Growth Factors, Inflammatory Cytokines, or Differential miRNA Expression Concomitantly Induce Proliferation, ECM Degradation, and Inflammation in Articular Cartilage? Int J Mol Sci. 201;19(8):2282.
[39] GOLDRING MB, GOLDRING SR. Osteoarthritis. J Cell Physiol. 2007; 213(3):626-634.
[40] ENGLUND M, GUERMAZI A, LOHMANDER LS. The meniscus in knee osteoarthritis. Rheum Dis Clin North Am. 2009;35(3):579-590.
[41] ENGLUND M, GUERMAZI A, ROEMER FW, et al. Meniscal tear in knees without surgery and the development of radiographic osteoarthritis among middle-aged and elderly persons: The Multicenter Osteoarthritis Study. Arthritis Rheum. 2009;60(3):831-839.
[42] ANDERSON DD, MARSH JL, BROWN TD. The pathomechanical etiology of post-traumatic osteoarthritis following intraarticular fractures. Iowa Orthop J. 2011;31:1-20.
[43] SWÄRD P, FROBELL R, ENGLUND M, et al. Cartilage and bone markers and inflammatory cytokines are increased in synovial fluid in the acute phase of knee injury (hemarthrosis)--a cross-sectional analysis. Osteoarthritis Cartilage. 2012;20(11):1302-1308.
[44] HAN PF, WEI L, DUAN ZQ, et al. Contribution of IL-1β, 6 and TNF-α to the form of post-traumatic osteoarthritis induced by “idealized” anterior cruciate ligament reconstruction in a porcine model. Int Immunopharmacol. 2018;65:212-220.
[45] BIGONI M, SACERDOTE P, TURATI M, et al. Acute and late changes in intraarticular cytokine levels following anterior cruciate ligament injury. J Orthop Res. 2013;31(2):315-321.
[46] AIGNER T, COOK JL, GERWIN N, et al. Histopathology atlas of animal model systems - overview of guiding principles. Osteoarthritis Cartilage. 2010;18 Suppl 3:S2-6.
[47] COHEN-SOLAL M, HAY E, FUNCK-BRENTANO T. Animal models in OA: a means to explore bone. Osteoporos Int. 2012;23 Suppl 8:S853-856.
[48] LITTLE CB, ZAKI S. What constitutes an “animal model of osteoarthritis”--the need for consensus? Osteoarthritis Cartilage. 2012;20(4):261-267.
[49] 廖建钊,夏天.细胞外基质在骨关节炎发生、发展中的作用及临床研究价值[J].中国组织工程研究,2022,26(12):1937-1943.

引言

骨关节炎已成为目前最常见的关节炎类型，也是导致行动性残疾的主要原因，世界范围内有近半数人受此病困扰[1]。与患有骨关节炎的男性患者相比，女性患者表现出更严重的症状和更明显的影像学差异[2]。在众多与骨关节炎相关的关节中，膝关节骨关节炎是最常见的类型，大概有6%的成年人存在膝关节骨关节炎[3]。
骨关节炎也被分为多种不同的亚型，而每种亚型也有着截然不同的病因及临床表现，无疑，将骨关节炎划分为不同的亚型有助于更好地研究这类疾病，并且能更有特异性地帮助患者，在骨关节炎早期进行相关的预防[4]。其中，大约有12%的骨关节炎患者可以归类于继发性关节损伤，如关节内骨折、韧带损伤或关节内半月板损伤等导致的创伤后骨关节炎，关节损伤也被公认为是继发骨关节炎的高危因素[5]。骨关节炎导致的关节功能障碍和关节疼痛使患者难以维持日常生活活动，生活质量下降，严重影响患者个人的健康和幸福感[6-8]。同样，越来越多的研究者也开始意识到在骨关节炎退行性进程的早期给予治疗干预的重要性，在此阶段关节软骨可能尚有一定的再生能力，而到了疾病的终末期，这种再生能力将会彻底消失，因此早期创伤后骨关节炎的定义对于较早识别并正确干预存在进展风险的患者十分重要，这可以帮助研究者更好地设计治疗方案和干预手段，评估现有和新兴治疗方法的潜力和适应证，从而在临床实践中更好地分配资源和管理受膝关节表面病变影响的患者[9-10]。
目前，用于研究的骨关节炎造模方案主要分为无创化学药物注射及有创的手术制造损伤[11-13]。显而易见，有创的手术制造缺损可提供疾病发生发展的诱因，使构建的骨关节炎模型更加接近于创伤后骨关节炎的自然诱发过程，其中常用的有创手术模型包括啮齿动物、兔子和绵羊的内侧半月板失稳或前交叉韧带横断手术[14]。内侧半月板失稳手术仅仅造成了局部关节的失稳状态，而整体关节稳定仍可通过前交叉韧带维持，导致造模效果中的疼痛学分析可能仅在14 d时达到一定的差异，而在28 d后这种差异又不及前交叉韧带横断手术的造模方案[15]；此外，常规的内侧半月板失稳手术方案大多采取剪除内侧半月板前角的术式，该方案由于切除面积较大需要暴露更大面积术野，所以手术难度较大，容易造成关节内其他骨或软骨组织的损伤，从而导致术后诱发骨关节炎程度存在较大差异，影响进一步相关的研究开展。前交叉韧带横断手术被研究者广泛地用于骨关节炎造模，而且造模方案的组织学变化也与人类骨关节炎组织学变化相近，但术后需要高负荷的运动来诱发关节炎，这与早期创伤性骨关节炎人们应对疼痛的反应有所差异，同时为研究者带来了较大的成本损耗和非必要的工作量，不是最佳的骨关节炎造模方案。
此次实验对比在无高负荷运动下前交叉韧带横断、前交叉韧带横断联合内侧半月板前角切除、前交叉韧带横断联合内侧半月板前角撕裂手术的造模效果，以期寻找一种与传统造模方案相比更加简便易行的造模方案。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年6月至2023年2月在四川大学华西医院动物实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 48只雄性SD大鼠，8周龄，SPF级，体质量(220±20) g，由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(川)2020-030。所有大鼠在四川大学华西医院动物实验中心SPF级环境喂养，自由饮水、进食，室温 22-25 ℃，相对湿度50%-60%。实验方案经四川大学实验动物伦理委员会的审查批准实施，审批号：KS2020328，实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 主要试剂与仪器 1.5%戊巴比妥钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；RNeasy@Mini试剂盒(Biocolor，U.K)；iScriptTM cDNA试剂盒、SofastTM Eva Green Supermix(Bio-Rad，USA)；X射线(Faxitron X射线，美国)；Micro-CT(Skyscan1076扫描仪，Bruker，比利时)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验动物分组及造模方法依照LIM等[16]的标准，采用随机数字法将48只SD大鼠分为假手术组、横断组、横断+切除组和横断+撕裂组，每组12只。
横断组：横断左侧后肢前交叉韧带，手术方案如图1A所示：1.5%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，左膝关节伸直位脱位髌骨及膝韧带，完全屈曲位固定髌骨及膝韧带。于脱位的髌骨内下侧行1 cm纵行切口，打开膝关节腔，完全暴露膝关节，分离关节腔内软组织见前交叉韧带，钩针横断，前抽屉试验阳性，确认前交叉韧带完全横断，逐层缝合关节腔及皮肤。
横断+撕裂组：横断左侧后肢前交叉韧带、撕裂内侧半月板前角，手术方案如图1B所示：同法麻醉，横断前交叉韧带，于内侧半月板前角坚固处钩针行1 mm切口，使半月板前角完全断裂，逐层缝合关节腔及皮肤。

横断+切除组：横断左侧后肢前交叉韧带、切除内侧半月板前角，手术方案如图1C所示：同法麻醉，横断前交叉韧带，完整暴露内侧半月板前角，于半月板中段薄弱处剪断半月板，分离半月板前角与胫骨平台连接处软组织，完整取出半月板前角，逐层缝合关节腔及皮肤。

假手术组：行假手术，完全暴露膝左侧后肢关节腔后缝合关节腔及皮肤。

各组大鼠术后常规SPF级环境饲养，室温22-25 ℃，相对湿度50%-60%，自由饮食饮水饲养4周后完成造模。通过影像学检查可判断术中未造成骨组织副损伤，CT见胫骨前移证明前交叉韧带被成功横断，可证明手术符合预期拟定效果，通过大体观、病理组织学切片及PCR检测验证造模效果。

1.4.2 影像学检测常规饲养4周后，腹腔注射过量戊巴比妥钠处死大鼠，提取部分左侧后肢膝关节，置于40 g/L多聚甲醛中固定 48 h，行X射线检测(在32 kV电压下扫描，曝光时间为10 s)与Micro-CT扫描(采用高分辨率模式，像素大小为18 μm)。

1.4.3 大体观察提取部分左侧后肢膝关节，打开膝关节腔，在不额外损伤关节软骨及半月板的前提下分离股骨、胫骨，观察内外侧髁髌面、内外侧髁及半月板。根据CHAMBERS 等[17]制定的半定量评分标准对各个评价指标进行赋值，具体量化标准如表1。

1.4.4 病理学组织切片分析提取大鼠左侧后肢膝关节，使用10%EDTA-Na2(pH=7.4)37 ℃脱钙液脱钙 28 d，间隔24 h更换一次脱钙液。脱水包埋后沿膝关节矢状面连续切片，每张组织片厚度 5 μm，置于37 ℃烘箱烘烤3 h，过二甲苯脱蜡，梯度乙醇浸泡复水，随后进行切片染色。
苏木精-伊红染色：将切片放入苏木精染液中30 min，水洗15 min，使切片染色变蓝，置于1%盐酸乙醇中褪色，至切片变红，水洗至恢复蓝色，梯度乙醇脱水，0.5%伊红乙醇液对比染色3 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。
甲苯胺蓝染色：切片放入甲苯胺蓝染夜中30 min，水洗2 min，丙酮分化至软骨细胞紫蓝色清晰可见，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。
天狼猩红染色：切片放入天狼猩红染液中1 h，水洗5 min，苏木精染液染色10 min，水洗10 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。

1.4.5 PCR检测提取大鼠左侧后肢膝关节软骨组织，液氮速冻，使用RNeasy@Mini试剂盒提取RNA，采用iScriptTM cDNA试剂盒将RNA反转录为cDNA，检测各样品中的内参基因，即DAPDH，根据内参基因调整cDNA浓度。加样：将1 μL cDNA、1 μL上游引物、1 μL下游引物、2 μL无酶水和5 μL SofastTM Eva Green Supermix加入96孔板中，贴膜并压实，上机检测；设定预变性95 ℃2 min，1次循环；变性95 ℃10 s，退火60 ℃30 s，40个循环；检测炎性相关基因(白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α)与基质降解相关基因(基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3及聚集蛋白聚糖)的表达。引物序列如表2。

1.5 主要观察指标各组大鼠膝关节标本大体、X射线片、CT扫描、病理组织切片观察及PCR检测结果。
1.6 统计学分析全部定量数据均采用3个独立实验数据，统计显著性分析采用t检验或单因素方差分析，P < 0.05认为差异有显著性意义。统计学数据均使用8.0版prism进行分析。文章统计学方法已经通过樊渝江教授审核。

讨论

大量研究表明，软骨和软骨下骨之间的相互作用是关节稳态的基础，也是骨关节炎进展的基础[23-28]，目前大部分的造模手术也是通过破坏这种关节稳态来诱发骨关节炎。此次实验对比了单一前交叉韧带横断和前交叉韧带横断联合内侧半月板失稳手术方案，在低运动强度下诱发创伤性骨关节炎的效果以及早期病理改变情况，并对传统的前交叉韧带横断联合内侧半月板失稳手术造模方案进行了改良。实验结果发现，单纯横断前交叉韧带在低运动强度下难以诱发骨关节炎，而在联合前交叉韧带横断的情况下，无论是切除内侧半月板前角还是给予内侧半月板横断撕裂性损伤，均可以诱发骨关节炎，但在造模难度上，给予半月板撕裂样损伤要比切除半月板前角更容易实施，因其手术范围较小可能造成的副损伤也更小，使得该术式更容易实施。
与原发性骨关节炎不同，在一个首要的关节损伤发生后，由于没有及时地干预而导致关节软骨持续损伤，使得创伤后骨关节炎成为了导致青少年功能性致残的一大主要病因[5]。膝关节骨关节炎的特征主要是关节软骨和软骨下骨的结构改变，也包括Hoffa脂肪垫、滑膜、韧带和肌肉，这导致了将骨关节炎作为一个整体关节疾病来观察的概念[29-33]。此外，创伤后骨关节炎被认为有一个明确的病因，作为疾病的“起始”，这意味着可以在疾病的早期阶段进行干预，来预防疾病的发生发展[4]。由此可见，对于早期创伤后骨关节炎的研究有着重要意义，所以也就推动着研究者更加系统地完善相关动物模型的建立，以应对不同研究的需要。起初，人们认为骨关节炎是一种软骨疾病，后来，这种观念被软骨下骨也受到影响的想法所取代，现在研究者认为关节内或周围所有组织都受到疾病的影响，所以提出了骨关节炎作为一个整体关节疾病的概念[33]。关节软骨是一种无血管、淋巴和无神经组织，软骨组织中唯一的细胞类型是软骨细胞[24-25，30]，软骨缺损也被认为是骨关节炎中较难解决的问题，造模过程中软骨损伤也成了需要着重考虑的指标。从此次实验结果可以看到，通过不同方式构建的模型不仅在关节软骨的磨损情况存在较大差异，在软骨相关基质的表达上也可以看到较大差异，单纯的前交叉韧带横断手术造模方案在4周低运动负荷的情况下无法实现较为明显的软骨损伤及基质降解，而两种前交叉韧带横断联合内侧半月板失稳手术的造模方案则均可以达到软骨磨损及造成基质降解的目的。
多种分子和生化过程在创伤后骨关节炎的发生发展过程中起重要作用。已有研究报道相关基因的检测也可以预测疾病未来的发生发展。在早期阶段，软骨细胞试图通过增加其合成活性来恢复丢失的聚集蛋白聚糖，聚合蛋白降解首先出现在浅层，表现为浅层软骨纤维性颤动[34]。基质金属蛋白酶参与基质降解和骨关节炎的发病机制[35]。包括Ⅱ型胶原蛋白和糖胺聚糖在内的细胞外基质结构破坏可能是骨性关节炎的早期迹象之一，可以在影像学证据之前检测到，同时降解酶的升高(如基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3)也是软骨发生降解的早期迹象之一，考虑到滑膜细胞和邻近软骨细胞的改变可能会降低润滑素的水平，基质金属蛋白酶有望作为软骨降解的生物标志物[36]。此次实验对以上分子进行了相关表征，可以看到单纯的前交叉韧带横断手术虽然在影像学及病理学的检测中没有表现出较为严重的软骨磨损和基质降解，但在基因层面还是存在显著差异，宏观上虽然并不能定性为导致了骨关节炎的发生，但基因上的差异可以确定，单纯的前交叉韧带横断手术可以提供骨关节炎发生发展的诱因，并且可能随着时间的推移或运动负荷的增加而诱发骨关节炎，后续研究会进一步论证时间及运动强度对于单纯前交叉韧带横断手术诱发创伤后骨关节炎的关系，从而得到更加多样、针对性更强的造模方案。
骨关节炎不仅仅是一种由负重关节的不适当负荷力和重复压力引起的疾病，更是一种由潜在的免疫反应决定软骨退化、骨重塑和肿胀、疼痛和僵硬等典型症状的疾病[37-39]，这种炎症反应是如何启动的尚不清楚，但已知关节组织细胞可以产生炎症刺激并对其做出反应[39]。炎症反应作为骨关节炎的一个可变特征，与关节症状和疾病进展相关。在可能发展为创伤后骨关节炎患者的关节液和组织中，经常可以观察到炎症反应迹象，强烈的炎症反应在关节损伤(如前交叉韧带断裂[40]、半月板[41-42]、关节内骨折[43])后很早就发生，但随后在较低的水平上持续，这种早期炎症反应有助于创伤后骨关节炎特征的发展[43]。研究表明，在前交叉韧带横断后白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8及肿瘤坏死因子α水平均会有明显升高[44]，而在伴随软骨骨折的情况下，白细胞介素8和肿瘤坏死因子α的升高幅度更高[45]。此次实验中各组造模方案所得到的动物模型也均与报道中的促炎因子变化水平一致。
此次实验结果显示，单纯的前交叉韧带横断手术造模方案所产生的软骨磨损较难观察到，两种前交叉韧带横断联合内侧半月板失稳的造模方案均可观察到软骨的损伤；但在基因的表达上，各组间均存在明显差异，在炎性基因的表达中各手术组均观察到了炎性反应，横断组炎症反应较弱，而两种前交叉韧带横断联合内侧半月板失稳的造模方案差异不大。在基质相关基因的表达上，虽然两种前交叉韧带横断联合内侧半月板失稳的造模方案差异性不大，但基质降解相关基因的表达中，两种前交叉韧带横断联合内侧半月板失稳的造模方案存在较大差异，这也提示了虽然目前两者间未出现明显的基质表达上的差异，但随时间推移前交叉韧带横断联合内侧半月板切除的造模方案可能出现更严重的基质破坏；而横断组在基质相关基因的表达中表现出了介于假手术组与前交叉韧带横断联合内侧半月板失稳组之间的表达情况。可以肯定的是，骨关节炎是人类的一种异质性疾病，不应指望单一的动物模型与研究疾病过程的所有方面相关[46-48]，这也为今后研究提供了更好的思路，如果研究方向更倾向于炎症调节，可能单纯前交叉韧带横断的手术方案会更加合适，而前交叉韧带横断联合内侧半月板失稳的造模方案可能更加适合炎症调节及软骨修复的相关研究方向。
综上所述，在没有高运动负荷的情况下，单纯的前交叉韧带横断手术造模仅能在基因层面观察到明显差异，可能不适用于对骨关节炎宏观上的研究；前交叉韧带横断联合内侧半月板失稳的造模方案则可以在低运动负荷的情况下宏观上满足大部分针对炎症调控及软骨修复研究的实验要求，且无论是完全剪除内侧半月板前角还是仅给予内侧半月板前角垂直的撕裂，均可以达到使内侧半月板失稳的目的，从而达到造模要求。研究也具有一定的局限性：①未对多个时间点的其他基质相关基因进行表征，限制了对造模术后疾病发生发展进行更详尽的探究；②有文献指明细胞外基质不仅可以为细胞提供营养，也是细胞信息进行交互的场所，并且对骨关节炎的诊断和鉴别有着重大意义[49]，该文未对大量基质进行表征，因此也需要在未来研究或实践进一步进行验证；③作为一项探索性工作，根据动物实验3R原则，在对各项实验的设计中仅设置了用于统计学分析的最小平行样本数量数据，尚需在未来的研究中通过更大量的样本数量完成进一步论证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

早期创伤性膝骨关节炎动物模型构建方案的比较

Comparison of protocols for constructing animal models of early traumatic knee osteoarthritis

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 8

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张克凡, 石辉. 细胞因子治疗骨关节炎的研究现状及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 961-967.
[2]	申飞燕, 姚吉祥, 苏珊珊, 赵忠民, 唐巍东. 敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 499-504.
[3]	买斯吐热木·黑力力, 张婉霞, 尼加提·努尔穆罕默德, 买买提吐逊·吐尔地. 关节腔注射医用臭氧对早期颞下颌骨关节炎模型大鼠髁突组织学的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 505-509.
[4]	张亚茹, 陈焱君, 张晓东, 陈胜华, 黄文华. 谷胱甘肽过氧化物酶4介导铁死亡在膝骨关节炎滑膜炎发生发展中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 550-555.
[5]	刘潞兴, 狄鸣远, 杨强. 中药有效成分治疗骨关节炎机制中的信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 609-614.
[6]	闫炳翰, 李志超, 苏辉, 薛海鹏, 徐展望, 谭国庆. 中药单体靶向自噬治疗骨关节炎的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 627-632.
[7]	陈俊炎, 孟庆奇, 李斯明. 关节腔注射治疗骨关节炎药物载体系统中的软骨靶向功能[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 458-463.
[8]	刘宝方, 徐斌, 陈雷. 葛根汤治疗骨关节炎的网络药理学分析及动物实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 193-199.
[9]	孟志成, 乔卫平, 赵阳, 刘洪飞, 李凯杰, 马博. 免疫细胞及相关细胞因子在骨关节炎发病及治疗中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 280-287.
[10]	申飞燕, 姚吉祥, 苏珊珊, 赵忠民, 唐巍东. 敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-6.
[11]	李晓敏, 田向东 , 谭冶彤 , 朱光宇 , 王荣田 , 王剑 , 薛志鹏, 马晟, 胡元一, 黄叶, 丁天送. 骨质疏松性内侧室膝骨关节炎胫骨高位截骨后下肢力线及膝关节功能的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1325-1329.
[12]	黄林科, 韦林华, 蒋捷, 刘倩, 陈蔚蔚. 雌激素与跑台运动干预卵巢切除模型小鼠骨量和关节软骨的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1166-1171.
[13]	袁长深, 官岩兵, 李哲, 容伟明, 廖书宁, 陈乐伟, 梅其杰, 段戡. 骨关节炎坏死性凋亡关键基因的筛选与验证[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 695-700.
[14]	谷明西, 王博, 田丰德, 安宁, 郝瑞胡, 王常成, 郭林. 同期和分期双侧全膝关节置换的早期疗效和安全性比较[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(4): 565-571.
[15]	郭颖奇, 宫先旭, 张岩, 肖寒, 王野, 谷文光. 半月板外突与髌股关节软骨损伤及骨髓病变：MRI半定量评分的评价[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(4): 600-605.