谷胱甘肽过氧化物酶4介导铁死亡在膝骨关节炎滑膜炎发生发展中的作用

doi:10.12307/2024.215

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (4): 550-555.doi: 10.12307/2024.215

• 骨组织构建 bone tissue construction • 上一篇下一篇

谷胱甘肽过氧化物酶4介导铁死亡在膝骨关节炎滑膜炎发生发展中的作用

张亚茹1，陈焱君2，张晓东2，陈胜华1，黄文华1，3

1南华大学应用解剖与生殖医学研究所，衡阳医学院，湖南省衡阳市 421001；2南方医科大学第三附属医院放射科，广东省广州市 510630；3南方医科大学基础医学院人体解剖学国家重点学科，广东省医学生物力学重点实验室，广东省医学3D打印应用转化工程技术研究中心，广东省广州市 510515

收稿日期:2022-12-24 接受日期:2023-02-24 出版日期:2024-02-08 发布日期:2023-07-14
通讯作者: 黄文华，教授，博士生导师，南华大学应用解剖与生殖医学研究所，衡阳医学院，湖南省衡阳市 421001；南方医科大学基础医学院人体解剖学国家重点学科，广东省医学生物力学重点实验室，广东省医学3D打印应用转化工程技术研究中心，广东省广州市 510515 陈胜华，博士，副教授，南华大学应用解剖与生殖医学研究所，衡阳医学院，湖南省衡阳市 421001
作者简介:张亚茹，1994年生，山西省柳林县人，汉族，2023年南华大学毕业，硕士，主要从事骨关节炎的影像及基础研究。
基金资助:
广东省基础与应用基础研究基金项目(2022A1515012545)，项目负责人：陈焱君；广东省省级科技计划项目(2017B090912006)，项目负责人：张晓东；广东省基础与应用基础研究基金项目(2020B1515120001)，项目负责人：黄文华

Effect of ferroptosis mediated by glutathione peroxidase 4 in the occurrence and progression of synovitis in knee osteoarthritis

Zhang Yaru1, Chen Yanjun2, Zhang Xiaodong2, Chen Shenghua1, Huang Wenhua1, 3

1Clinical Anatomy and Reproductive Medicine Application Institute, Hengyang Medical School, Nanhua University, Hengyang 421001, Hunan Province, China; 2Department of Radiology, The Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China;

Received:2022-12-24 Accepted:2023-02-24 Online:2024-02-08 Published:2023-07-14
Contact: Huang Wenhua, Professor, Doctoral supervisor, Clinical Anatomy and Reproductive Medicine Application Institute, Hengyang Medical School, Nanhua University, Hengyang 421001, Hunan Province, China; National Key Disciplines of Human Anatomy, Guangdong Engineering Research Center for Translation of Medical 3D Printing Application, Guangdong Provincial Key Laboratory of Medical Biomechanics, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China Chen Shenghua, MD, Associate professor, Clinical Anatomy and Reproductive Medicine Application Institute, Hengyang Medical School, Nanhua University, Hengyang 421001, Hunan Province, China
About author:Zhang Yaru, Master, Clinical Anatomy and Reproductive Medicine Application Institute, Hengyang Medical School, Nanhua University, Hengyang 421001, Hunan Province, China; National Key Disciplines of Human Anatomy, Guangdong Engineering Research Center for Translation of Medical 3D Printing Application, Guangdong Provincial Key Laboratory of Medical Biomechanics, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangdong Basic and Applied Basic Research Fund, Nos. 2022A1515012545 (CYJ) and 2020B1515120001 (to HWH); Guangdong Provincial Science and Technology Program Project, No. 2017B090912006 (to ZXD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

滑膜：是关节囊的内层，呈淡红色，光滑质软，多由疏松结缔组织组成。滑膜直接附着于关节软骨的边缘并向内贴附在关节囊内的非关节区域，覆盖在关节囊、关节内韧带、骨与肌腱表面。
铁死亡：新近发现的一种细胞死亡方式，是在小分子物质诱导下发生的氧化性细胞死亡，具有铁离子依赖性，其发生是细胞内脂质活性氧生成与降解平衡失调所致，铁死亡诱导剂通过不同的通路直接或间接作用于谷胱甘肽过氧化物酶，导致细胞抗氧化能力降低，活性氧堆积，最终引起细胞氧化性死亡。

背景：滑膜炎在膝骨关节炎早期进展中起主导作用，是潜在的早期治疗靶点，但滑膜炎发生机制尚不清楚。在动物模型中，全身铁含量增加和细胞内铁摄取升高可诱发和加剧骨关节炎，但滑膜炎与铁死亡的关系仍不清楚，因此探讨铁死亡在骨关节炎滑膜炎发生发展中的作用需进一步研究。

目的：探讨谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase4，GPX4)介导的铁死亡在膝骨关节炎滑膜炎发生发展过程中的作用。
方法：入选行膝关节镜或关节置换手术的骨关节炎患者43 例以及行关节镜治疗半月板损伤或韧带撕裂患者10例，根据患者术前X射线平片Kellgren-Lawrence分级分为3组：对照组(KLG 0)10例，早期膝骨关节炎组(KLG 1，2)20例和晚期膝骨关节炎组(KLG 3，4)23例。采用苏木精-伊红染色观察各组滑膜炎的严重程度，普鲁士蓝染色评估各组滑膜组织中的铁沉积情况，免疫组化法检测ACSL4、GPX4、环氧化酶2、肿瘤坏死因子α在滑膜组织中的表达，Western blot和免疫荧光分别检测ACSL4、GPX4蛋白的表达。

结果与结论：①与对照组相比，骨关节炎组滑膜组织中铁含量增加，且晚期膝骨关节炎组铁沉积多于早期膝骨关节炎组；②与对照组相比，ACSL4在骨关节炎滑膜组织中高表达(P < 0.01)，GPX4在骨关节炎滑膜组织中低表达(P < 0.01)，且ACSL4表达量随着骨关节炎的进展呈现增高趋势，GPX4表达量随着骨关节炎的进展呈现降低趋势；③环氧化酶2在骨关节炎滑膜组织中的表达明显高于正常滑膜组织，其中早期骨关节炎组表达最高，与晚期骨关节炎组比较差异有显著性意义(P < 0.01)；④肿瘤坏死因子α在骨关节炎滑膜组织中的表达明显高于正常滑膜组织，早期骨关节炎组与晚期骨关节炎组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；⑤结果表明，骨关节炎滑膜组织中有铁的沉积，铁死亡参与了膝骨关节炎滑膜炎的发生及病情进展。

https://orcid.org/0000-0003-3961-3210(张亚茹)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, 滑膜炎, 磁共振, GPX4, 铁死亡

Abstract: BACKGROUND: Synovitis plays a leading role in the early progression of knee osteoarthritis and is a potential early therapeutic target. However, the mechanism of synovitis remains unclear. In animal models, increased systemic iron and intracellular iron uptake can induce and exacerbate osteoarthritis, but the association with ferroptosis in synovitis remains unclear. Further studies are needed to investigate the role of ferroptosis in the development and progression of synovitis in osteoarthritis.
OBJECTIVE: To investigate the role of ferroptosis mediated by glutathione peroxidase 4 (GPX4) in the development of synovitis in knee osteoarthritis.
METHODS: The synovial tissues of 43 patients with osteoarthritis who underwent arthroscopic or joint replacement surgery and 10 patients undergoing arthroscopic treatment of meniscal injury or ligament tear were collected and divided into three groups according to the Kellgren-Lawrence grading of X-ray images: normal control group (KLG 0, n=10), early knee osteoarthritis group (KLG 1, 2, n=20) and late knee osteoarthritis group (KLG 3, 4, n=23). Hematoxylin-eosin staining was used to observe the severity of synovitis in each group, and iron deposition in the synovium in each group was evaluated by Prussian blue staining. The expressions of Acyl-CoA Synthetase Long Chain Family Member 4 (ACSL4), GPX4, cyclooxygenase 2 and tumor necrosis factor α in the synovium were detected by immunohistochemical staining. Western blot and immunofluorescence were used to detect the expression of ferroptosis-related proteins ACSL4 and GPX4.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal control group, iron content in synovial tissue was increased in the knee osteoarthritis groups, and iron deposition in the late knee osteoarthritis group was higher than that in the early osteoarthritis group. ACSL4 was highly expressed in the synovial tissue of knee osteoarthritis compared with the normal control group (P < 0.01), and GPX4 was lowly expressed in the synovial tissue of knee osteoarthritis (P < 0.01). The expression level of ACSL4 increased with the progression of osteoarthritis, while the expression level of GPX4 decreased with the progression of osteoarthritis. The expression of cyclooxygenase 2 in the synovium of osteoarthritis was significantly higher than that in the normal synovium, and the expression was the highest in the early stage of osteoarthritis, which was significantly different from that in the advanced stage of osteoarthritis (P < 0.01). The expression of tumor necrosis factor α in the synovium of osteoarthritis was significantly higher than that in the normal synovium, but there was no significant difference between early and late osteoarthritis groups (P > 0.05). To conclude, the deposition of iron exists in the synovial tissue of osteoarthritis and ferroptosis is involved in the occurrence and progression of synovitis in knee osteoarthritis.

Key words: osteoarthritis, synovitis, magnetic resonance image, GPX4, ferroptosis

中图分类号:

张亚茹, 陈焱君, 张晓东, 陈胜华, 黄文华. 谷胱甘肽过氧化物酶4介导铁死亡在膝骨关节炎滑膜炎发生发展中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 550-555.

Zhang Yaru, Chen Yanjun, Zhang Xiaodong, Chen Shenghua, Huang Wenhua. Effect of ferroptosis mediated by glutathione peroxidase 4 in the occurrence and progression of synovitis in knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(4): 550-555.

图/表（结果） 6

2.1 影像学结果 X射线平片显示：正常膝关节骨质正常；早期骨关节炎患者关节间隙稍狭窄，内侧髁间嵴轻度骨质增生；晚期骨关节炎患者左膝关节明显骨质增生，关节间隙明显狭窄，关节面下骨质密度增高；滑膜组织横断位PDW-SPAIR图像显示：早期骨关节炎患者有渗出性的滑膜积液及少许增生的滑膜组织，晚期骨关节炎患者有明显的滑膜积液及多发的絮状滑膜组织，见图1。

2.2 组织学观察
2.2.1 各组患者膝关节滑膜炎病理学分级光镜下可见正常的关节滑膜组织分为衬里层和衬里下层，衬里层是由相互重叠成2层或3层的滑膜衬里组成，见图2A，滑膜炎评分为0分，按照KRENN评分标准为无滑膜炎；早期膝骨关节炎滑膜衬里层增生，细胞层数可达3层或4层，衬里下层细胞数目增多，轻度新生血管生成，见图2B，滑膜炎评分为4分，按照KRENN评分标准为低级别滑膜炎；晚期膝骨关节炎滑膜呈绒毛状大量增生，细胞层数达5-9层，衬里下层细胞数目明显增多，巨噬细胞和淋巴细胞明显浸润，呈弥漫分布，见图2C，滑膜炎评分为7分，按照KRENN评分标准为高级别滑膜炎。3组滑膜炎评分相比，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.2.2 各组患者滑膜组织中铁沉积检测结果对滑膜组织进行普鲁士蓝染色后，光镜下观察发现对照组滑膜有极少量蓝色颗粒，见图3A，表示正常滑膜组织存在极少量的铁沉积。在骨关节炎组中，晚期膝骨关节炎患者滑膜中铁沉积多于早期膝骨关节炎患者，见图3B，C，且铁颗粒大部分沉积在血管及巨噬细胞周围，滑膜基质中沉积较少。

2.2.3 各组患者滑膜组织免疫组化检测结果见图4。

(1)ACSL4在各组滑膜组织中的表达：ACSL4在滑膜细胞的细胞质或细胞膜呈清晰棕黄色颗粒判为染色结果阳性。全部切片染色背景清晰，阴性对照不着色。ACSL4在正常膝关节滑膜组织几乎不表达，而在骨关节炎组表达明显，差异有显著性意义(P < 0.01)；ACSL4主要在早期膝骨关节炎组和晚期膝骨关节炎组的滑膜组织衬里层细胞和衬里下层的巨噬细胞内表达，与早期膝骨关节炎组相比，晚期膝骨关节炎组ACSL4表达量相对增多，差异有显著性意义(P < 0.01)。
(2)GPX4在各组滑膜组织中的表达：GPX4定位于滑膜细胞的细胞质中，呈现棕黄色(或棕褐色)颗粒为阳性表达，所有切片染色背景清晰，阴性对照不着色。GPX4在正常滑膜组织高度表达，其主要位于衬里下层的淋巴细胞与巨噬细胞内，与骨关节炎组相比差异明显(P < 0.01)。随着骨关节炎的进展，GPX4的阳性细胞数逐级降低，差异有显著性意义(P < 0.01)。
(3)肿瘤坏死因子α在各组滑膜组织中的表达：肿瘤坏死因子α在正常膝关节滑膜内几乎不表达，而在骨关节炎组阳性信号表达明显增强(P < 0.01)，主要位于滑膜衬里下层的细胞内，细胞形态以巨噬细胞和淋巴细胞为主，而早期膝骨关节炎组和晚期膝骨关节炎组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。
(4)环氧化酶2在各组滑膜组织中的表达：环氧化酶2在正常膝关节滑膜中几乎不表达，而在骨关节炎组阳性表达明显增强(P < 0.01)，主要在滑膜下层的巨噬细胞和淋巴细胞内表达，胞核染色深，呈团块状分布，早期膝骨关节炎组ACSL4的表达高于晚期膝骨关节炎组，差异有显著性意义(P < 0.01)。
2.2.4 各组滑膜组织ACSL4、GPX4蛋白表达水平与对照组相比，膝骨关节炎患者铁死亡相关指标ACSL4蛋白水平上调
(P < 0.01)，GPX4蛋白水平下调(P < 0.01)。随着骨关节炎的进展，ACSL4的表达含量逐渐升高，GPX4的表达含量逐渐下降，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图5。

2.2.5 各组患者滑膜组织免疫荧光结果在激光共聚焦显微镜下观察，细胞核全部被DAPI染色呈蓝色荧光；ACSL4和GPX4 阳性反应为颗粒状绿色荧光。与对照组相比，早期膝骨关节炎组滑膜组织GPX4荧光强度增加，且晚期膝骨关节炎组荧光强度低于早期膝骨关节炎组。与对照组相比，膝骨关节炎组滑膜组织中ACSL4荧光强度明显增加，且晚期膝骨关节炎组荧光强度高于早期膝骨关节炎组，ACSL4散在分布于最表层的滑膜细胞和衬里下层的部分炎性细胞，部分呈点状颗粒聚集，见图6。

参考文献

[1] SHARMA L. Osteoarthritis of the Knee. N Engl J Med. 2021;384(1):51-59.
[2] HUNTER DJ, BIERMA-ZEINSTRA S. Osteoarthritis. Lancet. 2019;393(10182):1745-1759.
[3] ATUKORALA I, KWOH CK, GUERMAZI A, et al. Synovitis in knee osteoarthritis: a precursor of disease? Ann Rheum Dis. 2016;75(2):390-395.
[4] SUN Y, CHEN P, ZHAI B, et al. The emerging role of ferroptosis in inflammation. Biomed Pharmacother. 2020;127:110108.
[5] YUAN H, LI X, ZHANG X, et al. Identification of ACSL4 as a biomarker and contributor of ferroptosis. Biochem Biophys Res Commun. 2016;478(3):1338-1343.
[6] WEN Q, LIU J, KANG R, et al. The release and activity of HMGB1 in ferroptosis. Biochem Biophys Res Commun. 2019;510(2):278-283.
[7] HSU HH, HU WS, LIN YM, et al. JNK suppression is essential for 17β-Estradiol inhibits prostaglandin E2-Induced uPA and MMP-9 expressions and cell migration in human LoVo colon cancer cells. J Biomed Sci. 2011;18(1):61.
[8] BRIGELIUS-FLOHÉ R, FLOHÉ L. Regulatory Phenomena in the Glutathione Peroxidase Superfamily. Antioxid Redox Signal. 2020;33(7):498-516.
[9] NAKANO R, KITANAKA T, NAMBA S, et al. Non-Transcriptional and Translational Function of Canonical NF-κB Signaling in Activating ERK1/2 in IL-1β-Induced COX-2 Expression in Synovial Fibroblasts. Front Immunol. 2020;11:579266.
[10] DIXON SJ, LEMBERG KM, LAMPRECHT MR, et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 2012;149(5):1060-1072.
[11] 中华医学会骨科学分会.骨关节炎诊治指南(2007年版)[J].中国矫形外科杂志,2014,22(3):287-288.
[12] KELLGREN JH, LAWRENCE JS. Radiological assessment of osteo-arthrosis. Ann Rheum Dis. 1957;16(4):494-502.
[13] PETERFY CG, GUERMAZI A, ZAIM S, et al. Whole-Organ Magnetic Resonance Imaging Score (WORMS) of the knee in osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2004;12(3):177-190.
[14] 余正红,蔡胥,钟世镇,等.膝骨性关节炎性滑膜炎的临床特征及其意义[J].广东医学,2008,29(4):573-575.
[15] KRENN V, MORAWIETZ L, KÖNIG B, et al. Low-grade-/high-grade-synovitis: synovitis-score as a gold standard. Orthopade. 2006;35(8):853-859.
[16] CHEN X, KANG R, KROEMER G, et al. Ferroptosis in infection, inflammation, and immunity. J Exp Med. 2021;218(6):e20210518.
[17] MORRIS CJ, BLAKE DR, WAINWRIGHT AC,et al. Relationship between iron deposits and tissue damage in the synovium: an ultrastructural study. Ann Rheum Dis. 1986;45(1):21-26.
[18] FRITZ P, SAAL JG, WICHEREK C, et al. Quantitative photometrical assessment of iron deposits in synovial membranes in different joint diseases. Rheumatol Int. 1996;15(5):211-216.
[19] MENDONÇA R, SILVEIRA AA, CONRAN N. Red cell DAMPs and inflammation. Inflamm Res. 2016;65(9):665-678.
[20] JING X, LIN J, DU T, et al. Iron Overload Is Associated With Accelerated Progression of Osteoarthritis: The Role of DMT1 Mediated Iron Homeostasis. Front Cell Dev Biol. 2021;8:594509.
[21] VAN VULPEN LF, ROOSENDAAL G, VAN ASBECK BS, et al. The detrimental effects of iron on the joint: a comparison between haemochromatosis and haemophilia. J Clin Pathol. 2015;68(8):592-600.
[22] NIEUWENHUIZEN L, SCHUTGENS RE, VAN ASBECK BS, et al. Identification and expression of iron regulators in human synovium: evidence for upregulation in haemophilic arthropathy compared to rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and healthy controls. Haemophilia. 2013;19(4):e218-e227.
[23] FORCINA GC, DIXON SJ. GPX4 at the Crossroads of Lipid Homeostasis and Ferroptosis. Proteomics. 2019;19(18):e1800311.
[24] LIAO P, WANG W, WANG W, et al. CD8+ T cells and fatty acids orchestrate tumor ferroptosis and immunity via ACSL4. Cancer Cell. 2022;40(4):365-378.e6.
[25] ATTUR M, KRASNOKUTSKY S, STATNIKOV A, et al. Low-grade inflammation in symptomatic knee osteoarthritis: prognostic value of inflammatory plasma lipids and peripheral blood leukocyte biomarkers. Arthritis Rheumatol. 2015; 67(11):2905-2915.
[26] MARCU KB, OTERO M, OLIVOTTO E, et al. NF-kappaB signaling: multiple angles to target OA. Curr Drug Targets. 2010;11(5):599-613.
[27] QIU G, ZHONG S, XIE J, et al. Expanded CD1c+CD163+ DC3 Population in Synovial Tissues Is Associated with Disease Progression of Osteoarthritis. J Immunol Res. 2022;2022:9634073.
[28] MURRAY-BROWN W, GUO Y, SMALL A, et al. Differential expansion of T peripheral helper cells in early rheumatoid arthritis and osteoarthritis synovium. RMD Open. 2022;8(2):e002563.
[29] MIOTTO G, ROSSETTO M, DI PAOLO ML, et al. Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1. Redox Biol. 2020;28:101328.
[30] WEI S, QIU T, WANG N, et al. Ferroptosis mediated by the interaction between Mfn2 and IREα promotes arsenic-induced nonalcoholic steatohepatitis. Environ Res. 2020;188:109824.

引言

骨关节炎是一种常见的致残性疾病，最常累及膝关节，膝骨关节炎约占全世界骨关节炎负担的85%[1]。目前尚无有效的治愈或逆转膝骨关节炎进程的治疗方法，最终只能进行人工全膝关节置换术，给个人及社会带来了巨大的健康与经济负担[2]。因而，早发现、早治疗是膝骨关节炎防治的重点和难点。新近研究发现滑膜炎在膝骨关节炎发生发展过程中起关键作用，而且滑膜炎可能是膝骨关节炎的超早期表现[3]，有望成为膝骨关节炎早期防治最具潜力的新靶点。
铁死亡(Ferroptosis)是新近发现的一种非凋亡形式的细胞死亡，具有铁依赖性，以细胞内活性氧堆积为特征，主要受膜脂修复酶——谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)调控，其可通过脂氧合酶和环氧化酶产物参与炎症反应进程[4]。酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(Acyl-CoA
synthetase long chain family member 4，ACSL4)通过影响细胞内氧化与抗氧化平衡系统进而引起细胞铁死亡的发生[5]，是多不饱和脂肪酸代谢的重要同工酶，负责将辅酶A酯化成游离脂肪酸，而酰基辅酶A的形成激活相应的脂肪酸进行脂质过氧化。目前已有研究发现铁死亡能触发机体先天固有免疫，激活机体炎症反应[6]。在骨关节炎滑膜中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平升高会刺激环氧化酶2的表达，从而刺激前列腺素E2的产生[7]。而铁死亡可通过脂氧合酶和环氧化酶途径参与炎症反应进程[8]。GPX4也可对NF-κB信号通路进行调控，抑制脂氧合酶[9]，降低细胞内的活性氧水平，减轻机体炎症反应。GPX4是细胞内最重要的抗脂质过氧化酶，亦是铁死亡的核心调控因子，一旦GPX4缺乏，即可诱发铁死亡并引发炎症反应发生。
目前已发现GPX4介导的铁死亡可参与肿瘤、心血管疾病、炎性疾病的发生机制[10]，但铁死亡是否也可通过此途径参与膝骨关节炎滑膜炎的发生尚不清楚。该试验旨在探究GPX4介导的铁死亡与膝骨关节炎滑膜炎发生发展的关联，有助于深入理解膝骨关节炎滑膜炎的发生机制及寻找潜在干预靶点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计临床对照试验。数据符合正态分布，3组数据比较采用单因素方差分析one-way ANOVA，然后进行Tukey HSD (Tukey Honest Significant Differences)，以在各组均值之间进行多次成对比较，数据不符合正态分布则进行秩和检验。
1.2 时间及地点试验于2021年9月至2022年11月在南方医科大学第三附属医院中心实验室完成。
1.3 对象
1.3.1 患者基本信息及分组纳入2021年9月至2022年11月在南方医科大学附属第三医院关节外科与运动医学科拟行膝关节镜或关节置换手术的患者。膝骨关节炎患者纳入标准：①符合中华医学会风湿病学分会的《骨关节炎诊断及治疗指南》的诊断标准[11]；②X射线平片检查符合Kellgren-Lawrence分级标准的1-4级[12]；③年龄41-80岁；④无下肢严重血管疾病；⑤无MRI检查禁忌证；⑥签署知情同意书。排除标准：①不符合上述纳入标准者；②合并类风湿疾病者；③合并有严重的心脑血管和肾脏疾病患者；④孕妇或哺乳期妇女；⑤不能配合检查者。
另选取因半月板损伤或韧带撕裂行关节镜治疗的青壮年患者为对照组，任选一侧膝关节作为研究对象。对照组纳入标准：①无膝关节晨僵、疼痛等症状；②膝关节X射线平片检查Kellgren-Lawrence分级为0级；③年龄13-30岁；④无下肢严重血管疾病；⑤无MRI检查禁忌证；⑥签署知情同意书。排除标准：①不符合上述纳入标准者；②合并有其他类风湿疾病或者心脑血管疾病的患者；③孕妇或哺乳期妇女；④不能配合检查者。
按照纳入和排除标准，最终纳入膝骨关节炎患者43例，对照组患者10例。所有患者术前行膝关节X射线平片及MRI检查，根据Kellgren-Lawrence分级标准，将所有患者分为膝关节对照组(KLG 0)10例，男7例，女3例，平均年龄21.3岁，平均患病时间0.35个月；早期膝骨关节炎组(KLG 1，2)20例，男9例，女11例，平均年龄44.2岁，平均患病时间16.3个月；晚期膝骨关节炎(KLG 3，4)23例，男8例，女15例，平均年龄65.5岁，平均患病时间160.5个月。3组年龄、性别、体质量指数比较差异均无显著性意义(均P > 0.05)。
该研究的实施经南方医科大学第三附属医院临床试验伦理委员会同意(伦审号：2022-伦审-053)。
1.3.2 主要试剂酰基辅酶A合成酶长链家族成员4抗体(重组Anti-FACL4)(ab155282)、GPX4抗体(ab125066)购自美国Abcam公司；环氧化酶2抗体(T58852)购自武汉博士德生物技术有限公司；肿瘤坏死因子α抗体(GTX110520)购自美国Gene Tex公司；普鲁士蓝染色液(核固红法)购自雷根生物公司。
1.4 方法
1.4.1 X射线平片检查所有患者入院时拍摄站立位双膝前后位X射线片，采用Siemens FD-X X射线机进行摄影。
1.4.2 MRI扫描所有患者在术前1-7 d，在3.0-T MR系统上对膝关节进行扫描。所有受试者仰卧位接受检查。膝关节MR成像用3.0T MR扫描仪(Philips Achieva，the Netherlands)，16通道膝关节专用线圈，扫描序列参数：①矢状面质子密度加权光谱绝热反转恢复(PDW-SPAIR)：TR 3 693 ms，TE 30 ms，FOV 180 mm×180 mm，矩阵360×270，层厚3.5 mm，层间距0.35 mm，层数24层，扫描时间155 s；②横断面T2W-SPAIR：TR 2 768 ms，TE 65 ms，FOV 180 mm×180 mm，矩阵392×232，层厚4 mm，层间距0.4 mm，层数24层，扫描时间105 s；③矢状面T2WI TSE：TR 3 204 ms，TE 10 ms，FOV 180 mm×
180 mm，层厚3.5 mm，层间距0.35 mm，层数24层，扫描时间109 s。MRI图像处理是将扫描数据传至医院PACS工作站(南方PACS workstation)进行后期分析。所有MRI图像均由2名放射科医生独立阅片(有5年以上的经验)，其对患者信息一无所知。根据改良版的全器官磁共振成像评分(WORMS)评估滑膜炎[13]。
1.4.3 标本处理手术室采集对照组患者、早期膝骨关节炎患者和晚期膝骨关节炎患者的滑膜标本，所有滑膜标本均依据余正红等[14]的研究，取患膝关节内侧腔隙滑膜组织，切取后立即将血迹用PBS洗净，以便后续以下处理：
(1)苏木精-伊红染色：将所取的滑膜组织放入40 g/L多聚甲醛固定24 h后，常规脱水、石蜡包埋、切片，切片厚度为4 μm，随后常规脱蜡水化、苏木精-伊红染色、二甲苯透明、中性树脂封固。光镜观察滑膜组织的组织学变化，并对滑膜炎进行评分和分级。滑膜炎病理学分级按KRENN标准[15]，光镜下依滑膜细胞增生程度、血管增生程度、炎性细胞浸润程度判断，分别计为0-3分，最终3者之和即为滑膜炎得分，将滑膜炎分为3级，即无滑膜炎(0-1分)、低级别滑膜炎(2-4分)、高级别滑膜炎(5-9分)，得分越高代表炎性反应越重。
(2)普鲁士蓝染色：将所取的滑膜组织放入40 g/L多聚甲醛固定24 h后，常规脱水、石蜡包埋、切片，切片厚度为4 μm，常规脱蜡水化后先进行蒸馏水冲洗60 s，然后普鲁士蓝染色40 min后再次冲洗，核固红剂核染10 min后脱水透明、中性树脂封固，于光镜下观察蓝色铁沉积情况。
(3)免疫组织化学染色：所取的滑膜组织放入40 g/L多聚甲醛固定24 h后，常规脱水、石蜡包埋、切片，连续切片4张，切片厚度为4 μm，2片分别用于ACSL4、GPX4、肿瘤坏死因子α和环氧化酶2免疫组化染色(SP法)，另外2片用PBS替代一抗作为阴性对照，随后进行烤片(65 ℃ 1 h)，梯度乙醇脱蜡至水，抗原修复(高压热修复法)，山羊血清封闭，一抗[抗FACL4(1∶200)、抗GPX4(1∶200)、抗肿瘤坏死因子α(1∶200)和抗环氧化酶2 (1∶100)]4 ℃孵育过夜，二抗37℃孵育20 min，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。光镜观察滑膜细胞ACSL4、GPX4、肿瘤坏死因子α和环氧化酶2的阳性表达。用Image J 8.0 图像分析系统定位定量分析试验结果。每组组织切片选择400×视野，切片需要包含滑膜各层结构，各组标本阳性细胞面积值除以组织总面积得到各组阳性面积率。
(4)免疫荧光染色：所取的滑膜组织放入40 g/L多聚甲醛固定24 h后，常规脱水、石蜡包埋、切片，同上一步脱脂，各梯度乙醇脱水，抗原修复(具体步骤同免疫组化)，山羊血清室温封闭1 h，吸水纸吸掉封闭液不洗，每张玻片滴加足够量的兔抗ACSL4、GPX4一抗(稀释比例1∶200)，放入湿盒4 ℃孵育过夜，PBST浸洗爬片3次，每次3 min，吸水纸吸干多余液体后，滴加适当稀释(1∶80)的FITC-Goat Anti-Rabbit IgG荧光二抗，湿盒中37 ℃孵育1 h，PBST浸洗爬片3次，每次3 min(从加荧光二抗起，后面步骤均在较暗处进行)，之后滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行复染核，PBST洗去多余DAPI 3次，每次5 min，用吸水滤纸吸干滑膜玻片上的液体，抗荧光衰减封片剂封固，荧光显微镜蓝色荧光激发后观察并采集图像。
(5)Western blot：将取到的滑膜标本先液氮保存，之后将标本进行手动研磨，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心吸取上清，提取总蛋白，蛋白定量，加入上样缓冲液，100 ℃煮5 min，SDS-PACE凝胶电泳，电泳结束后将目的蛋白转至PVDF膜，脱脂牛奶封闭，加ACSL4、GPX4一抗(稀释比例1∶200)孵育过夜，次日加入二抗孵育，PBS清洗，ECL发光仪发光拍照，采用Image J 8.0软件进行蛋白定量分析。
1.5 主要观察指标 ①各组骨关节炎的病理评分；②各组滑膜组织铁沉积含量；③ACSL4、GPX4、肿瘤坏死因子α和环氧化酶2表达。
1.6 统计学分析所有数据以x±s表示。使用GraphPad Prism版本8.0.2进行统计分析。单因素方差分析one-way ANOVA用于确定3组之间的差异，然后进行Tukey HSD(Tukey Honest Significant Differences)，以在各组均值之间进行多次成对比较。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经南方医科大学第三附属医院生物统计学专家审核。

讨论

膝骨关节炎病程发展缓慢，目前尚无有效的治愈或逆转疾病进程的治疗方法[2]，需要尽早发现并积极治疗以延缓疾病进展。近年来，随着对骨关节炎发生机制研究的深入，滑膜炎已被认为是导致软骨降解引起患者临床体征和疾病症状进展的一个主要因素[3]。在早期膝骨关节炎患者中，73%有滑膜增厚的表现，提示滑膜炎可能是骨关节炎的原发性表现[16]。
因此，积极治疗滑膜炎有助于延缓骨关节炎的进程。此外，也有研究发现膝骨关节炎滑膜炎与铁代谢异常关系密切[17]。膝骨关节炎患者滑液铁浓度明显高于类风湿关节炎患者和健康人[18]。另有研究表明滑膜组织铁沉积可通过参与调控原癌基因C-MYC和MDM2等关键基因的表达而参与滑膜血管翳生长的启动[19]，从而促进血管性滑膜炎的发生。
该试验根据术前3.0磁共振检查和X射线平片检查将患者分为对照组、早期骨关节炎组和晚期骨关节炎组，苏木精-伊红染色结果表明早期膝骨关节炎滑膜血管增生和炎性反应较晚期膝骨关节炎明显，晚期膝骨关节炎滑膜衬里层细胞数量明显增加。然后进一步进行了普鲁士蓝染色，与对照组相比，膝骨关节炎的滑膜组织中有铁蓄积，且铁含量的多少与骨关节炎的进展有关。这与JING 等[20]的发现一致，在骨关节炎小鼠软骨下骨的骨髓和滑膜中观察到大量含铁血黄素沉积。人类风湿关节炎患者中也发现滑膜铁积累[21]。有人认为铁元素的增加可能是来自于通过微出血或炎症滑膜渗出进入关节的血液[22]。
GPX4将脂质氢过氧化物转化为脂质醇，防止了铁(Fe2+)依赖性形成毒性脂质活性氧，脂质过氧化物生成减少，从而抑制铁死亡的发生[23]。ACSL4是发生代谢相关疾病的关键因素，有研究表明将γ干扰素与花生四烯酸(一种在肿瘤微环境中发现的脂肪酸)结合起来，可以激活ACSL4，改变肿瘤细胞的脂质模式，并天然地诱导肿瘤细胞铁死亡[24]。该试验通过免疫组织化学法检测ACSL4、GPX4在骨关节炎滑膜组织及正常滑膜组织中的表达，结果显示：ACSL4在正常滑膜组织低度表达，在骨关节炎组表达含量明显增多，差异明显
(P < 0.01)；而GPX4在正常滑膜组织高度表达，但在骨关节炎组表达含量明显减少，差异明显(P < 0.01)； Western blot结果和免疫荧光也显示同样的结果，这与铁死亡的发生是一致的。ACSL4、GPX4等被认为是铁死亡调控中的关键和有效蛋白，所以作者推测骨关节炎中存在铁死亡现象，且通过抑制铁死亡，减少脂质氧化、铁积累、GPX4的消耗，从而可以进一步抑制滑膜炎的进展。
铁死亡可通过脂氧合酶和环氧化酶途径参与炎症反应进程，而这一过程可进一步加剧铁死亡的发生[4]。肿瘤坏死因子α是环氧化酶2的强诱导剂，在骨关节中高表达[25]。该试验发现炎症因子环氧化酶2、肿瘤坏死因子α在正常滑膜组织中低表达，但在骨关节炎组表达量增多(P < 0.01)；早期膝骨关节炎组环氧化酶2呈高表达状态，与晚期膝骨关节炎组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，而早期膝骨关节炎组与晚期膝骨关节炎组肿瘤坏死因子α不存在显著性差异(P > 0.05)。作者猜测这种差别的原因可能是因为骨关节炎的炎症在早期是最强的，早期和晚期骨关节炎患者的滑膜细胞群功能上不同[26]，晚期骨关节炎淋巴组织弥漫浸润和脂肪细胞变性[27]，而在早期骨关节炎中表现为单个核细胞浸润增加和促炎递质过表达[28]，因此骨关节炎不同阶段滑膜组织微环境是有差异的，炎症递质在早期骨关节炎中的过表达很可能激活了相关通路，而GPX4通过抑制脂氧合酶[9]，降低细胞内的活性氧水平，减轻机体炎症反应。在骨关节炎组中GPX4缺乏，氧化还原防御功能受损，消除炎症的作用减弱，所以炎症递质环氧化酶2和肿瘤坏死因子α表达量增多，说明GPX4在骨关节炎的进展中可能起保护作用。
总而言之，滑膜炎的强度在进行性关节损伤中起关键作用，不同级别的滑膜炎铁死亡表现不同，GPX4在早期膝骨关节炎滑膜组织的表达高于晚期膝骨关节炎滑膜组织，因此作者可以在早期使用铁死亡抑制剂例如Fer-1或者ACSL4抑制剂抑制铁死亡发生[29-30]，从而延缓滑膜炎的进展，减少炎症因子的表达，进一步减少软骨细胞的损伤，预防或治疗骨关节炎的发生，但是具体的作用机制仍需进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

谷胱甘肽过氧化物酶4介导铁死亡在膝骨关节炎滑膜炎发生发展中的作用

Effect of ferroptosis mediated by glutathione peroxidase 4 in the occurrence and progression of synovitis in knee osteoarthritis

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张克凡, 石辉. 细胞因子治疗骨关节炎的研究现状及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 961-967.
[2]	申飞燕, 姚吉祥, 苏珊珊, 赵忠民, 唐巍东. 敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 499-504.
[3]	买斯吐热木·黑力力, 张婉霞, 尼加提·努尔穆罕默德, 买买提吐逊·吐尔地. 关节腔注射医用臭氧对早期颞下颌骨关节炎模型大鼠髁突组织学的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 505-509.
[4]	刘宇涵, 樊渝江, 王启光. 早期创伤性膝骨关节炎动物模型构建方案的比较[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 542-549.
[5]	刘潞兴, 狄鸣远, 杨强. 中药有效成分治疗骨关节炎机制中的信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 609-614.
[6]	闫炳翰, 李志超, 苏辉, 薛海鹏, 徐展望, 谭国庆. 中药单体靶向自噬治疗骨关节炎的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 627-632.
[7]	陈俊炎, 孟庆奇, 李斯明. 关节腔注射治疗骨关节炎药物载体系统中的软骨靶向功能[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 458-463.
[8]	刘宝方, 徐斌, 陈雷. 葛根汤治疗骨关节炎的网络药理学分析及动物实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 193-199.
[9]	孟志成, 乔卫平, 赵阳, 刘洪飞, 李凯杰, 马博. 免疫细胞及相关细胞因子在骨关节炎发病及治疗中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 280-287.
[10]	农复香, 蒋志雄, 李英豪, 许文聪, 施智兰, 罗慧, 张晴朗, 钟爽, 唐梅文. 外泌体调控铁死亡在疾病诊断治疗中的应用与作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-10.
[11]	贺茜, 万瑀, 唐玉婷, 杨安宁, 吴凯, 焦运, 白志刚, 姜怡邓, 沈江涌. 铁死亡诱导剂抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-.
[12]	申飞燕, 姚吉祥, 苏珊珊, 赵忠民, 唐巍东. 敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-6.
[13]	李晓敏, 田向东 , 谭冶彤 , 朱光宇 , 王荣田 , 王剑 , 薛志鹏, 马晟, 胡元一, 黄叶, 丁天送. 骨质疏松性内侧室膝骨关节炎胫骨高位截骨后下肢力线及膝关节功能的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1325-1329.
[14]	杜雪婷, 张晓东, 陈焱君, 王梅, 陈武标, 黄文华. 压缩感知技术在踝关节2D MR成像中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1396-1402.
[15]	黄林科, 韦林华, 蒋捷, 刘倩, 陈蔚蔚. 雌激素与跑台运动干预卵巢切除模型小鼠骨量和关节软骨的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1166-1171.