2.1   实验动物数量分析   32只大鼠分为2组，全部纳入统计分析。
2.2   苏木精-伊红染色结果   大鼠0周时正常根尖周范围未见明显炎症。未封菌组和封菌组开髓术后1周，可见少量以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润，并且炎性浸润范围比较小，未见明显骨破坏区域；术后2周，牙槽骨吸收明显，并且炎症浸润带扩大，出现了淋巴细胞、巨噬细胞；术后3周，炎症进入慢性期，虽然牙槽骨吸收加剧，炎症反应继续加重，同时也伴有毛细血管与成纤维细胞增生的机体修复状态；术后4周，炎性细胞可见明显减少，且局限在根尖部位，可见散在淋巴细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润，表现慢性浸润状态，牙槽骨破坏最严重。苏木精-伊红染色结果显示，封菌组和未封菌组均成功构建根尖周炎，见图2。



2.3   免疫组织化学染色结果    通过免疫组织化学染色检测Foxp3在大鼠根尖周的表达，其主要定位于淋巴细胞，表达在淋巴细胞核内，阳性细胞的染色呈黄褐色和深褐色，低倍镜下寻找到实验牙位的根尖周病变区域，随后对阳性细胞计数后取均值，观察Foxp3的表达变化，见图3。

0周组大鼠根尖周几乎无Foxp3的表达；未封菌组大鼠Foxp3在1，2周表达量较低，3周开始上升，4周达到高峰；封菌组大鼠Foxp3在1，2周表达较低，3周时到达高峰，4周时降低，低于未封菌组；1，2，4周大鼠Foxp3表达两组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；3周时Foxp3表达两组差异之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。



2.4   RT-PCR结果   通过 RT-PCR检测Foxp3在大鼠根尖周组织部位 mRNA表达情况。未封菌组和封菌组根尖周组织区域中的Foxp3均较0周时高(P < 0.05)；未封菌组大鼠1，2，3周时轻微增高，4周时达到峰值；封菌组大鼠1，2，3周逐步增高，且均比未封菌组高，3周到达峰值后开始降低，2周封菌组大鼠Foxp3 mRNA表达显著高于未封菌组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

[1] 凌均棨,韦曦,刘红艳. 难治性根尖周炎的病因及防治策略[J]. 中华口腔医学杂志,2010,45(1):52-57. [2] ZHANG C, DU J, PENG Z. Correlation between Enterococcus faecalis and Persistent Intraradicular Infection Compared with Primary Intraradicular Infection: A Systematic Review. J Endod. 2015;41(8):1207-1213.  [3] PERSOON IF, ÖZOK AR. Definitions and Epidemiology of Endodontic Infections. Curr Oral Health Rep. 2017;4(4):278-285.  [4] 张昱佳,钱友坤,朱一成,等.FOXP3~+调节性T细胞与非感染性炎症疾病[J].生命科学,2020,32(9):879-889.  [5] 严妍,那迪娜·帕尔哈提,车千纪,等.FOXP3~+调节性T细胞与人体传染性疾病[J].生命科学,2020,32(11):1159-1175. [6] SAKAGUCHI S, MIKAMI N, WING JB, et al. Regulatory T Cells and Human Disease. Annu Rev Immunol. 2020;38:541-566.  [7] 伊刚,赵毅,解丰,等.单细胞RNA测序揭露人FOXP3+调节性T细胞稳定性的关键调控分子(英文)[J]. Science Bulletin. 2020,65(13): 1114-1124. [8] YOSHIDA H, JONTELL M, SUNDQVIST G,et al. Effect of sonicated material from Fusobacterium nucleatum on the functional capacity of accessory cells derived from dental pulp. Oral Microbiol Immunol. 1995;10(4):208-212.  [9] 张文娟,谭昭,蔡如佳,等.调节性T细胞在慢性牙周炎小鼠模型中的作用[J].中国医科大学学报,2021,50(2):135-140. [10] 李宝坤,陈晓涛,杨柯,等.慢性牙周炎患者外周血CD4~+CD25~+调节性T细胞表达[J].中华实用诊断与治疗杂志,2019,33(5):487-490. [11] 吕广应,刘乙臻,张秀梅,等.叉头样转录因子3和白细胞介素10在慢性根尖周炎组织中的表达研究[J].实用口腔医学杂志,2019, 35(5):653-657.  [12] YANG S, ZHU L, XIAO L, et al. Imbalance of interleukin-17+ T-cell and Foxp3+ regulatory T-cell dynamics in rat periapical lesions. J Endod. 2014;40(1):56-62. [13] WANG L, JIN H, AO X, et al. JAK2-STAT3 signaling pathway is involved in rat periapical lesions induced by Enterococcus faecalis. Oral Dis. 2019;25(7):1769-1779.  [14] STUART CH, SCHWARTZ SA, BEESON TJ, et al. Enterococcus faecalis: its role in root canal treatment failure and current concepts in retreatment. J Endod. 2006;32(2):93-98.  [15] ZHANG C, DU J, PENG Z. Correlation between Enterococcus faecalis and Persistent Intraradicular Infection Compared with Primary Intraradicular Infection: A Systematic Review. J Endod. 2015;41(8):1207-1213.  [16] 李莹雪,王雨霏,张凌琳.粪肠球菌在牙髓根尖周病中致病机制及抗菌治疗的研究进展[J].口腔疾病防治,2019,27(8):535-540.  [17] GOMES BPFA, HERRERA DR. Etiologic role of root canal infection in apical periodontitis and its relationship with clinical symptomatology. Braz Oral Res. 2018;32(suppl 1):e69.  [18] KINANE DF, LAPPIN DF, KOULOURI O, et al. Humoral immune responses in periodontal disease may have mucosal and systemic immune features. Clin Exp Immunol. 1999;115(3):534-541.  [19] GRAVES DT, OATES T, GARLET GP. Review of osteoimmunology and the host response in endodontic and periodontal lesions. J Oral Microbiol. 2011;3:10.3402/jom.v3i0.5304.  [20] COLIĆ M, GAZIVODA D, VUCEVIĆ D,et al. Proinflammatory and immunoregulatory mechanisms in periapical lesions. Mol Immunol. 2009;47(1):101-113. [21] DE CARVALHO FRAGA CA, ALVES LR, DE SOUSA AA, et al. Th1 and Th2-like protein balance in human inflammatory radicular cysts and periapical granulomas. J Endod. 2013;39(4):453-455.  [22] NAUFEL AO, AGUIAR MCF, MADEIRA FM, et al. Treg and Th17 cells in inflammatory periapical disease: a systematic review. Braz Oral Res. 2017;31:e103.  [23] HORI S, NOMURA T, SAKAGUCHI S. Pillars Article: Control of Regulatory T Cell Development by the Transcription Factor Foxp3. Science. 2003; 299:1057-1061.  [24] VAN DER VEEKEN J, GLASNER A, ZHONG Y, et al. The Transcription Factor Foxp3 Shapes Regulatory T Cell Identity by Tuning the Activity of trans-Acting Intermediaries. Immunity. 2020;53(5):971-984.e5.  [25] 周欣. Th17细胞和Treg细胞在大鼠实验性牙周炎牙周组织中的分布和意义[D].石家庄:河北医科大学,2018. [26] STADHOUDERS R, LUBBERTS E, HENDRIKS RW. A cellular and molecular view of T helper 17 cell plasticity in autoimmunity. J Autoimmun. 2018; 87:1-15.  [27] LI Y, WEI C, XU H, et al. The Immunoregulation of Th17 in Host against Intracellular Bacterial Infection. Mediators Inflamm. 2018;2018: 6587296.   [28] ROWE JH, ERTELT JM, WAY SS. Foxp3(+) regulatory T cells, immune stimulation and host defence against infection. Immunology. 2012; 136(1):1-10. [29] PENG G, GUO Z, KINIWA Y, et al. Toll-like receptor 8-mediated reversal of CD4+ regulatory T cell function. Science. 2005;309(5739):1380-1384.  [30] FORWARD NA, FURLONG SJ, YANG Y, et al. Signaling through TLR7 enhances the immunosuppressive activity of murine CD4+CD25+ T regulatory cells. J Leukoc Biol. 2010;87(1):117-125.  [31] 纪周新,贺德.粪肠球菌脂磷壁酸激活Toll样受体2抑制胰腺导管癌BxPC-3细胞的增殖、侵袭和迁移[J].中国肿瘤生物治疗杂志, 2021,28(5):477-481. [32] JOHANNS TM, ERTELT JM, ROWE JH, et al. Regulatory T cell suppressive potency dictates the balance between bacterial proliferation and clearance during persistent Salmonella infection. PLoS Pathog. 2010; 6(8):e1001043.  [33] 税钰森,吕潇颖,李静雅,等.粪肠球菌在口腔及全身系统性疾病中的致病相关因素及其机制的研究进展[J].国际口腔医学杂志, 2020,47(2):225-234. [34] 孟磊,刘雪,张蕾,等.压力状态下粪肠球菌培养上清液诱导人牙周膜细胞炎症反应的研究[J].中华口腔医学杂志,2021,56(4):335-341. [35] DONG M, JIN H, ZUO M, et al. The potential effect of Bruton’s tyrosine kinase in refractory periapical periodontitis. Biomed Pharmacother. 2019;112:108710.

[1]	龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣 慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.
[2]	廖益东, 明 江, 宋文学, 王梓力, 张 宇, 廖一飞, 徐卡娅, 杨 华. 一种同时培养原代皮质及海马神经元的实验方法[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 897-902.
[3]	李晓寅, 杨晓青, 陈淑莲, 李正超, 王梓琪, 宋 震, 朱达仁, 陈旭义. 胶原/丝素蛋白支架联合神经干细胞治疗创伤性脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 890-896.
[4]	王金玲, 黄夏荣, 屈萌艰, 黄福锦, 尹林伟, 钟培瑞, 刘 静, 孙光华, 廖 阳, 周 君. 运动训练老年骨质疏松大鼠骨量及骨微结构的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 676-682.
[5]	杨 恒, 郑丽英, 刘志立, 王勤章, 郝志强, 王敬珅, 汪 渊, 李永乐, 谭明辉, 邹晓峰, 张国玺, 黄若辉, 江 波, 钱 彪. 结扎不同部位输精管大鼠睾丸的生理功能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 720-725.
[6]	胡 月, 朱垸樑, 万腾刚, 胥方元, 胥章彧, 李佶钖, 李 丹, 王剑雄. 神经病理性疼痛大鼠疼痛-抑郁行为学特点及左侧无粒型岛叶皮质背侧区mGluR5/NMDAR2B蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(20): 3216-3223.
[7]	刘运琴, 林 丽, 肖文昊, 戢秋明, 刘燕芹. 淫羊藿苷对精神分裂症模型大鼠认知及海马组织NRG1/ErbB信号通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(20): 3236-3241.
[8]	陈晓驷, 谭小艳, 刘田丰, 韩登鹏, 魏 波, 胡资兵, 吴少科. 积雪草酸对骨质疏松模型大鼠生物力学特性与骨小梁面积及Runx2蛋白的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 246-251.
[9]	王欢欢, 王 青, 唐 鹏, 张 睿, 闵红巍. 体外冲击波干预骨关节炎大鼠软骨细胞的增殖和自噬[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 252-257.
[10]	税晓平, 李春莹, 李明娟, 李顺昌, 孙君志, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病模型大鼠海马抗氧化应激指标和脑源性神经营养因子表达的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 264-269.
[11]	娄旭佳, 阮 蓉, 金其贯, 胡玉龙. 白藜芦醇干预运动性疲劳模型大鼠线粒体动力学的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(17): 2625-2630.
[12]	战 莹, 武晓丹, 郝珊瑚. 放射性131Ⅰ 诱导的甲状腺功能减退大鼠模型的构建[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(17): 2631-2636.
[13]	王 京, 卢思彤, 吴印林, 刘玉东, 邹维艳, 孙美群. 新生SD大鼠大脑皮质神经元的原代培养及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(15): 2344-2349.
[14]	徐明奎, 许日明, 林业武, 罗原泰, 张熙辉, 周 理, 袁仕国. 柚皮素调控巨噬细胞极化和肌卫星细胞增殖修复骨骼肌损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(14): 2133-2138.
[15]	胡金龙, 全桦红, 王静成, 张 佩, 张家乐, 陈鹏涛, 梁 远. 温敏性水凝胶Pluronic F127载硫化铜纳米颗粒修复大鼠感染性创面[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(12): 1927-1931.

慢性根尖周炎是一种慢性炎症性疾病，是发生在牙齿根尖组织并由混合细菌感染所导致。临床上根管治疗是慢性根尖周炎的最佳治疗方法，然而这种治疗可能会失败。这可能是粪肠球菌作为优势菌群造成的，这类疾病被称为难治性根尖周炎[1]。研究表明，粪肠球菌是迁延不愈的难治性根尖周炎的优势菌群[2-3]。

叉头样转录因子3(forkhead box protein 3，Foxp3)是Foxp大家族中十分重要的一员，参与调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)的活性调节。研究发现，在细胞核中特异性表达Foxp3的天然Treg存在于正常个体中，并积极参与抑制针对自身、微生物和环境抗原的异常或过度的免疫反应，在感染性疾病中，像疟疾、血吸虫病、RSV感染、肝炎、艾滋病、新型冠状肺炎，以及非感染性疾病中的IPEX、克罗恩肠病、帕金森等，特异性表达Foxp3的天然Treg与机体病情发展息息相关，Tregs有显著的适应环境的能力，不仅通过控制炎症，还通过更特殊的机制，如生长因子的产生，促进组织稳态 [4-6]。最近的研究结果揭示了对Treg及其微环境的认识，以及炎症过程中稳态的潜在动力学[7]。根管治疗失败所导致的难治性根尖周炎与细菌及其毒性产物的持久性有关，它们会改变宿主的防御系统，例如，YOSHIDA等[8]报道，超声处理的粪肠球菌提取物可以抑制或刺激牙髓干细胞中的Tregs增殖。

研究表明，FOXP3+调节性T细胞(FOXP3+Treg)参与慢性牙周炎的致病过程，其介导的免疫炎症反应减弱，会促进疾病的发生发展[9-10]。Foxp3在动物实验性根尖周炎中的表达随着时间的发展而上升，以及在慢性根尖周炎中的高表达，推测其在慢性根尖周炎中介导免疫反应增强[11]，可能是因为Foxp3和Th17(辅助性T细胞17)的失衡所致[12]。虽然Foxp3在慢性根尖周炎等慢性炎症中有过相关研究，但其在难治性根尖周炎中的研究较少。目前，国内外很多学者都致力于研究免疫疗法在根尖周病治疗中的应用以及细胞因子在根尖周病发生发展中的作用。因此该研究通过粪肠球菌建立大鼠难治性根尖周炎，以Foxp3作为检测因子，研究其在根尖周疾病中的作用，探讨Fopx3与粪肠球菌、难治性根尖周炎的关系。应用组织学以及荧光定量PCR(RT-PCR)技术，对难治性根尖周炎中Foxp3的变化趋势进行了简单的观察并分析Fopx3在难治性根尖周炎病中可能的相关因素，为日后进一步探讨其具体作用机制以及为难治性根尖周炎的临床治疗提供医学基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，进行One-way ANOVA和多重比较LSD-t检验。
1.2   时间及地点   实验于2020-2021年在山东省口腔组织再生重点实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   32只6周龄雄性SD大鼠，SPF级，体质量200 g左右，健康状况可，购买于济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK(鲁)20190003。于山东省口腔重点实验室动物实验中心常规水食饲养。实验方案经济南市口腔医学院动物实验伦理委员会批准。
1.3.2   主要实验仪器   便携式电动牙科手机(啄木鸟 HL11-M4，中国)；电热恒温培养箱(天津市中环实验电炉有限公司HH.B11-420，中国)；石蜡切片机(LEICA 2235，德国)；光学显微照相系统(OLYMPUS BX-51，日本)；Real Time PCR仪(LIGHTCYCLER96，瑞士)；石蜡包埋机(SLEE MPS-P，德国)；烘片仪(孝感市诺普电子科技有限责任公司NP-P2，中国)。
1.3.3   主要实验试剂   粪肠球菌[微生物菌种保存中心(ATCC29212)，中国]；DAB显色试剂盒(中杉金桥，中国)；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(Solarbio，中国)；Foxp3多克隆抗体(博奥森bs-10211R，中国)；小鼠/兔链霉卵白素-生物素法检测系统(中杉金桥SP-9000，中国)； PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa No.RR047A，日本)；TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa No.RR820A，日本)；柱式Trizol总RNA抽提试剂盒(生工生物UNIQ-10，中国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   建立实验动物模型   选取6周龄左右的SD大鼠，随机各选16只为未封菌组和封菌组。建立实验模型：未封菌组大鼠两侧下颌第1磨牙开髓后用根管锉探查根管，确保开髓成功，髓腔中封入含有PBS无菌缓冲液的棉球；封菌组大鼠相同方法开髓后封入含有粪肠球菌悬液(1.0×108 CFU/mL)的棉球。两组的冠方封闭均用流动树脂充填，光固化灯光照固化。水食室温条件喂养，时间截点选择1，2，3，4周，收集大鼠下颌骨组织，空白对照组不予开髓处理，设成0周组。

1.4.2   制备标本及石蜡切片   3%戊巴比妥钠按0.01 mL/g进行腹腔注射麻醉，40 g/L多聚甲醛进行组织内固定，见大鼠四肢呈僵直状态剥离大鼠双侧下颌骨，放入甲醛固定24-48 h。10%EDTA(pH值7.2-7.4)中磁力计搅拌器上室温脱钙2个月，梯度乙醇脱水后透明浸蜡，制作石蜡包块，3个月内进行石蜡切片，厚度5 μm，4 ℃保存。
1.4.3   苏木精-伊红染色观察根尖周组织学变化   常温下石蜡切片脱蜡复水；苏木精染色1 min，自来水浸泡3 min；伊红复染3 min，自来水浸泡；梯度乙醇脱水；二甲苯透明；中性树胶封固；于通风橱晾干后显微镜下拍照，观察根尖周组织的变化，判断模型是否建立成功。
1.4.4   免疫组织化学(IHC)染色观察根尖部位Foxp3的表达 石蜡切片烤片后脱蜡复水，室温下PBS清洗3次，5 min/次；0.1%胰酶进行抗原修复，37 ℃，15 min；室温下PBS清洗3次，5 min/次；体积分数3%H2O2孵育，37℃，20 min；室温下PBS清洗3次，5 min/次；山羊血清封闭液封闭，37 ℃，30 min；滴加Foxp3抗体(1∶150)孵育过夜，4 ℃；次日取出后室温下PBS清洗3次，5 min/次；滴加生物素标记抗小鼠/兔IgG聚合物孵育，37℃，30 min；室温下PBS清洗3次，5 min/次；滴加辣根酶标记链卵白素工作液，37 ℃，20 min；室温下PBS清洗3次，5 min/次；镜下控制DAB显色，苏木精复染，温水返蓝后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜计数。镜下显示成黄褐色或者棕褐色颗粒的记为阳性细胞个数。低倍镜下寻找到实验牙位的根尖周病变区域，每个根尖周围随机选取5个高倍镜(400x)下该区域内非连续视野进行拍照，对阳性细胞计数后取均值，每组实验重复3次。
1.4.5   RT-PCR检测根尖周部位Foxp3的表达   大鼠处死后在冰上立即取下下颌第1磨牙根尖组织样本，用TRIZOL法提取动物组织RNA，根据RNA浓度进行稀释，-80 ℃储存备用，进行反转录成cDNA保存在-20 ℃。取材流程可见图1。

由苏州金唯智生物科技有限公司设计并合成引物。Foxp3上游引物序列：CCT GCC ACC TGG GAT CAA TG，下游引物序列：CGT GGG AAG GTG CAG AGT AG；选取GAPDH为设定内参，其上游引物序列：TCT CTG CTC CTC CCT GTT CT，下游引物序列：ATC CGT TCA CAC CGA CCT TC。反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s；循环40次。每个样本设3个复孔，20 μL反应体系，通过熔融曲线分析确定引物的特异性。采用2-ΔΔCt方法计算样本mRNA的相对变化量，每组实验重复3次。
1.5   主要观察指标   ①大鼠根尖周组织病损区Foxp3阳性细胞的表达量；②大鼠根尖周组织病损区Foxp3的 mRNA表达情况。
1.6   统计学分析   结果中相关数据全部用x±s表示，通过Graphpad Prism 8.0软件进行分析，同时运用One-way ANOVA法和多重比较LSD-t检验，比较两组之间Foxp3的表达情况。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经滨州医学院生物统计学专家审核。

根尖周疾病的临床治疗主要目的是清除引起根管感染的细菌。然而，在某些情况下，根管治疗并不能完全将感染彻底清除，在X射线片上的根尖周围组织仍表现为持续性低密度影像。粪肠球菌是在根管治疗仍未痊愈的根管内最常检测出的细菌，在难治性根尖周炎病例中的检出率为22%-77%，因此被认为是难治性根尖周炎的主要致病菌[3，14-15]。粪肠球菌极其容易获得耐药性，因为它可以在根管冲洗和药物的苛刻条件下生存，所以根管治疗并不能解决其根本问题。粪肠球菌通过黏附于宿主细胞表面释放毒性，不仅有脂磷壁酸(LTA)具有代表性的毒力因子，也包括聚集物质、表面黏附素和透明质酸酶等通过作用宿主炎性免疫应答的多个元件，从而不断入侵宿主的免疫防御，影响根尖周区的病变愈合[16-18]。在根尖周微环境中，有很多组织破坏与重建过程中的主要调节剂如转化生长因子、肿瘤坏死因子、白细胞介素等是影响炎症免疫反应的重要因素[19-20]。

在根尖周炎中公认的很重要的是 Th1 和 Th2 样细胞因子的发病机制[21]，然而最近研究发现根尖周病变发病机制中免疫调节机制和效应T细胞反应之间的相互作用是至关重要的，CD4+ Foxp3+Treg和辅助性T细胞(Th17)的失调模式改变了以往大家固有的Th1/Th2模式的思路。Treg/Th17解释了越来越多疾病的免疫及炎症过程，包括牙周病和其他涉及进行性骨吸收的疾病[22]。

Foxp3是一个独特和精确的标记物，其决定着Treg细胞分化和功能，即Foxp3是公认的treg标志性基因，因此可以作为这种细胞类型的一个关键性转录调控蛋白[23]。Foxp3基因在小鼠身上被证明了其缺失会导致全身各种免疫炎症反应甚至导致死亡[24]。Foxp3分泌的白细胞介素10、转化生长因子β能抑制效应 T 细胞的增殖分化，发挥免疫抑制、诱导免疫耐受和抗炎效应，同时大量的转化生长因子β也可以激活原始T细胞中释放Foxp3，继续产生抗炎反应[25]。Th17依赖维甲酸相关孤核受体γt  (retinoic acid-related orphan receptor γt，RORγt)分化后可以聚集中性粒细胞和巨噬细胞，促进炎症发展，而RORγt是由白细胞介素6 和白细胞介素23通过激活信号转导子和转录激活子(STAT3) 诱导的[26]，然而，白细胞介素6的存在却抑制了Foxp3的表达[27]，同时白细胞介素6竞争结合转化生长因子β，诱导RORγt并导致 Th17分化。所以说Foxp3+Treg和Th17的失衡会导致多种炎症性疾病。

近几年，Foxp3在慢性牙周炎中的研究成为热点，所以此次实验研究Foxp3在慢性根尖周炎以及难治性根尖周炎病程变化中不同时间截点中的表达量变化，利用苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色、RT-PCR方法对成功建立的大鼠实验性根尖周炎以及口腔内粪肠球菌感染的模型中做了表达检测，对Foxp3在难治性根尖周炎发展中的作用以及其可能性进行了初步的探讨。此次实验发现，Foxp3的表达在实验性根尖周炎以及难治性根尖周炎的动物模型中，会随着病情发展变化呈现出一定的规律性表现：1周，根尖区均可见免疫炎症反应，是少量中性粒细胞浸润的轻度炎症表现；2周，根尖区中性粒细胞以及淋巴细胞等大量炎性细胞较大范围浸润，同时开始伴随着轻微骨破坏，炎症开始进入急性期；3周，两组根尖周围病变均开始慢慢发展为慢性炎症阶段，可见病损周围的纤维结缔组织增生与骨吸收的机体修复与破坏方式并行；4 周，可见根尖周围破坏严重，明显形成了炎症灶，炎症范围慢慢局限在了根尖周区域，淋巴细胞、中性粒等炎症细胞散在浸润。与此同时，发现大鼠根尖病损区域的Foxp3阳性表达水平在未封菌组中4周到达峰值，但是在封菌组中3周达到峰值，然后开始降低，4周时明显低于未封菌组；RT-PCR 检测Foxp3在两种根尖周病损组织中表达情况与免疫组织化学检测结果基本相似；同时，未封菌组呈上升趋势，4周达到高峰，而封菌组呈倒“V”型，3周到达高峰后降低，各组之间比较差异均有显著性意义 (P < 0.05)。对于封菌组3周组可能由于RNA反转录以及翻译成蛋白质时有一些情况，干扰了Foxp3在基因和蛋白水平上表达的一致性。封菌组前3周相较未封菌组增长快速，范围更大的原因可能是粪肠球菌作为一个炎性毒力因子在刺激中性粒细胞淋巴细胞巨噬细胞等免疫炎症细胞从骨髓间释放出来，更快激活了机体的细胞及体液免疫机制。而在4周时两实验组同时进入了慢性炎症期。

此次实验中发现术后3周，炎症开始进入慢性阶段，大量淋巴细胞在此聚集，淋巴细胞是机体免疫应答功能的重要细胞组成，对抗外界感染，是一种具有免疫识别功能的细胞系，Foxp3+Treg是其中重要的一个分类。但奇怪的是同样处于慢性期炎症，封菌组的Foxp3的表达量明显低于未封菌组，这值得去思考是否因为Foxp3与粪肠球菌所导致的慢性炎症有某些特异性相关因素。研究发现，Foxp3+Treg细胞在细菌、真菌、病毒等感染中具有保护宿主的作用。有证据证明，在沙门氏菌感染期间，Treg抑制能力的动态调节与炎症细胞因子和纯化的toll样受体配体在体外刺激后控制Treg抑制的能力一致[28]。toll样受体2是最早被发现的toll样受体之一，位于细胞表面，可识别多种病原相关分子模式，是革兰阳性菌的主要识别受体。同样为革兰菌的粪肠球菌也通过toll样受体和其他模式识别受体，刺激免疫细胞对treg的刺激，对其产生巨大的抑制作用[29-30]。假设在持续感染期间，单个、多个或累积toll样受体配体表达的变化控制着介导抑制的treg相关分子的相对表达，沙门氏菌在这种持续感染的进展中的特异性配体及其相应的宿主受体指示减少这些Treg抑制[31-32]。已知粪肠球菌可以激活toll样受体[5，33-34]，从而猜测其在体内通过抑制Foxp3+Treg，继而影响了Treg和Th17之间的平衡，使得机体对抗细菌感染的能力减弱。所以此次实验中借鉴已有成熟实验，通过髓腔内封含有粪肠球菌混悬液的体内模型[13，35]，观察发现在慢性期的难治性根尖周炎模型中，Foxp3的表达量明显低于普通根尖周炎模型的慢性期，进而推测因为粪肠球菌的毒力因子脂磷壁酸的刺激下，导致炎症细胞因子toll样受体激活，抑制Foxp3+Treg的细胞增殖，导致了Foxp3+Treg和Th17的失衡，影响T细胞发挥自身免疫抗炎，使得根尖周的一种持续性骨破坏以及根尖周的生物膜难以轻易消除，从而成为了难治性根尖周炎。但是，该实验仍存在一定的局限性，并未具体研究难治性根尖周炎中Foxp3和Th17的关系，因此对于Foxp3在难治性根尖周炎中的调节剂机制仍尚不明确，今后课题组将继续研究粪肠球菌抑制Foxp3的机制，为难治性根尖周炎的临床治疗提供新思路。

通过该实验得出Foxp3不仅同时参与了慢性根尖周炎和难治性根尖周炎的致病过程。同时在难治性根尖周炎的慢性期，Foxp3与难治性根尖周炎的优势菌——粪肠球菌密切相关。综合以往关于Foxp3的免疫炎症相关的复杂相关研究考虑，需要进一步认识到该转录因子的多种生物学功能，认清其在难治性根尖周炎中作用机制，以促进全新或更有效的治疗策略发展。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
难治性根尖周炎：慢性根尖周炎持续发展，表现为复发性的根尖周脓肿并导致严重的牙槽骨破坏，临床上对其的常规治疗为根管治疗，但经过反复数次治疗仍然迁延不愈的被称为难治性根尖周炎。
叉头样转录因子3(forkhead box protein 3，Foxp3)：调节性T细胞(Treg)在机体自身免疫调节中充当着关键角色，其标志性分子之一是核转录因子Foxp3，Foxp3是Foxp家族中一位重要成员，可以直接通过调节各种各样特殊基因来影响调节性T细胞的活性。该基因缺失可以引起不同程度的免疫性疾病。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

根尖周炎是临床中常见到的多种细菌混合感染性疾病，治疗成功率受多种因素影响，其中根管内感染物的类型起到很重要的作用。Foxp3是一个独特和精确的标记物，其决定着Treg细胞分化和功能，即Foxp3是公认的treg标志性基因，因此可以作为这种细胞类型的一个关键性转录调控蛋白。Foxp3基因在小鼠身上被证明了其缺失会导致全身各种免疫炎症反应甚至导致死亡。近几年，Foxp3在慢性牙周炎中的研究称为热点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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