美洲大蠊研粉干预脊髓半横断大鼠运动功能和自噬蛋白Beclin-1的表达

doi:10.12307/2023.965

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (8): 1223-1228.doi: 10.12307/2023.965

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美洲大蠊研粉干预脊髓半横断大鼠运动功能和自噬蛋白Beclin-1的表达

周邦瑜1，李杰1，阮玉山2，耿福能3，李绍波4

1大理大学临床医学院，云南省大理市 671000；2大理大学第一附属医院脊柱外科，云南省大理市 671000；3 药用美洲大蠊四川省重点实验室，四川省西昌市 615000；4大理大学临床医学院外科教研室，云南省大理市 671000

收稿日期:2022-11-10 接受日期:2023-01-05 出版日期:2024-03-18 发布日期:2023-07-18
通讯作者: 李绍波，硕士，教授，硕士生导师，大理大学临床医学院外科教研室，云南省大理市 671000
作者简介:周邦瑜，男，1996年生，云南省普洱市人，拉祜族，主要从事骨科学脊髓损伤方面的研究。
基金资助:
云南省科技厅高校联合项目-面上项目(2019FH001-015)，项目负责人：李绍波；云南省教育厅科学研究基金项目(2022Y865)，项目负责人：周邦瑜；大理大学第一附属医院杰出中青年人才基金项目(DFYJC-202114)，项目负责人：阮玉山

Effects of Periplaneta americana powder on motor function and autophagic protein Beclin-1 in rats undergoing spinal cord hemisection

Zhou Bangyu1, Li Jie1, Ruan Yushang2, Geng Funeng3, Li Shaobo4

1Clinical Medicine Collage, Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China; 2Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China; 3Sichuan Key Laboratory of Medicinal American Cockroach, Xichang 615000, Sichuan Province, China; 4Department of Surgery, Clinical Medicine College, Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China

Received:2022-11-10 Accepted:2023-01-05 Online:2024-03-18 Published:2023-07-18
Contact: Li Shaobo, Master, Professor, Master’s supervisor, Department of Surgery, Clinical Medicine College, Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China
About author:Zhou Bangyu, Clinical Medicine Collage, Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China
Supported by:
General Joint Project of Yunnan Provincial Department of Science and Technology for Universities, No. 2019FH001-015 (to LSB); Scientific Research Fund of Yunnan Provincial Department of Education, No. 2022Y865 (to ZBY); Outstanding Young and Middle-aged Talents Fund of the First Affiliated Hospital of Dali University, No. DFYJC-202114 (to RYS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

BBB评分：评分分为3部分，第一部分为0-7分，评判动物后肢各关节活动；第二部分为8-13分，评判后肢的步态及协调功能；第三部分为14-21分，评判运动中爪的精细动作。评分越高说明动物的后肢运动功能越好。
自噬蛋白Beclin-1：是自噬起始端的一个因子，在自噬中起到重要作用。Beclin-1与酵母自噬基因Atg6/Vps30是同源基因，在自噬起始阶段与Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶、酵母同源Vps34、Vps15以及ATG14等相结合形成Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶复合物，在自噬启动时发挥重要作用。自噬蛋白Beclin-1的表达升高表示着自噬水平增加。

背景：脊髓损伤有氧化应激、炎症、凋亡、自噬等机制参与其中，激活自噬可改善脊髓损伤后的神经运动功能，对脊髓起保护作用。

目的：探讨美洲大蠊研粉对脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能和损伤区域自噬蛋白Beclin-1的影响。
方法：取30只6-8周龄SD大鼠，采用随机数字表法分为3组，每组10只：假手术组仅打开椎板，暴露脊髓后缝合；生理盐水组与美洲大蠊组均建立左侧脊髓半横断损伤模型，术后第1天开始分别灌胃给予生理盐水与美洲大蠊研粉，连续给药14 d。术后6 h及1，3，7，14 d 行BBB评分，观察后肢运动功能的情况；给药14 d后处死大鼠，采用免疫组化染色、Western Blot检测、免疫荧光染色检测脊髓半横断损伤区域自噬蛋白Beclin-1的表达情况。

结果与结论：①随着术后时间的延长，生理盐水组、美洲大蠊组大鼠BBB评分逐渐升高；与假手术组比较，生理盐水组、美洲大蠊组术后6 h及1，3，7，14 d 的BBB评分均降低(P < 0.05)；美洲大蠊组术后7，14 d 的BBB评分高于生理盐水组(P < 0.05)；②免疫组化染色显示，假手术组Beclin-1呈弱阳性表达，主要位于胞浆；生理盐水组Beclin-1主要位于胞浆，可见部分核膜表达；美洲大蠊组Beclin-1主要位于胞浆，可见部分核膜表达；生理盐水组、美洲大蠊组Beclin-1阳性细胞比例多于假手术组(P < 0.05)，美洲大蠊组Beclin-1阳性细胞比例多于生理盐水组(P < 0.05)；③Western Blot检测与免疫荧光染色显示，生理盐水组、美洲大蠊组Beclin-1蛋白表达高于假手术组(P < 0.05)，美洲大蠊组Beclin-1蛋白表达高于生理盐水组(P < 0.05)；④结果表明，美洲大蠊研粉能够改善脊髓半横断损伤大鼠的后肢运动功能，机制可能是美洲大蠊研粉中的多糖类物质增加了自噬蛋白Beclin-1的表达。

https://orcid.org/0000-0001-7332-5162(周邦瑜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脊髓损伤, 脊髓半横断损伤, 美洲大蠊研粉, 自噬, Beclin-1, 运动功能

Abstract: BACKGROUND: Spinal cord injury involves mechanisms such as oxidative stress, inflammation, apoptosis and autophagy. Activation of autophagy can improve neuromotor function after spinal cord injury and play a protective role in the spinal cord.
OBJECTIVE: To investigate the effects of Periplaneta americana powder on hindlimb motor function and the autophagy protein Beclin-1 in the injured site of rats after spinal cord hemisection.
METHODS: Thirty Sprague-Dawley rats, 6-8 weeks of age, were randomly divided into three groups (n=10 per group). In the sham-operated group, the lamina was just opened to exposure the spinal cord followed by suturing. Normal saline group and Periplaneta americana powder group both underwent left hemisection of the spinal cord to prepare animal models of spinal cord hemisection. The normal saline group was continuously gavaged with normal saline for 14 days, and the Periplaneta americana powder group was continuously gavaged with Periplaneta americana powder for 14 days. The Basso Beattie Bresnahan scale score was performed at the 6th hour, 1st day, 3rd day, 7th day and 14th day after operation to observe the hindlimb motor function. After 14 days of administration, the rats were sacrificed and sampled. Immunohistochemistry, western blot and immunofluorescence were used to detect the expression of Beclin-1 in the injured site of the spinal cord after hemisection.
RESULTS AND CONCLUSION: After operation, the Basso Beattie Bresnahan scale scores were gradually increased in the normal saline group and Periplaneta americana powder group. Compared with the sham-operated group, the Basso Beattie Bresnahan scale scores were significantly reduced in the normal saline group and Periplaneta americana powder group at the 6th hour, 1st day, 3rd day, 7th day and 14th day after operation (P < 0.05). The Basso Beattie Bresnahan scale scores in the Periplaneta americana powder group were significantly higher than those in the normal saline group at the 7th and 14th days after operation
(P < 0.05). Immunohistochemical staining showed that Beclin-1 was weakly positive in the sham-operated group, mainly expressed in the cytoplasm; in the normal saline group, Beclin-1 was mainly expressed in the cytoplasm and partially expressed in the nuclear membrane; in the Periplaneta americana powder group, Beclin-1 was mainly expressed in the cytoplasm and partially expressed in the nuclear membrane. The proportion of Beclin-1 positive cells was higher in the normal saline and Periplaneta americana powder groups than in the sham-operated group (P < 0.05), while the proportion of Beclin-1 positive cells was higher in the Periplaneta americana powder group than in the normal saline group (P < 0.05). Western blot assay and immunofluorescence staining showed that the Beclin-1 protein expression was higher in the normal saline and Periplaneta americana powder groups than in the sham-operated group (P < 0.05), and moreover, the Beclin-1 protein expression was higher in the Periplaneta americana powder group than in the normal saline group (P < 0.05). To conclude, Periplaneta americana powder could improve the hindlimb motor function of rats with spinal cord hemisection injury, and the mechanism may be that polysaccharides in the Periplaneta americana powder increase the expression of Beclin-1.

Key words: spinal cord injury, spinal cord hemisection injury, Periplaneta americana powder, autophagy, Beclin-1, motor function

中图分类号:

周邦瑜, 李杰, 阮玉山, 耿福能, 李绍波. 美洲大蠊研粉干预脊髓半横断大鼠运动功能和自噬蛋白Beclin-1的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1223-1228.

Zhou Bangyu, Li Jie, Ruan Yushang, Geng Funeng, Li Shaobo. Effects of Periplaneta americana powder on motor function and autophagic protein Beclin-1 in rats undergoing spinal cord hemisection[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(8): 1223-1228.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物术后一般情况 30只大鼠均耐受手术，术后无死亡，全部进入结果分析。生理盐水组和美洲大蠊组大鼠术后出现食欲不振、尿潴留、血尿等，食欲在术后3 d逐渐恢复，发生尿潴留15只，每天予以膀胱按摩，早、中、晚各1次，1周后逐渐恢复，2周时均恢复自主排尿；血尿3只，自行好转。
2.2 各组大鼠运动功能比较生理盐水组、美洲大蠊组大鼠术后6 h左后肢功能均丧失，术后1 d可见部分大鼠左后肢肌肉有收缩活动，从术后第3天开始左后肢活动逐步提升，第7天髋关节、膝关节明显活动，第14天髋关节、膝关节、踝关节3个关节有明显的大幅度活动。美洲大蠊组大鼠术后第7天的后肢肌肉收缩、髋关节、膝关节大幅度运动情况优于生理盐水组，美洲大蠊组大鼠术后第14天频繁出现前后肢不协调的持续足底负重步行，生理盐水组仅偶尔出现前后肢不协调的负重步行，部分还处于足背负重步行。
术前各组大鼠BBB评分均为21分。生理盐水组、美洲大蠊组术后各时间段的BBB评分均低于假手术组(P < 0.05)，提示脊髓半横断损伤造模成功。随着术后时间的延长，生理盐水组、美洲大蠊组大鼠BBB评分逐渐升高。生理盐水组大鼠术后7，14 d的BBB评分低于美洲大蠊组(P < 0.05)，其余时间点两组间BBB评分比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图1。

2.3 各组大鼠脊髓损伤区域自噬蛋白Beclin-1的定位及表达免疫组化染色可见自噬蛋白Beclin-1主要位于细胞胞浆和核膜，见图2。假手术组大鼠脊髓损伤区域Beclin-1呈弱阳性表达，主要位于胞浆，呈淡棕色散在分布，表明正常脊髓组织低自噬状态；生理盐水组大鼠脊髓损伤区域自噬蛋白Beclin-1主要位于胞浆，可见部分核膜表达，呈棕色散在分布；美洲大蠊组大鼠脊髓损伤区域自噬蛋白Beclin-1主要位于胞浆，可见部分核膜表达，为深棕色。

生理盐水组、美洲大蠊组与假手术组比较Beclin-1阳性细胞百分比升高(P < 0.05)，美洲大蠊组Beclin-1阳性细胞百分比高于生理盐水组(P < 0.05)，见图3。

2.4 各组大鼠脊髓损伤区域Beclin-1蛋白免疫荧光染色结果自噬蛋白Beclin-1呈红色荧光，主要位于细胞浆，部分位于核膜。假手术组大鼠脊髓损伤区域Beclin-1荧光颜色较浅，呈暗红色，散在性分布；生理盐水组大鼠脊髓损伤区域Beclin-1荧光为红色，呈散在性分布；美洲大蠊组大鼠脊髓损伤区域Beclin-1荧光为亮红色，颜色较鲜艳，聚集性分布，见图4。

使用Image-J对图片进行半定量分析，检测自噬蛋白Beclin-1表达的平均灰度值与阳性细胞百分比。与假手术组比较，生理盐水组、美洲大蠊组自噬蛋白Beclin-1表达平均灰度值升高(P < 0.05)，美洲大蠊组自噬蛋白Beclin-1表达平均灰度值高于生理盐水组(P < 0.05)，见图5A。与假手术组比较，生理盐水组、美洲大蠊组Beclin-1阳性细胞百分比升高(P < 0.05)，美洲大蠊组 Beclin-1阳性细胞百分比高于生理盐水组(P < 0.05)，见图5B。

2.5 各组大鼠脊髓损伤区域Beclin-1蛋白Western blot检测结果 Western blot检测自噬蛋白Beclin-1并对条带灰度值分析，结果显示：与假手术组比较，生理盐水组、美洲大蠊组大鼠脊髓损伤区域Beclin-1蛋白表达升高(P < 0.05)，美洲大蠊组大鼠脊髓损伤区域Beclin-1蛋白表达高于生理盐水组(P < 0.05)，见图6。

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引言

脊髓损伤是指因多种因素使脊髓受损而导致损伤平面以下的肢体瘫痪、感觉异常、运动功能障碍的一种疾病[1]。脊髓半横断损伤是脊髓损伤的特殊类型，主要表现为病变同侧损伤平面以下的肢体瘫痪和感觉障碍及对侧痛觉、温觉丧失[2]。脊髓损伤并发症带来的长期慢性疼痛等影响，给患者造成了巨大的身心折磨及经济负担[1-4]。脊髓损伤的治疗主要是尽早行减压手术及使用激素、血管活性药物等，后期可采用细胞移植等方法促使神经再生，治疗措施有限[5]。
脊髓损伤有氧化应激、炎症、凋亡、自噬等机制参与其中，激活自噬可改善脊髓损伤后的神经运动功能，对脊髓有保护作用[6-7]，可能成为脊髓损伤治疗的新靶点。自噬受到自噬相关基因调控，Beclin-1是自噬的核心蛋白之一，在自噬起始阶段发挥着重要的作用[8]。
美洲大蠊研粉主要包括多糖、肽类、氨基酸类等有效成分[9]，临床研究中已经用于治疗肛周脓肿、单纯性肛瘘等术后的创面愈合[10-11]。基础研究已证实，美洲大蠊研粉具有降血糖、保护肾脏[12]、抗腹泻等作用[13]。美洲大蠊研粉中的糖类物质可通过抗炎、抗氧化、免疫调节作用改善小鼠急性肠炎[14]，肽类物质通过抑制肿瘤细胞生长发挥抗肿瘤作用[15]，氨基酸成分具有助睡眠的功效[16]。
美洲大蠊研粉在脊髓损伤治疗中的应用未见报道，其是否能够改善脊髓半横断损伤后大鼠的后肢运动功能，是否通过自噬对脊髓半横断损伤起保护作用均属未知。此次实验拟通过美洲大蠊研粉干预脊髓半横断损伤大鼠，探讨自噬蛋白Beclin-1在其中的作用，为脊髓损伤的治疗提供新的参考。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，符合正态分布、方差齐性的计量资料采用单因素方差分析；正态分布、方差不齐或非正态分布的计量资料采用非参数检验。
1.2 时间及地点实验于2022年4-9月在大理大学实验动物中心、大理大学临床医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物与分组雌性SD大鼠30只，6-8周龄，体质量200-250 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号：SCXK 京 2019-0008。饲养于大理大学实验动物中心鼠IVU观察室，术前适应性饲养1周，环境温度25-27 ℃，湿度40%-50%。
采用随机数字表法将30只大鼠分为假手术组、生理盐水组及美洲大蠊组，每组10只。该研究获得大理大学实验动物伦理委员会批准，批准号：2022-P2-86。
1.3.2 主要药物与试剂美洲大蠊研粉(药用美洲大蠊四川省重点实验室，批号：川20160179)；Beclin-1鼠单克隆抗体 (66665-1，美国Proteintech公司)； HRP山羊抗鼠 IgG(H+L)(SA00001，美国Proteintech公司)；羊抗鼠二抗(PR30009，美国Proteintech公司)；Alexa Fluor 594 标记山羊抗小鼠IgG(ab150120，美国abcam公司)；Fluoroshield DAPI封固剂、DAPI(ab104139，美国abcam公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物造模与分组干预[17] 腹腔注射0.3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉3组大鼠，假手术组仅打开椎板，暴露脊髓后缝合；美洲大蠊组和生理盐水组建造脊髓半横断损伤模型：以T10作为手术定位，行背部正中切口，分离椎旁肌暴露椎体，使用止血钳咬除椎板暴露脊髓，以正中后脊髓静脉为界，使用维也纳剪做左侧T10脊髓半横断损伤，手术结束后逐层缝合。腹腔注射头孢呋辛钠90 mg/kg预防感染，1次/d，连续3 d。单笼饲养并且予以膀胱按摩恢复自主排尿。
脊髓半横断损伤造模成功标准：观察大鼠后肢运动功能，表现为左侧活动障碍、感觉存在，右侧活动无障碍、感觉丧失。

分组干预：术后第1天开始，生理盐水组每天灌胃给予生理盐水5 mL，美洲大蠊组灌胃给予美洲大蠊研粉300 mg/(kg·d)(根据成人用量推荐口服3-6 g/d，取用3 g/d，按照《中药药理研究方法学》成人与大鼠剂量换算关系推算)，连续给药14 d。

1.4.2 各组大鼠BBB评分术后6 h及1，3，7，14 d，使用BBB评分评估SD大鼠后肢运动功能[18]。将大鼠放置在水平地面上行走，通过观察大鼠踝关节、膝关节、髋关节、行走和整体协调情况进行评分。评分使用双盲法重复测量数据，取平均值，评分越高说明大鼠的后肢运动功能越好。
1.4.3 取材[19] 给药14 d后，麻醉后暴露大鼠心脏，自制灌注针插入左心室剪破右心耳开始灌注，先用盐水后用40 g/L多聚甲醛，灌注时可见大鼠肢体摆动数次，停止摆动后持续灌注，当发现肝脏发白、肢体及尾部变硬时结束灌注，迅速以脊髓损伤点为中心长约1.5 cm取材，整个灌注过程持续1 h。
1.4.4 免疫组织化学法检测Beclin-1蛋白表达将脊髓组织蜡块包埋，切片后烤片、脱蜡，抗原修复；体积分数5%山羊血清室温封闭1 h；滴加Beclin-1抗体(1∶200)室温孵育1 h；滴加二抗孵育30 min；DAB染色5-10 min，苏木精染2 min，脱蜡、封固，光学显微下观察，利用Image-J 软件计数Beclin-1阳性细胞数。
1.4.5 免疫荧光法检测Beclin-1蛋白表达免疫荧光抗原修复同免疫组化，洗涤后0.3%PBST通透，体积分数5%山羊血清室温封闭2 h，滴加Beclin-1抗体(1∶100)4 ℃冰箱过夜，第2天复温后加二抗(1∶1 000)避光孵育2 h，DAPI染细胞核5 min后封固。荧光显微镜下观察拍片，利用Image-J 软件计数Beclin-1阳性细胞数。
1.4.6 Western Blot检测 Beclin-1蛋白表达提取各组脊髓组织总蛋白，每条泳道加入样品20 µg电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入Beclin-1 抗体(1∶8 000)孵育条带，4 ℃冰箱过夜；TBST液洗去一抗，加入二抗(1∶5 000)孵育1 h；滴加底物显色剂，使用蛋白质测定系统曝光，利用Image-J软件观察分析。
1.5 主要观察指标各组大鼠运动功能及脊髓损伤区域Beclin-1蛋白表达情况。
1.6 统计学分析所有数据均通过SPSS 25.0软件完成统计和分析，实验结果均为计量资料，以Shapiro-Wilk检验和/或直方图判断是否服从正态分布，正态分布计量资料以x±s形式表示，根据方差是否相等选用单因素方差分析(one-way ANOVA)(方差相等)或Kruskal-Wallis H检验(方差不相等)进行多组间比较，如有差异则进一步采用LSD法两两比较；非正态分布资料以M(Q)描述，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。重复测量资料采用重复测量资料的方差分析。P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经由大理大学第一附属医院路会侠专家审核。

讨论

脊髓损伤后自噬被激活。脊髓损伤早期的缺血、微环境紊乱等可引起氧化应激反应，导致活性氧增加[20]，活性氧可通过激活丝裂原活化蛋白激酶诱导自噬。毛细血管共济失调突变蛋白被过氧化氢氧化后直接激活磷酸腺苷活化蛋白激酶，磷酸腺苷活化蛋白激酶的激活抑制了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1，导致unc-51类激酶复合体易位到自噬起始位点，unc-51类激酶复合物招募并激活Beclin-1相关复合物Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶复合物生成磷脂酰肌醇 3-磷酸，接着磷脂酰肌醇 3-磷酸和吸收双蛋白1及效应蛋白相互作用形成隔离膜/自噬体，自噬体进一步延伸和扩展，最后自噬体成熟与溶酶体结合形成自噬溶酶体，将受损的细胞器降解[8，21]。转录因子EB是自噬调控因子，当细胞缺乏氨基酸时蛋白复合体1被抑制，转录因子EB去磷酸化，导致转录因子EB的核转位从而激活下游的自噬[22]。自噬可清除氧化应激损伤的线粒体和细胞器，延缓细胞死亡，维持细胞内环境稳态[21，23]。曾雪等[24]在木犀草素对脑缺血再灌注后氧化应激损伤的研究中发现，木犀草素可抑制线粒体分裂蛋白Drpl的表达，激活线粒体自噬流清除活性氧，自噬流的改善促进了线粒体自噬小体的形成，自噬小体将损伤的线粒体包裹后与溶酶体结合形成自噬溶酶体一同被降解，加速损坏的线粒体清除。
抗氧化剂在脊髓损伤中发挥了治疗作用。桦木酸通过增加磷酸腺苷活化蛋白激酶磷酸化和转录因子EB核易位，降低雷帕霉素磷酸化水平，上调自噬蛋白Beclin-1和LC-3B的表达增强自噬，并且降低活性氧产物8-羟基脱氧鸟苷、晚期氧化蛋白产物和丙二醛，通过激活磷酸腺苷活化蛋白激酶-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白-转录因子EB信号通路，增强自噬减少氧化应激损伤和神经元死亡，从而改善脊髓损伤结局[25]。其他抗氧化药物如褪黑素也可通过上调自噬蛋白Beclin-1和LC-3B表达，激活神经元自噬抑制凋亡，改善大鼠脊髓损伤后的运动功能[26]。美洲大蠊中的多糖具有清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、羟自由基以及抑制氧化应激产物超氧阴离子的能力[27]，可作为天然的抗氧化剂。LU等[14]的研究发现，美洲大蠊中的糖类物质治疗小鼠急性肠炎模型后可降低丙二醛水平，并增加超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶等抗氧化指标，表明从美洲大蠊研粉中提取的糖类物质有抗氧化的作用。研究表明抗氧化剂可激活自噬[25-26]，美洲大蠊研粉同样具有抗氧化性，可能具有促进自噬的作用。
Beclin-1是自噬起始端的一个因子，在自噬中起到重要作用。Beclin-1与酵母自噬基因Atg6/Vps30 是同源基因，在自噬起始阶段与Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶、酵母同源Vps34、Vps15以及ATG14等相结合形成Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶复合物，在自噬启动时发挥重要作用，Beclin-1的升高表示自噬水平增加 [8]。此次实验通过免疫组化染色、免疫荧光染色、免疫蛋白印迹等方法检测了脊髓半横断损伤区域Beclin-1的表达，结果显示与假手术组比较，生理盐水组和美洲大蠊组干预14 d 后自噬蛋白Beclin-1的表达均升高，说明大鼠受到脊髓半横断损伤后自噬被激活，损伤区域的自噬启动，这可能是脊髓损伤后机体为了减少继发性脊髓损伤带来的一系列损伤而产生的反应性保护作用。美洲大蠊研粉治疗14 d后脊髓半横断损伤大鼠损伤区域自噬蛋白Beclin-1的表达相对于生理盐水组进一步升高，提示脊髓损伤后美洲大蠊研粉可通过提高自噬蛋白Beclin-1的表达增强脊髓半横断损伤区域的自噬。美洲大蠊研粉增强自噬蛋白Beclin-1表达的机制可能与桦木酸通过激活磷酸腺苷活化蛋白激酶-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白-转录因子EB信号通路、上调自噬蛋白Beclin-1的表达一致。结合桦木酸、褪黑素、姜黄素、白藜芦醇等抗氧化剂均可在脊髓损伤中增强自噬，对脊髓损伤起保护作
用[25-29]，提示美洲大蠊研粉可能通过多糖类物质增强脊髓半横断损伤区域的自噬。
自噬可有效改善神经元损伤和脊髓损伤后的运动功能。原儿茶酸通过促进神经元自噬，降低活性氧含量，有效逆转毒性作用，减轻神经元的损伤[30]。桦木酸通过激活自噬，形成自噬溶酶体来消除受损的线粒体和活性氧，促进脊髓损伤后功能恢复[25]。BBB评分客观地反映了脊髓损伤的恢复情况，评分越高表示神经功能恢复越好[31]。此次实验结果发现，生理盐水组、美洲大蠊组两组大鼠从术后第3天开始BBB评分均开始上升，大鼠脊髓半横断损伤后左后肢运动功能随时间延长而改善，从肌肉收缩逐渐恢复到足底负重步行，时间越长左后肢功能恢复越好。经美洲大蠊研粉治疗14 d后，美洲大蠊组大鼠BBB评分在第7，14天均高于生理盐水组，后肢运动功能恢复更好。此次实验结果BBB评分趋势与褪黑素、姜黄素在脊髓损伤中的作用研究一致[26，29]，提示美洲大蠊研粉能提升大鼠脊髓半横断损伤后BBB评分，改善后肢运动功能。研究表明，有些中药成分可通过有效调控自噬通路影响自噬蛋白的表达发挥作用，从而促进脊髓损伤后的恢复[32]。赵琳等[33]研究发现，番茄红素可增加自噬蛋白Beclin-1和LC3的表达增强自噬，从而促进脊髓损伤后大鼠运动功能的恢复。此次实验结果显示，美洲大蠊组大鼠从给药后第7天起后肢肌肉收缩、髋关节、膝关节大幅度运动情况优于生理盐水组，第14天BBB评分高于生理盐水组，运动功能改善情况优于生理盐水组。治疗第14天，美洲大蠊组脊髓半横断损伤区域自噬蛋白Beclin-1的表达同样高于生理盐水组，说明脊髓损伤后美洲大蠊研粉不仅仅可以改善脊髓半横断损伤大鼠的后肢运动功能，还可以增加脊髓半横断损伤区域自噬蛋白Beclin-1的表达，提示美洲大蠊研粉可能通过增加脊髓半横断损伤区域自噬蛋白Beclin-1的表达增强自噬，改善脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能，对脊髓损伤起到保护作用。
综上所述，美洲大蠊研粉能改善脊髓半横断损伤大鼠的后肢运动功能，提高大鼠脊髓半横断损伤区域自噬蛋白Beclin-1的表达，其机制可能是美洲大蠊研粉中的多糖类物质增强了损伤区域的自噬而发挥作用的。下一步将探讨自噬在美洲大蠊研粉修复脊髓半横断损伤大鼠运动功能中的具体作用机制，为脊髓损伤的临床治疗提供实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

美洲大蠊研粉干预脊髓半横断大鼠运动功能和自噬蛋白Beclin-1的表达

Effects of Periplaneta americana powder on motor function and autophagic protein Beclin-1 in rats undergoing spinal cord hemisection

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