灵芝孢子干预糖尿病大鼠睾丸组织线粒体自噬及细胞的凋亡

doi:10.12307/2023.969

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (4): 562-568.doi: 10.12307/2023.969

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

灵芝孢子干预糖尿病大鼠睾丸组织线粒体自噬及细胞的凋亡

薛晶文1，2，王芳芳1，2，张欣1，逄瑞丰1，王肖烨1，马小茹1，2

佳木斯大学，1基础医学院，2基础医学院微生态-免疫调节网络与相关疾病重点实验室，黑龙江省佳木斯市 154007

收稿日期:2022-11-21 接受日期:2023-01-05 出版日期:2024-02-08 发布日期:2023-07-14
通讯作者: 马小茹，硕士，教授，佳木斯大学基础医学院，黑龙江省佳木斯市 154007
作者简介:薛晶文，女，1997年生，山西省临汾市人，汉族，佳木斯大学在读硕士，主要从事糖尿病与男性生殖损伤方面的研究。
基金资助:
黑龙江省省属高等学校科研经费项目(2021-KYYWF-0593)，项目负责人：王芳芳

Effect of ganoderma spore on mitochondrial autophagy and apoptosis in testicular tissue of diabetic rats

Xue Jingwen1, 2, Wang Fangfang1, 2, Zhang Xin1, Pang Ruifeng1, Wang Xiaoye1, Ma Xiaoru1, 2

1School of Basic Medicine, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China; 2Key Laboratory of Microecology-Immunomodulatory Network and Related Diseases, School of Basic Medicine, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China

Received:2022-11-21 Accepted:2023-01-05 Online:2024-02-08 Published:2023-07-14
Contact: Ma Xiaoru, Master, Professor, School of Basic Medicine, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China; Key Laboratory of Microecology-Immunomodulatory Network and Related Diseases, School of Basic Medicine, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China
About author:Xue Jingwen, Master candidate, School of Basic Medicine, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China
Supported by:
Scientific Research Project of Higher Education Institutions of Heilongjiang Province, No. 2021-KYYWF-0593 (to WFF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

线粒体自噬：是细胞特异性降解底物的自噬类型，指细胞通过自噬机制选择性地清除受损和功能失调的线粒体，维持机体线粒体的质量控制和稳态。线粒体介导体内氨基酸生物合成、脂肪酸氧化、类固醇代谢、活性氧的产生和解毒等众多途径，与体内代谢密切相联。异常代谢和细胞内应激会影响线粒体的正常功能，因此，各种代谢性疾病包括糖尿病、肥胖性疾病等会诱导线粒体的形态和功能改变。
灵芝孢子：是灵芝成熟释放的生殖细胞，其药理活性相比于灵芝其他活性物质具有更高且多样化的作用，是当今研究的热点。灵芝孢子具有众多药理活性如降糖、抗氧抗炎、增强体内免疫力等，当前不仅被推荐用于家庭保健食品，还应用于糖尿病、衰老、肿瘤等疾病的防治中。

背景：男性生殖障碍作为糖尿病的常见并发症近年来受到越来越多的关注。灵芝孢子具有降糖、抗氧化、抗炎等功效，但其对于糖尿病睾丸组织的调控机制尚未完全阐明。

目的：探讨灵芝孢子对糖尿病大鼠睾丸组织PTEN诱导激酶1/E3泛素蛋白连接酶通路及细胞凋亡的影响。
方法：采用随机数字表法将40只雄性SD大鼠分为正常组、高脂高糖组、糖尿病组、灵芝孢子干预组，每组10只：高脂高糖组、糖尿病组、灵芝孢子干预组给予高脂高糖饮食至实验结束；高脂高糖饮食1个月后，糖尿病组、灵芝孢子干预组腹腔注射链脲佐菌素30 mg/kg建立2型糖尿病模型；造模成功后，灵芝孢子干预组灌胃给予灵芝孢子300 mg/(kg·d)，其余3组灌胃给予等量生理盐水，持续给药12周。给药结束后，检测大鼠精子数量和形态、睾丸组织形态结构、血清睾酮和睾丸组织氧化应激水平，免疫组化分析PTEN诱导激酶1、E3泛素蛋白连接酶、抗核孔蛋白表达，Western blotting检测睾丸组织中PTEN诱导激酶1、E3泛素蛋白连接酶、抗核孔蛋白、程序性死亡受体1、微管相关蛋白轻链3 Ⅱ/Ⅰ、caspase3、剪切caspase3的蛋白表达。

结果与结论：①与正常组和高脂高糖组相比，糖尿病组大鼠精子数量减少(P < 0.01)，精子畸形率增加(P < 0.01)，血清睾酮浓度降低(P < 0.01)；与糖尿病组相比，灵芝孢子干预组大鼠精子数量增加(P < 0.05)，畸形率降低(P < 0.01)，血清睾酮浓度升高(P < 0.01)；②与正常组和高脂高糖组相比，糖尿病组大鼠睾丸组织中丙二醛水平升高(P < 0.01)，谷胱甘肽还氧化物酶和超氧化物歧化酶水平降低(P < 0.01)；与糖尿病组相比，灵芝孢子干预组大鼠睾丸组织中丙二醛水平降低(P < 0.01)，谷胱甘肽还氧化物酶和超氧化物歧化酶水平升高(P < 0.01)；③免疫组化染色显示，与正常组和高脂高糖组对比，糖尿病组大鼠睾丸组织中PTEN诱导激酶1、E3泛素蛋白连接酶阳性表达减少，抗核孔蛋白阳性表达增加；与糖尿病组相比，灵芝孢子干预组大鼠睾丸组织中PTEN诱导激酶1、E3泛素蛋白连接酶阳性表达增加，抗核孔蛋白阳性表达减少；④Western blotting检测显示，与正常组和高脂高糖组相比，糖尿病组PTEN诱导激酶 1、E3泛素蛋白连接酶、程序性死亡受体1蛋白表达及微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值降低(P < 0.05或P < 0.01)，抗核孔蛋白、caspase3、剪切caspase3的蛋白表达升高(P < 0.01)；与糖尿病组相比，灵芝孢子干预组PTEN诱导激酶 1、E3泛素蛋白连接酶、程序性死亡受体1蛋白表达及微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值升高(P < 0.05或P < 0.01)，抗核孔蛋白、caspase3、剪切caspase3的蛋白表达降低(P < 0.05或P < 0.01)；⑤结果显示，灵芝孢子可能通过激活PTEN诱导激酶1/E3泛素蛋白连接酶信号通路增强睾丸组织自噬水平，减少组织细胞的凋亡，以此保护睾丸组织。

https://orcid.org/0000-0002-1175-0654(薛晶文)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 糖尿病, 睾丸, PTEN诱导激酶1, E3泛素蛋白连接酶, 自噬, 灵芝孢子

Abstract: BACKGROUND: As a common complication of diabetes mellitus, male reproductive disorders have received increasing attention in recent years. Ganoderma spore have hypoglycemic, antioxidant and anti-inflammatory effects, but the regulatory mechanism for diabetic testicular tissue has not been fully elucidated.
OBJECTIVE: To investigate the effect of ganoderma spore on the PTEN-induced kinase 1/E3 ubiquitin ligase pathway and cell apoptosis in testicular tissue of diabetic rats.
METHODS: Forty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group, high fat and high sugar group, diabetic group and ganoderma spore group, with 10 rats in each group. The latter three groups were given high fat/high sugar diet until the end of the experiment. After 1 month of high fat/high sugar diet, the diabetic and ganoderma spore groups were given intraperitoneal injection of streptozotocin (30 mg/kg per day) to establish type 2 diabetic rat models. After successful modeling, the ganoderma spore group was intragastrically given ganoderma spore (300 mg/kg per day), and the other groups were given the same amount of normal saline for continuous 12 weeks. The sperm number and morphology were detected. The histopathological changes of the testicle were observed. Serum testosterone and oxidative stress levels in testicular tissue were measured. The levels of PTEN-induced kinase 1, E3 ubiquitin ligase, and anti-nucleoporin p62 were analyzed by immunohistochemistry and the expression of PTEN-induced kinase 1, E3 ubiquitin ligase, anti-nucleoporin p62, programmed cell death-1, microtubule-associated protein light chain 3 II/I, caspase 3, cleaved-caspase 3 were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal group and the high fat and high sugar group, the diabetic group had decreased sperm number (P < 0.01), increased sperm malformation rate (P < 0.01), and decreased serum testosterone level (P < 0.01). Compared with the diabetic group, ganoderma spore intervention could increase the sperm number (P < 0.05), decrease the malformation rate (P < 0.01), and increase the serum testosterone level (P < 0.01). Compared with the normal group and the high fat and high sugar group, the malondialdehyde level in testis tissue was increased in the diabetic group (P < 0.01), while the levels of glutathione deoxidase and superoxide dismutase decreased (P < 0.01). Compared with the diabetic group, the malondialdehyde level in testis tissue was decreased in the ganoderma spore group (P < 0.01), and the levels of glutathione deoxidase and superoxide dismutase increased (P < 0.01). Immunohistochemical staining showed that compared with the normal group and the high fat and high sugar group, the positive expressions of PTEN-induced kinase 1 and E3 ubiquitin ligase in testicular tissue were decreased in the diabetic group, while the positive expressions of anti-nucleoporin p62 were increased. Compared with the diabetic group, the positive expressions of PTEN-induced kinase 1 and E3 ubiquitin ligase in testicular tissue e were increased in the ganoderma spore group, while the positive expression of anti-nucleoporin p62 was decreased. Western blot assay results indicated that compared to the normal group and the high fat and high sugar group, the expression of PTEN-induced kinase 1 and E3 ubiquitin ligase, programmed cell death-1 and the ratio of microtubule-associated protein light chain 3 II/I protein were decreased in the diabetic group (P < 0.05 or P < 0.01), while the expressions of anti-nucleoporin p62, caspase3 and cleaved-caspase3 were increased (P < 0.01). Compared with the diabetic group, ganoderma spore intervention could elevate the expression of PTEN-induced kinase 1 and E3 ubiquitin ligase, programmed cell death-1 and the ratio of microtubule-associated protein light chain 3 II/I protein (P < 0.05 or P < 0.01) as well as reduce the expressions of anti-nucleoporin p62, caspase3 and cleaved-caspase3 (P < 0.05 or P < 0.01). Overall, ganoderma spores may activate the PTEN-induced kinase 1/E3 ubiquitin ligase pathway to enhance autophagy in testicular tissue and reduce apoptosis in tissue cells, so as to protect testicular tissue.

Key words: diabetes mellitus, testis, PTEN-induced kinase 1, E3 ubiquitin ligase, autophagy, ganoderma spore

中图分类号:

薛晶文, 王芳芳, 张欣, 逄瑞丰, 王肖烨, 马小茹. 灵芝孢子干预糖尿病大鼠睾丸组织线粒体自噬及细胞的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 562-568.

Xue Jingwen, Wang Fangfang, Zhang Xin, Pang Ruifeng, Wang Xiaoye, Ma Xiaoru. Effect of ganoderma spore on mitochondrial autophagy and apoptosis in testicular tissue of diabetic rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(4): 562-568.

图/表（结果） 10

2.1 实验动物数量分析实验选用40只雄性SD大鼠，每组大鼠10只。模型复制期间，糖尿病组有1只大鼠死亡，可能是由于腹腔注射时刺破其他器官造成死亡，最终39只大鼠进入结果分析。
2.2 各组大鼠血糖、体质量、睾丸质量及血清睾酮浓度检测结果如表1所示，正常组和高脂高糖组大鼠体质量随饲养周期延长而增加，两组血糖水平无明显差异(P > 0.05)；与正常组和高脂高糖组相比，糖尿病组大鼠血糖上升(P < 0.01)，体质量和睾丸质量减少(P < 0.01)，血清睾酮浓度下降(P < 0.01)；与糖尿病组相比，灵芝孢子干预组大鼠血糖明显降低(P < 0.05)，体质量和睾丸质量增加(P < 0.01)，血清睾酮浓度显著上升(P < 0.01)。

2.3 灵芝孢子对糖尿病大鼠精子的影响各组大鼠精子形态，见图1。与正常组和高脂高糖组相比，糖尿病组大鼠镜下游离精子数量显著减少，精子畸形率也显著增加；与糖尿病组相比，灵芝孢子干预组大鼠精子数量明显增加，精子畸形率显著降低，见表2，图2。

2.4 灵芝孢子降低糖尿病大鼠睾丸组织的氧化应激水平与正常组和高脂高糖组相比，糖尿病组大鼠睾丸组织内丙二醛含量显著上升(P < 0.01)，抗氧化体系中谷胱甘肽还氧化物酶和超氧化物歧化酶水平均显著下降(P < 0.01)；与糖尿病组相比，灵芝孢子干预组大鼠睾丸组织内丙二醛含量显著降低(P < 0.01)，谷胱甘肽还氧化物酶和超氧化物歧化酶水平显著增加(P < 0.01)，见表3，图3。

2.5 灵芝孢子对糖尿病大鼠睾丸形态的影响苏木精-伊红染色显示，正常组大鼠生精小管紧密相连，管内各级生精细胞有序排列，精子充盈；高脂高糖组睾丸生精小管具有明显的变化，其中管内精子相对减少，管腔中排列紊乱无规律的精原细胞增多；糖尿病组大鼠睾丸组织镜下曲精小管直径缩窄，出现较多底层初级精母细胞，腔内精子数减少，管间质充容物变少且连接消失；灵芝孢子干预组大鼠睾丸组织病变减轻，精原细胞数量有所增加且排列紧密规律，精子数量增多，见图4。

2.6 灵芝孢子对糖尿病大鼠睾丸组织自噬蛋白的影响免疫组化染色结果显示，与正常组和高脂高糖组对比，糖尿病组大鼠睾丸组织自噬蛋白PTEN诱导激酶1、E3泛素蛋白连接酶蛋白阳性表达减少，组织棕黄色覆盖率变低；抗核孔蛋白阳性表达增加，胞质中可见大量棕色物质堆积。与糖尿病组相比，灵芝孢子干预组大鼠睾丸组织PTEN诱导激酶1、E3泛素蛋白连接酶阳性表达有所增加，胞质内抗核孔蛋白棕黄色覆盖程度降低，见图5。

Western blotting检测结果显示，与正常组和高脂高糖组相比，糖尿病组大鼠睾丸组织内PTEN诱导激酶1、E3泛素蛋白连接酶、程序性死亡受体1蛋白表达显著下降(P < 0.05或P < 0.01)，抗核孔蛋白表达显著增加(P < 0.01)，微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值下调(P < 0.05)；与糖尿病组相比，灵芝孢子干预组大鼠睾丸组织自噬水平提高，PTEN诱导激酶 1、E3泛素蛋白连接酶、程序性死亡受体1自噬蛋白表达升高(P < 0.01)，抗核孔蛋白表达显著减少(P < 0.01)，微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值增加(P < 0.05)，见图6。

2.7 灵芝孢子对糖尿病大鼠睾丸组织凋亡蛋白的影响 Western blotting检测结果显示，与正常组和高脂高糖组相比，糖尿病组大鼠睾丸组织内凋亡蛋白caspase3和剪切caspase3的蛋白表达量均明显增高(P < 0.05或P < 0.01)；与糖尿病组相比，灵芝孢子干预组大鼠睾丸组织内caspase3和剪切caspase3的蛋白表达水平有所下降(P < 0.05或P < 0.01)，但未及正常水平，见图7。

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引言

糖尿病是一种以胰岛素水平缺乏或作用抵抗为诱因、以血糖升高为特点，并伴有多种长期并发症的慢性代谢性疾病[1]，其常见的并发症——男性生殖障碍已成为人们关注的热点。睾丸作为精子产生的场所，其结构和功能的异常必然引起生殖障碍[2]。线粒体氧化应激和线粒体结构功能改变是睾丸功能障碍的主要原因，在精子发生过程中，线粒体通过为细胞成熟和分化及精子运动、获能和受精能力提供能量而在生殖功能中发挥重要作用。线粒体功能障碍会导致氧化失衡并影响精子功能，甚至诱导精子凋亡[3-4]。
线粒体自噬是细胞特异性降解衰老及受损线粒体的一种自噬形式，维持线粒体稳态并应对细胞应激，主要由PTEN诱导激酶1/E3泛素蛋白连接酶途径介导。自噬已成为病理反应的关键介质，与细胞信号传导和损伤中的活性氧有关[5]。研究表明，PTEN诱导激酶1/3泛素蛋白连接酶介导的自噬途径可清除线粒体产生的过量活性氧、减少细胞的氧化应激，维持细胞及机体的动态平衡[6]。活性氧与线粒体功能障碍相关的自噬损伤在糖尿病并发症中均有报道，涉及糖尿病心肌损伤[7]、肾病及神经性疼痛等多种并发症[8-9]。在高糖条件下，大量功能失调的线粒体堆积于细胞内，线粒体自由基释放增加，生成过度的活性氧。此外，糖尿病会抑制自噬水平，使受损的线粒体无法被正常清除，导致细胞促凋亡蛋白的释放[8]。
灵芝孢子是灵芝子实体在成熟时期释放的生殖细胞，其药理活性相较于灵芝其他活性物质具有更高且多样化的作用，是当前医学研究的热点。已有研究证明，灵芝孢子具有抗炎、抗氧化、降脂降糖、免疫调节、改善肠道菌群的功
效[10-12]。近年来，灵芝孢子还被应用于癌症和衰老疾病的研究中，其主要通过调控细胞周期决定细胞进程 [7]。目前，尚未发现灵芝孢子药物有致畸作用。越来越多的研究证实，灵芝孢子对细胞自噬途径起调节作用，通过调控自噬的起始、自噬产物的降解、自噬通量影响疾病的发生发展[10，13]。另外，灵芝孢子对线粒体途径和死亡受体途径介导的细胞凋亡也有一定影响[14-15]。此次实验从线粒体自噬角度出发，探究灵芝孢子对糖尿病大鼠睾丸组织结构及细胞凋亡的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，组内两两比较用LSD和Tamhane法验证。
1.2 时间及地点实验于2021-06-19/2022-08-20在佳木斯大学生命科学实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物与分组雄性SD大鼠40只，六七周龄，SPF级，体质量175-210 g，购于哈尔滨医科大学动物中心，动物许可证号：SYXK(黑)2016-014。饲养环境：温度16-26 ℃，湿度35%-65%，夜昼分明交替饲养。采取随机数字表法将40只大鼠分为正常组、高脂高糖组、糖尿病组、灵芝孢子干预组，每组10只。实验方案获得佳木斯大学动物实验伦理委员会批准，批准号为JMSU-210。
1.3.2 主要试剂链脲佐菌素(Sigma生物公司)；灵芝孢子(佳木斯灵芝种植基地采集)；戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司)；β-肌动蛋白小鼠单克隆抗体(AA128)、PTEN 诱导激酶 1多克隆抗体(AF7755)、 E3泛素蛋白连接酶多克隆抗体(AF7680(中国碧云天生物公司)；程序性死亡受体1单克隆抗体(ab207612，英国Abcam公司)；抗核孔蛋白单克隆抗体(ab56416，英国Abcam公司)；微管相关蛋白轻链3多克隆抗体抗体(#83506，美国CST公司)；caspase3兔多克隆抗体(ab13847，英国Abcam公司)；剪切caspase3多克隆抗体(Asp175，美国CST公司)；超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶及丙二醛试剂盒(中国南京建成生物公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验造模与分组干预正常组给予正常饮食，高脂高糖组、糖尿病组、灵芝孢子干预组给予高脂高糖饮食(饲料配方：基础膳食60.6%，白砂糖15%，胆固醇4%，胆酸钠0.4%，猪油10%，蛋黄10%)，直至实验结束。

糖尿病造模：高脂高糖饮食1个月后，糖尿病组、灵芝孢子干预组单次腹腔注射链脲佐菌素(30 mg/kg)建立2型糖尿病模型。注射3，7 d后尾静脉采血检测空腹血糖，以2次空腹血糖≥16.7 mmol/L为造模成功标准。造模成功后，灵芝孢子组大鼠灌胃给予灵芝孢子300 mg/(kg·d)，其余3组大鼠灌胃给予等量生理盐水，持续药物输注12周。

1.4.2 各组大鼠生化功能指标测定实验结束后，腹腔注射3%戊巴比妥钠35 mg/kg麻醉大鼠，取静脉血，测定各组大鼠空腹血糖水平，称量睾丸湿质量。将静脉血于4 ℃下1 500×g离心15 min分离血清，将待测血清和标准液按说明书剂量加入反应板，室温避光孵育120 min，洗板3次，加显色液，封膜室温避光30 min，加终止液，测吸光度值，分析各组大鼠血清睾酮浓度。
剪碎附睾尾于5 mL 37 ℃生理盐水中使精子充分游出。取20 µL精子悬液于牛鲍计数板，镜下计数中央大方格中间加四角5个中方格内的精子数目，N=镜下精子数目/100×109 L-1，统计各组大鼠精子数量；另取一滴精子悬液于载玻片上，固定，干燥，伊红染色1 h，乙醇脱色，显微镜下观察精子异常形态并计数1 000个精子内异常精子的数量，计算畸形百分率，其中异常精子形态包括无头、无尾、断尾、颈部畸形等。
1.4.3 各组大鼠氧化功能指标测定取大鼠睾丸组织，加裂解液充分裂解，离心得蛋白上清，利用超氧化物歧化酶、丙二醛、谷胱甘肽还氧化物酶试剂盒相应操作步骤进行含量测定，记录各组大鼠相应吸光度值。
1.4.4 各组大鼠睾丸组织苏木精-伊红染色取浸泡于多聚甲醛的睾丸组织，采用梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋组织；切取组织薄片4.0-5.0 μm，用二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液透明15 min为宜，再从高浓度至低浓度的乙醇洗涤脱水处理，用苏木精-伊红洗染，脱水、透明、封固，显微镜下观察其形态结构。
1.4.5 各组大鼠睾丸组织免疫组化染色 ①石蜡切片脱蜡至水；②枸橼酸钠缓冲液微波热修复抗原；③5%BSA，37 ℃30 min，封闭抗原表位；④抗体PTEN诱导激酶1(1∶200)、E3泛素蛋白连接酶(1∶200)、抗核孔蛋白(1∶500)覆盖组织切片低温过夜；⑤次日冲洗一抗，PBS洗(5 min×3)；⑥滴加抗兔抗鼠IgG，37 ℃温育30 min，PBS洗(5 min×3)；⑦滴加SABC，37 ℃温育30 min，PBS洗(5 min×3)；⑧镜下DBA显色，自来水清洗。⑨苏木精轻度染胞核，梯度乙醇脱水，树胶封固，显微镜采图。
1.4.6 Western blotting检测取超低温冻存的睾丸组织，0.5 g组织中加入5 mL裂解液，剪碎组织、研磨、超声破碎细胞，4 ℃下15 000 r/min离心15 min获取蛋白原液；利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳梯度分离蛋白，湿转于PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，37 ℃1 h，分别孵育PTEN诱导激酶1(1∶1 000)、E3泛素蛋白连接酶(1∶1 000)、抗核孔蛋白(1∶1 000)、程序性死亡受体1(1∶1 000)、微管相关蛋白轻链3(1∶1 000)、caspase3(1∶1 000)、剪切caspase3(1∶1 000)，4 ℃低温过夜，TBST洗膜(6 min×5)、孵育辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔鼠二抗(1∶10 000)，37 ℃温育1 h，TBST洗膜(6 min×5)，滴加曝光液，显影上述蛋白条带，观察蛋白表达情况。
1.5 主要观察指标各组大鼠精子数量和形态、睾丸组织形态结构、血清睾酮和睾丸组织氧化应激水平，睾丸组织中PTEN诱导激酶1、E3泛素蛋白连接酶、抗核孔蛋白、程序性死亡受体1、微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ、caspase3、剪切caspase3的蛋白表达。
1.6 统计学分析所有实验数据以x±s表示，采用SPSS 22.0数据分析和GraphPad Prism 8.0作图，单因素方差分析(ANOVA)、LSD和Tamhane进行组间两两对比；以P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经佳木斯大学生物统计学专家审核。

讨论

近年来，全球育龄期的不孕不育率持续上升，糖尿病诱发的男性生殖功能异常是人类关注的焦点。目前，糖尿病引发的男性不育治疗尚未达到理想效果。灵芝孢子是灵芝成熟释放的生殖细胞，灵芝分布广泛且具有众多药理功能如降糖降脂、抗炎抗氧化等。有研究证明，灵芝孢子在治疗糖尿病[16]、癌症等疾病中都发挥着极其重要的作用[17]。此次实验使用灵芝孢子药物干预糖尿病大鼠，发现该药物不仅可以降低大鼠血糖和氧化应激指标水平，还可以改善睾丸组织病变程度，促进睾丸生精细胞的成熟和分化，增强睾丸自噬功能，减少生精细胞的凋亡。
氧化应激是糖尿病生殖障碍发生发展的关键影响因素。精子因自身缺乏清除活性氧的酶，又高度依赖于男性生殖系统的抗氧化保护，故在男性生殖系统功能异常时精子极易受到氧化损伤[18]。长期高血糖会增加糖尿病患者睾丸组织中活性氧的产生，进而阻断生精细胞分化，影响精子获能及顶体反应[4]。机体重要的抗氧化物超氧化物歧化酶和谷胱甘肽还氧化物酶维持着氧化和抗氧化之间的动态平衡，保护细胞膜的结构及功能状态不被过氧化物所干扰及损害[19]。此次实验中，脂质代谢物丙二醛过量生成，损伤生精细胞线粒体，影响能量代谢平衡也破坏精子的成熟和运输，从而导致男性不育率上升；灵芝孢子干预后，大鼠睾丸组织内氧化物丙二醛水平显著下降，抗氧化物超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还氧化物酶水平上调，抗氧化水平上升，减缓了高糖高脂对睾丸的伤害。
氧化应激和自噬相互关联。自噬是一把双面剑，适度自噬会促进睾丸生精细胞的生长成熟以及分化，然而自噬不足或过度自噬均会引发细胞凋亡[20]。生理情况下，自噬作为一种抗氧化防御机制减轻活性氧对细胞的损害，并通过吞噬氧化物质来维持细胞稳态[21]。由于线粒体是细胞内活性氧的主要来源，因此线粒体自噬对于抑制氧化应激至关重要[22]。在糖尿病条件下，线粒体功能的丧失会导致活性氧的产生，而高糖抑制自噬，无法及时清除氧化因子，两者加剧线粒体受损情况，加重疾病进程[23]。
研究发现，线粒体自噬是在损伤或应激后通过自噬选择性降解有缺陷的线粒体，在维持线粒体健康方面起着重要作用。PTEN诱导激酶1/E3泛素蛋白连接酶依赖性线粒体自噬是线粒体质量控制的最佳途径，参与糖尿病并发症的病理学[24-25]。棕榈酸酯诱导的β细胞功能障碍会抑制PTEN诱导激酶1的转录，从而阻止了自噬体对受损线粒体的识别[26]。在高糖处理的足细胞和链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠肾脏中，均看到PTEN诱导激酶1蛋白表达减少和线粒体自噬抑制[27]。PTEN诱导激酶1蛋白负责识别线粒体异常信号，方便迅速积聚于受损线粒体外膜；积累的PTEN诱导激酶1通过磷酸化E3泛素蛋白连接酶的Ser-65残基和磷酸化泛素来激活E3泛素蛋白连接酶。另外，活化的E3泛素蛋白连接酶募集自噬蛋白程序性死亡受体1和受体抗核孔蛋白/SQSTM1，与微管相关蛋白轻链3B自噬细胞连接形成自噬体，诱导自噬的发生，以启动清除受损/功能失调的线粒体的过程[28-31]。研究表明，高糖使线粒体质量控制受损，线粒体碎裂增加，线粒体自噬减少[32]。在疾病情况下，线粒体自噬会被抑制，阻断PTEN诱导激酶1积累和E3泛素蛋白连接酶蛋白活化，导致无法清除受损/功能失调的线粒体。微管相关蛋白轻链3是自噬的标志，微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ比值减低预示自噬通量降低，自噬受抑。作为自噬降解产物代表的抗核孔蛋白，该蛋白表达增加表明大量异物堆积细胞内，将诱导生精细胞的凋亡。此次实验结果表明，糖尿病大鼠睾丸组织线粒体自噬程度明显受抑，灵芝孢子的干预可改善自噬程度。
细胞凋亡也是影响和调控糖尿病疾病发生发展的重要机制。正常的细胞凋亡有助于组织的更新和炎性细胞的清除[33]。线粒体的结构完整性与细胞存活密切相关[34]，线粒体自身破裂会加速细胞凋亡的进程，促使细胞过早进入死亡阶段。caspase家族蛋白是介导凋亡途径的重要蛋白，caspase3亚型是凋亡过程的最终实施因子，通过自剪切转化成活性形式——剪切caspase3。caspase3和剪切caspase3的蛋白表达量更能真实地反映机体的凋亡水平[35]。此次实验对caspase3、剪切caspase3表达的检测结果证明，糖尿病大鼠睾丸的凋亡水平较正常组显著提高，灵芝孢子可部分纠正这种异常凋亡。
线粒体是细胞自噬和凋亡的调节者。自噬和凋亡均是细胞死亡调节的重要病理生理机制，适度的自噬会清除体内受损的细胞和细胞器。研究发现，阻断睾丸间质细胞的内质网和线粒体功能，不仅会抑制细胞清除异物的能力，还会加速生精细胞的凋亡[36]。正常的线粒体自噬会降低生精细胞凋亡，与清除体内多余受损的线粒体、阻断凋亡途径的起始密切相关。
糖尿病大鼠精子数量减少、畸形率增加，睾丸组织氧化水平上升、抗氧化水平下降，同时线粒体自噬功能降低，组织内凋亡增加。由此猜测，血糖过高破坏线粒体的基本结构和功能，加速生精细胞凋亡，最终导致男性生殖功能障碍甚至男性不育。灵芝孢子的摄入不仅可以降低血糖，还可以提高机体抗氧化能力、降低氧化因子的释放，其可能通过激活PTEN诱导激酶1/E3泛素蛋白连接酶通路来提高机体清除异物的能力、增强自噬、减少细胞凋亡，起到保护睾丸的作用。综上所述，灵芝孢子可有效改善糖尿病大鼠生殖障碍，具有很大的利用价值和临床应用前景。
实验存在一定的局限性：灵芝孢子药物的干预的确会影响糖尿病睾丸组织线粒体自噬及细胞凋亡的变化，但线粒体自噬对细胞凋亡具体的作用机制尚未完全阐明，后续将进行体外加激动剂(抑制剂)及体内实验加激动剂(抑制剂)进一步论证高糖对睾丸生精细胞的影响及线粒体自噬和凋亡的关系。
结论：实验结果显示，灵芝孢子可以降低糖尿病大鼠血糖和氧化应激水平，明显改善睾丸组织的病理结构，提高精子生成量，减低畸形率，对睾丸组织起到保护作用，这可能与激活PTEN诱导激酶1/E3泛素蛋白连接酶自噬通路减少细胞凋亡有关。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

灵芝孢子干预糖尿病大鼠睾丸组织线粒体自噬及细胞的凋亡

Effect of ganoderma spore on mitochondrial autophagy and apoptosis in testicular tissue of diabetic rats

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