急性期神经根型颈椎病患者的血清差异蛋白组学分析

doi:10.12307/2023.844

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (4): 535-541.doi: 10.12307/2023.844

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急性期神经根型颈椎病患者的血清差异蛋白组学分析

卜献忠1，2，卜保献2，许伟3，张驰1，张翼升1，钟远鸣3，李智斐3，唐福波3，麦威1，周劲衍1

1广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530001；2河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)，河南省洛阳市 471002；3广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023

收稿日期:2022-09-19 接受日期:2022-11-18 出版日期:2024-02-08 发布日期:2023-07-13
通讯作者: 钟远鸣，硕士，主任医师，教授，博士生导师，广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023
作者简介:卜献忠，男，1989年生，河南省开封市人，汉族，广西中医药大学在读博士，主治医师，主要从事脊柱脊髓损伤、脊柱相关疾病的基础与临床研究。卜保献，男，1970年生，河南省开封市人，汉族，郑州大学毕业，博士，主任医师，教授，硕士生导师，主要从事脊柱脊髓疾病的诊治研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目 (81760874，82260942)，项目负责人：钟远鸣；广西重点研发计划项目 ( 桂科 AB20159018)，项目负责人：钟远鸣；广西中医药重点学科建设项目(GZXK-Z-20-21)，项目负责人：钟远鸣；河南省中医药科学研究专项课题(20-21ZY2083)，项目负责人：卜保献；广西壮族自治区中医药管理局计划课题项目(GXZYA20220025)，项目负责人：唐福波；广西研究生教育创新计划资助项目 (YCBXJ2021009)，项目负责人：卜献忠；洛阳市2022-2024年度中医重点学科-中西医结合医学(脊柱外科)，项目负责人：卜保献

Analysis of serum differential proteomics in patients with acute cervical spondylotic radiculopathy

Bu Xianzhong1, 2, Bu Baoxian2, Xu Wei3, Zhang Chi1, Zhang Yisheng1, Zhong Yuanming3, Li Zhifei3, Tang Fubo3, Mai Wei1, Zhou Jinyan1

1Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Luoyang Zhenggu Hospital of Henan Province/Orthopedic Hospital of Henan Province, Luoyang 471002, Henan Province, China; 3First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2022-09-19 Accepted:2022-11-18 Online:2024-02-08 Published:2023-07-13
Contact: Zhong Yuanming, Master, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Bu Xianzhong, MD candidate, Attending physician, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Luoyang Zhenggu Hospital of Henan Province/Orthopedic Hospital of Henan Province, Luoyang 471002, Henan Province, China Bu Baoxian, MD, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Luoyang Zhenggu Hospital of Henan Province/Orthopedic Hospital of Henan Province, Luoyang 471002, Henan Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, Nos. 81760874 and 82260942 (both to ZYM); Guangxi Key Research and Development Plan Project, No. AB20159018 (to ZYM); Guangxi Key Discipline Construction Project of Traditional Chinese Medicine, No. GZXK-Z-20-21 (to ZYM); Special Project for Scientific Research of Traditional Chinese Medicine in Henan Province, No. 20-21ZY2083 (to BBX); Planned Project of Guangxi Zhuang Autonomous Region Administration of Traditional Chinese Medicine, No. GXZYA20220025 (to TFB); Guangxi Graduate Education Innovation Program Funding Project, No. YCBXJ2021009 (to BXZ); Luoyang 2022-2024 Key Discipline of Traditional Chinese Medicine/Integrated Traditional and Western Medicine (Spinal Surgery) (to BBX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

TMT蛋白质组学技术：由Thermo Scientific公司推出的一种同量异序化学标签，是通过串联质谱实现对多种不同样品中的蛋白质行同步鉴定和定量的技术。该技术因拥有高通量、高灵敏度、良好的重复性、低系统偏差和低噪声信号水平等特点，是当今定量蛋白质组学常用的高通量筛选工具。
神经根型颈椎病：是由于颈椎关节骨质增生、颈椎间盘组织退行性变最终导致颈神经受压迫诱发的一系列生理与病理变化，以神经根性疼痛为主要表现，急性期时颈肩部疼痛剧烈，颈椎活动受限更为典型症状，给人们身心健康带来了巨大的负担。

背景：正常健康人向急性期神经根型颈椎病转化的具体分子机制尚未完全明确，需进一步深入研究。

目的：探讨正常健康人群与急性期神经根型颈椎病患者的血清蛋白组学差异表达，并寻找及鉴定两者之间的潜在特异性血清标志物。
方法：收集急性期神经根型颈椎病患者、正常健康人群血清各8例，应用绝对定量技术联合液相色谱-串联质谱技术进行蛋白组学筛选与分析，以期探寻与鉴定急性期神经根型颈椎病患者差异表达的血清蛋白质。

结果与结论：①绝对定量技术筛查出有意义差异蛋白183种，鉴定出11种显著性差异蛋白质(P < 0.05)，其中与正常健康人组相比，急性期神经根型颈椎病组中人类白细胞抗原A、分泌珠蛋白家族1a成员1、蛋白4-羟基苯丙酮酸双加氧酶等3种差异蛋白显著上调，免疫球蛋白IgG3恒定区、皮肤因子、肌球蛋白轻链3等7种差异蛋白显著下调；②基因本体富集分析结果表明，这些差异蛋白参与了抗原结合、免疫球蛋白受体结合等分子功能；③蛋白相互作用网络分析表明，正常健康人群与急性期神经根型颈椎病之间的共同差异蛋白中HLA-A、HPD、PSMA3、DMKN、SCGB1A1、MYL3等6种位于功能网络节点，且与机体免疫、细胞炎症反应、能量代谢、机械压力等系统关系密切；④采用免疫印迹实验对显著性差异蛋白HLA-A、HPD、MYL3进行验证，其验证结果与蛋白组学结果相一致；⑤提示通过绝对定量技术联合液相色谱-串联质谱技术发现正常健康人群与急性期神经根型颈椎病患者之间的血清差异表达蛋白质，并初步认为 HLA-A、HPD、MYL3可能是急性期神经根型颈椎病的特异性血清标志物，为进一步研究其发病机制提供了新方向。

https://orcid.org/0000-0002-2559-6766(卜献忠)；https://orcid.org/0000-0002-4045-7561(卜保献)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 急性期神经根型颈椎病, 绝对定量技术, 血清蛋白质, 生物标记物, 生物信息学

Abstract: BACKGROUND: The specific molecular mechanism of the transformation from normal healthy people to acute cervical spondylotic radiculopathy has not been clear, which needs to be further studied.
OBJECTIVE: To investigate the differential expression of serum proteomics between normal healthy people and patients with acute cervical spondylotic radiculopathy, and to find and identify potential specific serum markers between them.
METHODS: The serum samples of eight patients with acute cervical spondylotic radiculopathy and eight normal healthy people were collected, and the proteomic screening and analysis were performed by tandem mass tag combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry technology, in order to explore and identify serum proteins differentially expressed in patients with acute cervical spondylotic radiculopathy.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 183 significantly differential proteins were screened by tandem mass tag technology, and 11 significantly differential proteins were identified (P < 0.05). Compared with normal healthy people, three differential proteins were significantly up-regulated, including human leukocyte antigen-A, secretoglobin family 1a member 1, and protein 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, and seven differential proteins were significantly down-regulated, such as immunoglobulin heavy constant gamma 3, skin factor, and myosin light chain 3, in patients with acute cervical spondylotic radiculopathy. Gene ontology enrichment analysis showed that these differential proteins participated in antigen binding, immunoglobulin receptor binding and other molecular functions. Protein-protein interaction analysis showed that among the common differential proteins between normal healthy people and patients with acute cervical spondylotic radiculopathy, HLA-A, HPD, PSMA3, DMKN, SCGB1A1, and MYL3 were located at the nodes of the functional network, and were closely related to the systems of body immunity, cellular inflammatory response, energy metabolism, and mechanical pressure. The significantly differential proteins HLA-A, HPD and MYL3 were verified by western blot, and the results were consistent with those of proteomics. To conclude, tandem mass tag combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry technology can be used to find the differentially expressed proteins in serum between normal healthy people and patients with acute cervical spondylotic radiculopathy. It is preliminarily believed that HLA-A, HPD and MYL3 may be specific serum markers of acute cervical spondylotic radiculopathy, providing a new direction for further research on its pathogenesis.

Key words: acute cervical spondylotic radiculopathy, tandem mass tag technology, serum protein, serum biomarker, bioinformatics

中图分类号:

卜献忠, 卜保献, 许伟, 张驰, 张翼升, 钟远鸣, 李智斐, 唐福波, 麦威, 周劲衍. 急性期神经根型颈椎病患者的血清差异蛋白组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 535-541.

Bu Xianzhong, Bu Baoxian, Xu Wei, Zhang Chi, Zhang Yisheng, Zhong Yuanming, Li Zhifei, Tang Fubo, Mai Wei, Zhou Jinyan. Analysis of serum differential proteomics in patients with acute cervical spondylotic radiculopathy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(4): 535-541.

图/表（结果） 5

2.1 差异表达蛋白质统计从ACSR组血清中鉴定出183种差异蛋白质，与正常健康人组相比，研究组血清中有10种差异蛋白质，其中显著性上调蛋白质有3种，显著性下调蛋白质有7种，见图2。根据 Ratio比值大小得到的上、下调前 10位的差异蛋白，见表1。

2.2 差异蛋白质的基因本体及KEGG功能富集分析正常健康人组与ACSR组之间的共同差异蛋白质基因本体功能注释包含细胞组分、分子功能、生物过程3个部分。根据基因本体蛋白数量富集分析发现，在对细胞组分的蛋白质分析中，这些差异蛋白主要富集于高尔基膜、内质网膜、内质网小室等细胞成分中；在对分子功能的蛋白分析中，这些差异蛋白主要富集于抗原结合、免疫球蛋白受体结合等分子功能；在对参与生物过程的蛋白质分析中，这些差异蛋白主要富集于对细菌的反应、细胞活化的正调控、对细菌的防御反应、白细胞活化的正调控、白细胞活化的调节、白细胞的调节?细胞黏附、淋巴细胞活化的调节、白细胞增殖的调节、单核细胞增殖的调控等生物过程，见图3。两组之间的共同差异蛋白质KEGG富集分析未涉及到目前已知的相关信号通路，有待进一步深入研究。

2.3 差异蛋白质蛋白相互作用网络分析通过蛋白相互作用网络可探寻正常健康人组与ACSR组差异蛋白之间的相互关系，蛋白互作网络分析发现共同差异蛋白中HLA-A、HPD、PSMA3、DMKN、SCGB1A1、MYL3等6种位于功能网络节点，这些共同差异蛋白互作网络涉及到对细菌的反应、细胞活化的正调控、白细胞活化的调节、淋巴细胞活化的调节、单核细胞增殖的调控等生物过程，见图4。

2.4 Western Blotting验证结果与正常健康人组相比，ACSR组血清中HLA-A、HPD蛋白表达量显著上调(P < 0.05)，但MYL3蛋白量表达显著下调(P < 0.05)，见图5。

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引言

神经根型颈椎病是由颈椎间盘及其附着骨或软组织退行性改变，从而刺激或压迫颈神经根所引起的一系列病理变化，主要临床症状为颈部的神经性疼痛，并伴随相关的炎性反应，其急性期时颈肩部疼痛剧烈、活动受限[1]。急性期神经根型颈椎病(acute cervical spondylotic radiculopathy，ACSR)病理机制是由颈椎间盘退行性改变引起的一系列分子生物学反应，并以炎症反应为主[2]。研究表明，神经根型颈椎病约占颈椎病总发病率的60%以上[3]，在人群中至少有40%的人罹患过该病 [4]。随着生活智能化的快速发展，神经根型颈椎病的患病率逐年上升并呈现低龄化趋势，严重影响了患者身心健康和生活质量[5]。因此，通过早期预防正常健康人群向ACSR转化，对实现ACSR的早期筛查及诊断具有重要意义。蛋白质是执行机体生物功能的基本单位，也是研究机体病理变化的重要对象。蛋白质组学研究可以发现疾病发生与发展及治疗过程中生物标志物的整体性变化，已成为医学研究的新方法 [6-7]。同位素相对标记与绝对定量技术(tandem mass tag，TMT)是一种基于体外等重同位素标记的相对和绝对定量技术，也是一种用于蛋白质和代谢物定量的高通量筛选技术[8]。然而，目前运用蛋白质组学技术筛查ACSR生物标志物的研究尚未见报道。因而，此次研究拟从蛋白质组学角度，采用TMT联合液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技术，以ACSR患者为研究对象，探索正常健康人向ACSR转化的血清特异性生物标志物，为进一步探讨其发病机制提供了新思路与理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计回顾性病例分析，应用TMT联合LC-MS/MS技术进行蛋白组学筛选与分析，探寻与鉴定ACSR患者差异表达的血清蛋白质。
1.2 时间及地点实验于2019年2月至2021年9月在广西中医药大学第一附属医院完成。
1.3 对象收集2019年2月至2021年9月广西中医药大学第一附属医院脊柱骨伤科门诊或住院病房确诊为ACSR患者，同时在健康体检中心收集正常健康人群。
根据诊断标准收集ACSR患者8例[9]，其中男4例，女4例，平均年龄(40.00±3.98)岁；8例ACSR患者的平均急性病程、颈椎功能障碍指数评分、目测类比评分量表评分、现有疼痛强度评分分别为(2.01±0.44) d、(47.91±5.07)分、(6.92±1.25)分、(3.61±1.02)分。同时在健康体检中心及“治未病”中心选取正常健康人群8例，其中男4例，女4例，平均年龄(40.63±4.00)岁。两组在性别与年龄方面均具可比性(P > 0.05)。该临床研究的实施符合《赫尔辛基宣言》和广西中医药大学第一附属医院对研究的相关伦理要求(审批时间：2018-01-04)。参与试验的患病个体及其家属为自愿参加，均对试验过程完全知情同意，在充分了解试验方案的前提下签署了“知情同意书”。
纳入标准：①年龄35-45岁；②ACSR的诊断严格参照《神经根型颈椎病诊疗规范化专家共识 ( 2015 年版)》标准[9]：典型的根性压迫症状、X射线片或CT检查显示符合神经根型颈椎病的变化，如颈椎关节增生、椎间隙狭窄等，MRI 显示神经根受压、臂丛牵拉试验或椎间孔挤压试验阳性；③急性病程≤3 d；④近期无炎症感染以及无各类型关节炎发作；⑤愿意参与此项研究。
排除标准：①伴有脊髓病变、合并肝肾疾病、心脑血管、呼吸系统疾病患者；②伴有血液病、糖尿病、自身免疫性疾病、肿瘤疾病患者；③合并其他类型颈椎病者；④伴精神疾病或认知障碍；⑤合并颈椎椎管狭窄；⑥排除以上肢疼痛为表现的其他类型疾病。
1.4 材料
1.4.1 试剂 TMT 标记试剂盒(ThermoFisher Scientific公司，批号：A44520)、BCA试剂盒(碧云天，批号：P6651)、二硫苏糖醇(Sigma-Aldrich公司，批号：D0632)、三氯乙酸(Sigma-
Aldrich公司，批号：T6399)、乙晴(ThermoFisher Scientific公司，批号：400060)、碘乙酰胺(Sigma-Aldrich公司，批号：I1149)、蛋白酶抑制剂Ⅲ (Merck Millipore公司，批号：219427)、胰蛋白酶(Trypsin公司，批号：AD20357)、甲酸(Sigma-Aldrich公司，批号：F0507)、Albumin bovina 血清白蛋白(Solarbio公司，批号：A8020-500)、MYL3(Affinity公司，批号：DF4717)、HLA-A(Affinity公司，批号：DF6890)、HPD(Affinity公司，批号：AF8609)、化学发光 HRP 底物(Millipore公司，批号：WBKLS0500)。
1.4.2 仪器高速台式离心机(安亭公司，型号：TGL-16B)、全波长酶标仪(BIOTEX公司，型号：EPOCH)、自动化固相萃取仪(北京谷美特公司，ASPEC XL)、液相色普仪(北京普源精电公司，L-3000)、多功能全自动部份收集器(上海沪西分析仪器公司，型号：CBS-B)、超高效液相色谱仪(Thermo公司，型号NanoLC 1000)、垂直电泳槽(美国伯乐公司，Mnin-Protean Tetra Cell)、通用电泳仪(美国伯乐公司，型号：PowerPac Universal)、凝胶成像系统(美国伯乐公司，型号：GelDoc XR+)。
1.5 方法
1.5.1 样品的采集与保存在早晨医院采血室内(8：00-10：00)采集研究对象空腹(至少12 h)静脉血3-5 mL，4 ℃放置1-1.5 h，3 000×g，离心15 min，吸出上清液，分装后放于-80 ℃冰箱，冻存备用。

1.5.2 样本的蛋白提取血清样品从-80 ℃冰箱中拿出，4 ℃，18 000×g，10 min离心，清除细胞碎片，转移上清液。取上清液10 µL，稀释10倍，再从中取5 µL稀释液，参照BCA 试剂盒说明书要求完成血清蛋白浓度测定。取600 µL蛋白原液分2次注入高丰度柱内，混匀。根据高丰度蛋白去除试剂盒Pierce™ Top 14(Thermo Scientific)操作要求去除高丰度蛋白，见图1。

1.5.3 胰酶酶解各样品均取600 μL蛋白上清液进行酶解，先加入适量标准蛋白，然后加入适量裂解液将溶液调整为等体积，再加入3 μL 1 mol/L DTT将终浓度调整为5 mmol/L，通过56 ℃还原反应30 min。600 μL样品蛋白中加入12 μL 11 mol/L IAM，室温避光孵育15 min。烷基化后，各样本转移至不同的超滤管中，室温12 000×g，离心20 min；先运用8 mol/L 尿素置换3次，然后使用buffer置换尿素3次，最后加入胰蛋白酶(蛋白酶∶蛋白=1∶50)，酶解过夜。室温
12 000×g，离心10 min，第一次回收肽段，然后用蒸馏水第二次回收肽段，最终合并两次肽段溶液。
1.5.4 TMT标记采用Strata X C18(Phenomenex将)已胰酶酶解的肽段进行除盐，真空冷冻抽干。以0.5 mmol/L buffer溶解肽段，根据TMT试剂盒说明书标记肽段。操作如下：根据300 μg肽段加入10 μL ACN的比例，制备TMTpro-12标记溶液。取10 μL TMTpro-12标记溶液加入25 μg肽段溶液中，制成0.7 g/L肽段溶液，混匀，室温孵育2 h；将已标记的肽段混合、除盐、真空冷冻抽干。
1.5.5 高效液相色谱法分级肽段采用高pH反相高效液相色谱法分级，并运用Agilent 300Extend C18色谱柱(5 μm粒径，4.6 mm 内径，250 mm长)。操作如下：250 μg肽段(约666 μL)加入330 μL buffer A溶液(98%纯水+2%ACN)，最终补足1 mL。振荡仪混匀，室温离心，18 000×g，5 min；将1 mL肽段溶液注入高效液相色谱仪，关闭入口环。肽段分级梯度为8%-32% ACN pH 9，先60 min时间内先后分离出60个组，最后将肽段合并为9个组，然后真空冷冻干燥。
1.5.6 液相色谱-质谱联用分析肽段经过液相色谱流动相A相溶解后，再运用EASY-nLC 1200超高效液相系统完成分离。流动相A水溶液(0.1 % FA和2% ACN)，流动相B水溶液(0.1% FA和90% ACN)。液相梯度设置：0-36 min，7%-23% B；36-52 min，23%-32% B；52-56 min，32%-80% B；56-60 min，80% B，流速设置为500 nL/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进Q Exactive™ HF-X质谱进行分析。
1.5.7 质谱数据搜库运用MaxQuant分析MS/MS 数据以及对SwissProt人类数据库和反向诱饵数据库进行搜索。根据伪发现率(FDR) < 0.01 的标准进行筛选数据，以保证获得高度可信的定性结果。
1.5.8 免疫印迹实验验证(Western Blotting) 8个样本中随机抽取4个进行验证。取适量样品加入4×Sample buffer，加入蛋白裂解缓冲液，样品浓度控制2 mg/mL，90 ℃ 10 min 蛋白变性。依次上样10 μL等浓度不同蛋白样品，先80 V恒压30 min，再120 V恒压电泳至溴酚蓝。在电转槽4 ℃ 200 mA恒流电转1 h。5%脱脂牛奶封闭2 h。加入一抗体4 ℃ 冰箱中孵育过夜(Anti-MYL3 Rabbit mAb，Anti-Phospho-HPD Rabbit，Anti-HLA-A Rabbit 均为1∶500，Anti-Albumin Mouse mAb 1∶2 000)。TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗室温孵育1 h[Goat anti-Mouse IgG，(H+L)或Goat anti-Rat IgG，(H+L) 1∶10 000]。
TBST洗膜3次，每次10 min。加入 HRP底物孵育2 min(化学发光 HRP 底物1∶5 000)，调整曝光时间捕获信号，采用Image-pro-plus计算灰度值。
1.6 生物信息学分析和统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料比较使用χ2检验；P < 0.05则差异有显著性意义。运用1.3倍变化或0.83倍以及 Wilcoxon 检验(P < 0.05) 阈值确定差异表达蛋白；采用 UniProt GOA 生成基因本体注释以及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG)数据库进行富集途径分析；在STRING数据库(v.10.5)中构建蛋白质-蛋白质相互作用网络(置信分数> 0.7)。文章统计学方法已经广西中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

3.1 研究意义此次研究首次分析了ACSR患者与正常健康人群的血清蛋白质差异，探索与ACSR发病有关的特异性差异蛋白，这些潜在的蛋白质学标志物未来有可能应用于神经根型颈椎病的早期精准诊断，也可能为中医药精准防治神经根型颈椎病提供参考依据，进而提高神经根型颈椎病的临床防治疗效。此次研究采用TMT联合LC-MS/MS检测技术筛选出了11种与ACSR发病机制密切相关的差异蛋白，这些差异蛋白有可能是ACSR患者的特异性血清生物标志物。此次研究通过基因本体分析发现显著性差异蛋白主要集中在白细胞活化的调节、淋巴细胞活化的调节、白细胞增殖的调节、单核细胞增殖的调控等生物过程以及抗原结合、免疫球蛋白受体结合等分子功能方面。说明上述生物过程与分子功能可能通过有效调控机体免疫、细胞炎症反应、能量代谢等系统，进而参与了ACSR发病发生与发展的病理过程。
炎症反应是导致ACSR神经根性疼痛的关键性诱发因素[10]。
HLA在调控机体特异性免疫应答方面发挥着重要作用。研究表明，HLA-Ⅰ类基因是机体组织、细胞共有的抗原系统，存在于白细胞中，主要包括HLA-A，是CD8+ T淋巴细胞识别标志之一。HLA-Ⅰ类基因在细胞抗原识别过程中必须同时识别抗原肽以及HLA基因，才能够产生激活T细胞的信号[11]，在神经系统中激活的T细胞可产生和释放大量的促炎症因子[12]。郑仕杰等[13]通过降低HLA-A2在骨髓间充质干细胞中的表达，抑制T淋巴细胞分泌炎症因子的水平。上述研究表明HLA-A可诱导炎症反应，且在骨髓间充质干细胞分化、神经性炎症损伤中发挥了重要的作用。IGHG3通过与中性粒细胞以及巨噬细胞上的IgGFc受体(FcγR)结合，能够促进巨噬细胞的吞噬功能，还可通过与树突细胞表面表达的FcγRI结合[14]，促使树突细胞将抗原提呈给T淋巴细胞[15]，进而参与了急性炎症反应的病理改变过程。在外周循环中免疫抑制细胞过量或效应T细胞不足可加剧神经炎症反应[16]。SCGB1A1具有抗炎、抗纤维化的作用，在缺乏SCGB1A1的肺部病毒和细菌感染会引起更大的炎症反应[17]。小胶质细胞激活是神经炎症的重要病理性特点，当小胶质细胞活化被抑制可持续性阻断炎症反应，阻止炎症反应是治疗ACSR的关键[10，18-19]。KINFETM等[20]在选择性L4背根神经节刺激后采用转录组学检测到SCGB1A1、白细胞介素18、白细胞介素17F等21个基因被上调，并推测上述因子异常表达最终导致了中枢神经系统中的小胶质细胞活化，促进神经根炎症反应。此次研究Western Blotting结果显示HLA-A表达显著性上调，同时发现IGHG3、SCGB1A1显著性下调。提示HLA-A、IGHG3、SCGB1A1在ACSR疾病发生与发展中异常表达，这可能是与上述因子促进了小胶质细胞活化、激活T细胞，最终促进了神经炎递质对神经根的侵袭、抑制了神经元细胞存活的作用有关。HPD蛋白是一种分泌型蛋白，也是酪氨酸分解代谢过程中发挥作用的关键酶。HPD能够调控腺苷酸活化蛋白激酶活性，在HPD敲低H1299细胞内腺苷酸活化蛋白激酶活性受到抑制[21]，当腺苷酸活化蛋白激酶活性被抑制后可促进细胞内促炎递质的表达[22]。研究表明，HPD mRNA和蛋白在皮质神经元、小脑和海马均有表达[23]，同时发现在脊髓损伤大鼠模型中DNA微阵列检测到HPD是下调最多的基因，HPD可能通过调节酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸等代谢，减少氧化应激和炎症反应，减轻脊髓损伤[24]。此次研究Western Blotting验证了HPD表达显著性上调，说明HPD在ACSR发病过程中可能发挥着影响某些氨基酸分解代谢过程以及调控神经炎症反应的作用。因此，作者推测IGHG3、SCGB1A1可能是该病的特异性蛋白标志物，同时HPD、HLA-A可能是ACSR的血清诊断性标志物，但其临床诊断效能有待进一步验证。
目前，MYL3被认为是骨骼肌中重要的结构蛋白和收缩蛋白。ZHANG等[25]研究发现MYL3参与了肌肉力量发育和神经调节肌肉收缩的生理过程。在慢性脊髓损伤肌肉中调节氧化和慢速肌肉特性的相关基因表达减少，如MYL3 [26]；同时脊髓损伤后长期电刺激比目鱼肌可增加氧化肌纤维基因的表达，如MYL3，抑制糖酵解肌基因的上调，说明有效调控肌肉中MYL3的表达能够改善肌肉力量[27]。上述研究提示MYL3异常表达可能参与了因肌肉收缩所引起的代谢和机械压力反应。此次研究的Western Blotting结果显示，与正常健康人组相比，ACSR组中MYL3中蛋白表达明显下调，提示MYL3可能减弱ACSR患者颈部肌肉的肌力，影响颈椎椎体的稳定性，从而诱发机械压迫刺激颈神经根，产生疼痛反应。因此，作者初步认为MYL3可能是ACSR的诊断标志物，这可能与MYL3减弱氧化肌纤维能力、加速ACSR的病情恶化有关，但详细的作用机制尚需进一步研究。
PSMA3是蛋白酶体的重要组成成分之一。张遥等[28]发现通过敲低 PSMA3-AS1表达后可抑制胶质瘤细胞内PSMA3-AS1的表达水平以及降低胶质瘤细胞的增殖及侵袭能力。皮肤因子(DMKN)首次被发现与皮肤病变愈合和组织纤维化有关。LECLERC等[29]在基因敲除(KO)小鼠模型中观察到缺乏表皮DMKN b和c亚型的小鼠表现出短暂的角质化缺陷，影响皮肤愈合。在小鼠肝纤维化模型中组蛋白去乙酰化酶抑制剂可降低小鼠肝组织中DMKN的mRNA表达，抑制肝纤维化[30]。上述研究发现PSMA3、DMKN分别参与了神经细胞的增殖、侵袭以及机体组织纤维化等生物过程，但目前关于PSMA3、DMKN在ACSR发病过程中如何发挥作用，暂未见相关报道。此次研究结果显示，与正常健康人组相比，ACSR组中PSMA3、DMKN蛋白表达明显下调。由此推测，PSMA3、DMKN可能是ACSR的特异性蛋白标志物，但其如何调控ACSR的发生与发展还需进一步探讨。
3.2 以往研究的不足及此次研究的局限性以往研究认为，机械压迫学说、化学性神经根炎学说以及自身免疫学说可能是神经根型颈椎病的主要发病机制[31]。然而神经根型颈椎病的详细病因及发病机制尚不完全清楚，这一直以来都是大家研究的热点，研究方法也不尽相同，但主要涉及动物层面的实验性研究以及临床层面的影像学与治疗学研究。目前，动物层面实验性研究主要从中医药对神经根型动物模型的镇痛作用机制以及对神经元的保护作用进行探讨，其作用机制可能与抗神经细胞凋亡、抗神经炎反应有关[2，5，32-33]。但是，临床疾病完全转化为动物模型存在许多艰巨的问题，动物模型尚不能完全实现神经根型颈椎病发生与发展过程中呈现的复杂性、全面性及不可控性[34]。影像学研究主要通过影像检查技术，如X射线片、CT、MRI客观地观察颈椎局部骨或软组织的病理变化，如椎间盘突出、椎间孔狭窄，其在临床诊断与治疗中发挥重要作用，但是影像学诊断质量不仅直接受限于影像设备自身的影响，还受限于影像技术人员的摄片水平、临床医生的诊断水平，还存在部分影像检查费较用高、具有创伤性等问题，一定程度上限制了影像学在早期筛查ACSR的临床应用[35]。总之，影像学研究也面临诸多问题，且无法从分子生物学角度探讨ACSR发病的作用机制。临床治疗学研究主要是基于上述“三大学说”的理念采用中医药保守治疗或不同手术方式干预ACSR，进而探讨其临床疗效[36-37]，但尚未发现从临床病例出发探讨其具体分子生物学机制的相关报道。相比之下，血清样本在样品获取、快速批量筛查标志物上具有巨大优势。以往诸多研究分别采用该技术分析了脊髓损伤的发病机制、骨质疏松症的治疗作用机制以及机体对运动应激的适应机制，筛选出了相关的生物标记物，为进一步研究ACSR的生物标志物提供了技术支持与理论基础[6-8]。此次研究结果初步从人体血清角度探讨了正常健康人向ACSR转化的分子生物学作用，为进行早日筛查、诊断、监测病情进展以及精准防治奠定了前期基础。此次研究首次采用TMT技术探讨ACSR患者的血清生物标记物，尚存在不足之处。虽然TMT技术是蛋白质定量的高通量筛选技术，但该技术仍存在一些缺陷，如样品和缓冲液中的杂质易污染TMT试剂，从而影响定量结果的准确性。另外，TMT检测相关仪器及试剂价格较昂贵，不利于临床推广使用。最后，此次研究的样本量相对较少，未考虑到性别和年龄对定量结果的影响。
综上所述，此次研究通过TMT联合LC-MS/MS蛋白质组学检测技术，探索到HLA-A、HPD、PSMA3、DMKN、SCGB1A1、MYL3等10种与ACSR发病相关的共同差异蛋白，初步阐明了上述差异蛋白主要涉及ACSR发病过程中相关的机体免疫、细胞炎症反应、能量代谢、机械压力等系统，并初步推测HLA-A、HPD、MYL3是正常健康人向ACSR转化过程中的特异性血清标志物。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

急性期神经根型颈椎病患者的血清差异蛋白组学分析

Analysis of serum differential proteomics in patients with acute cervical spondylotic radiculopathy

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