类风湿性关节炎滑膜组织差异基因的筛选和分析

doi:10.12307/2023.406

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (20): 3224-3229.doi: 10.12307/2023.406

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类风湿性关节炎滑膜组织差异基因的筛选和分析

王晨宇1，姚佳炜2，徐雄峰3，邱波4

武汉大学人民医院，1骨科，2国际医疗部科，3急诊科，4骨二科，湖北省武汉市 430060

收稿日期:2022-05-06 接受日期:2022-06-17 出版日期:2023-07-18 发布日期:2022-11-21
通讯作者: 邱波，博士，主任医师，武汉大学人民医院骨二科，湖北省武汉市 430060
作者简介:王晨宇，男，1997年生，河南省鹿邑县人，汉族，武汉大学在读硕士，医师。
基金资助:
湖北省科技支撑计划项目(2015BCA316)，项目负责人：邱波

Screening and analysis of differentially expressed genes in synovial tissue of rheumatoid arthritis

Wang Chenyu1, Yao Jiawei2, Xu Xiongfeng3, Qiu Bo4

1Department of Orthopedics, 2International Medical Services, 3Department of Emergency, 4Second Department of Orthopedics, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China

Received:2022-05-06 Accepted:2022-06-17 Online:2023-07-18 Published:2022-11-21
Contact: Qiu Bo, MD, Chief physician, Second Department of Orthopedics, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
About author:Wang Chenyu, Master candidate, Physician, Department of Orthopedics, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
Supported by:
Funding: Hubei Province Science and Technology Support Program, No. 2015BCA316 (to QB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

类风湿性关节炎：是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病。其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失。
Hub基因：又称关键基因，是指在相关疾病或某生物学过程中发挥至关重要作用的基因，其表达可影响其他基因的调控，往往作为相关疾病重要的作用靶点和研究热点。

背景：类风湿性关节炎为自身免疫性疾病，研究其发病机制并进行相应的靶向治疗是目前主要的研究方向。
目的：对类风湿性关节炎滑膜炎基因芯片数据进行生物信息学分析，寻找差异基因，建立和完善类风湿性关节炎的基因调控网络。
方法：利用GEO2R对数据库中筛选出的类风湿性关节炎芯片进行基因差异表达分析，使用R语言及 DAVID 对差异基因进行基因本体论富集分析和DAVID功能富集分析，String数据库进行蛋白网络互作分析，Cystoscape软件获取关键基因，实时荧光定量PCR和Western blot对部分关键靶基因进行实验验证。
结果与结论：①类风湿性关节炎患者的滑膜组织中2 064个基因呈差异性表达，其中上调基因625个，下调基因1 439个；②差异基因主要涉及免疫反应激活细胞表面受体信号通路和抗原受体介导的信号通路等生物反应；③根据蛋白互作网络分析筛选出10个关键靶基因，包括表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、MYC、RELA、ITGB2、LCK、EPHB2、IRF4、NRAS、FN1、MAPK1；④基于蛋白互作网络的蛋白互作线数量与Cystoscape算法评分得到EGFR、MYC、RELA、ITGB2、LCK五个显著性较高的基因，并对其进行实验验证；⑤实时荧光定量PCR和Western blot实验结果表明，类风湿性关节炎组滑膜组织中 EGFR、MYC、RELA、ITGB2、LCK基因的 mRNA和蛋白表达水平较对照组滑膜组织显著增高，其中EGFR最为显著；⑥提示膝关节类风湿性关节炎滑膜组织有明显不同的基因表达特征，其中EGFR是类风湿性关节炎滑膜组织最有价值的差异表达基因。
https://orcid.org/0000-0002-4338-2657(王晨宇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 类风湿性关节炎, 滑膜组织, 差异基因, 生物信息学, 基因调控网络

Abstract: BACKGROUND: Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease. Research on rheumatoid arthritis mainly focuses on its pathogenesis and target therapy.
OBJECTIVE: To search for differential genes by bioinformatics analysis of rheumatoid arthritis synovitis gene chip datasets, and to establish and improve the gene regulation network of rheumatoid arthritis.
METHODS: GEO2R was used to analyze the differential expression of rheumatoid arthritis chips screened from the database. R language and DAVID were used for gene ontology enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment analysis of differentially expressed genes. String database was used for protein-protein interaction network analysis. Cystoscape software was used to obtain key genes. qPCR and western blot were used for experimental verification of some key target genes.
RESULTS AND CONCLUSION: There were 2 064 differentially expressed genes in the synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis, including 625 up-regulated genes and 1 439 down-regulated genes. Differentially expressed genes are mainly involved in immune response-activated cell surface receptor signaling pathway, antigen receptor mediated signaling pathway and other biological responses. Ten key target genes, including epidermal growth factor receptor (EGFR), MYC, RELA, ITGB2, LCK, EPHB2, IRF4, NRAS, FN1, and MAPK1, were identified by the protein-protein interaction network analysis. The number of protein interaction lines based on the protein-protein interaction network and Cystoscape algorithm score were used to obtain five genes with high significance, including EGFR, MYC, RELA, ITGB2, and LCK, and the experimental verification of these genes was carried out by qPCR and western blot experiments. The mRNA and protein expression levels of EGFR, MYC, RELA, ITGB2, and LCK genes in the synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis were significantly higher than those of the control group, and the expression of EGFR changed most significantly. To conclude, there are distinct gene expression characteristics in the synovial tissue of knee joint after rheumatoid arthritis, and EGFR is the most valuable differentially expressed gene in the synovium of rheumatoid arthritis.

Key words: rheumatoid arthritis, synovial tissue, differentially expressed gene, bioinformatics, gene regulatory network

中图分类号:

王晨宇, 姚佳炜, 徐雄峰, 邱波. 类风湿性关节炎滑膜组织差异基因的筛选和分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(20): 3224-3229.

Wang Chenyu, Yao Jiawei, Xu Xiongfeng, Qiu Bo. Screening and analysis of differentially expressed genes in synovial tissue of rheumatoid arthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(20): 3224-3229.

图/表（结果） 6

2.1 差异基因的筛选将RA组与对照组在GEO2R中进行分析，利用R语言绘制热图，结果提示RA组差异基因共2 064个，其中上调基因625个，下调基因1 439个，见图1。

2.2 基因本体论富集分析对差异基因进行功能注释，结果表明，上调基因主要参与免疫反应激活细胞表面受体信号通路、抗原受体介导的信号通路和单核细胞增殖等生物反应(图2A)，下调基因主要参与细胞黏附分子结合、T细胞激活和中性粒细胞激活等生物反应(图2B)。

2.3 蛋白互作网络的构建向Sting数据库输入上调基因，最低置信度为> 0.7(“minimum required interaction score > 0.7”)为条件，得到613个节点，1 069条蛋白-蛋白互作线的网络。从该数据库下载结果并在Cytoscape中运用BottleNeck算法计算出10个Hub基因，见图3，分别为EGFR、MYC、ELA、ITGB2、LCK、EPHB2、IRF4、NRAS、FN1和MAPK1。

2.4 DAVID富集分析对10个Hub基因进行分析，结果见图4所示，Hub基因在生物学过程中主要参与刺激性C型凝集素受体信号通路、核因子κB转录因子正向调控和细胞对肿瘤坏死因子反应等生物学过程，构成黏着斑、细胞膜和三级颗粒膜等细胞成分，介导转录激活活性、磷酸酪氨酸结合和蛋白结合等生物功能，在白细胞介素17和转化生长因子β等信号通路中发挥作用。

2.5 实时荧光定量PCR验证结果结果显示，与对照组相比，RA组中 EGFR、MYC、RELA、ITGB2、LCK基因的 mRNA表达水平显著增高，其中EGFR尤甚(P < 0.05)，见图5。

2.6 Western blot验证结果结果显示，与对照组相比，RA组中EGFR、MYC、RELA、ITGB2、LCK基因的蛋白表达水平明显升高，其中EGFR的蛋白表达增加最为显著(P < 0.05)，见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计生物信息学分析，体外实验结果验证，单因素方差分析和t检验。
1.2 时间及地点实验于 2020年9月至2022年3月在武汉大学第一临床学院实验室完成。
1.3 实验资料及方法
1.3.1 基因综合数据库筛选差异基因
(1)微阵列数据选取：从基因综合数据库中选取GSE55235数据集，包括20例创伤性膝关节损伤滑膜组织样本(对照组，15男5女，平均年龄55岁)和33例RA患者的滑膜组织样本(RA组，8男25女，平均年龄57岁)。
(2)差异基因的筛选：利用GEO2R在线工具对GSE55235数据集中RA滑膜组织样本与对照组滑膜组织进行差异基因分析。差异基因的筛选条件为|logFC>=1|和adj.P.val(adjust P.value) < 0.05，采用“ggplot2”“ggrepel”“limma”“pheatmap”等程序包构建差异基因的热图。
(3)基因本体论富集分析：利用WebGestalt(http://www.webgestalt.org/option.php#)在线数据库中基因本体论功能对差异基因进行解析，分析结果用R语言中“dplyr”和“ggplot2”程序包绘制气泡图。
(4)蛋白互作网络的绘制：将差异基因输入String(https://cn.string-db.org)网站进行分析，以最低置信度为“minimum required interaction score > 0.7”得出蛋白互作结果。利用Cytoscape 3.8.0软件对结果进行网络拓扑解析，构造蛋白互作网络模型。
(5)DAVID功能富集分析：利用DAVID(http:// david.ncifcrf.gov)对蛋白互作网络中显著性较高的差异基因进行生物学过程、细胞成分、分子功能、富集通路等生物学分析并绘制相关图表。
1.3.2 膝关节样本的采集和处理患者均来源于武汉大学人民医院2020年9月至2022年3月收治的患者，3 例取自膝关节置换RA患者的滑膜组织作为RA组(2女1男，平均年龄54岁)，3 例取自关节镜检半月板缝合或切除时干扰手术视野切除的滑膜组织作为对照组(2男1女，平均年龄46岁，)，所有患者均无基础疾病和其他炎性疾病。试验经由武汉大学人民医院伦理委员会批准，批准号：WDRY2020-K226，批准日期：2020-05-31。
(1)实时荧光定量PCR测定关键基因mRNA的表达：取滑膜组织按照SYBR Green 反转录试剂盒(购自武汉伯韬生物科技有限公司)说明进行操作，采用实时荧光定量PCR检测仪进行检测，反应条件为：95 ℃预变性 10 min，95 ℃ 变性15 s，60 ℃退火延伸 60 s，共40个循环。根据PCR反应信号强度Ct值计算每个样本目的基因相对表达量，以目的基因吸光度值与内参基因(GAPHD)吸光度值的比值作为该目的基因的相对表达量。引物序列详见表1。

(2) Western blot测定关键基因蛋白的表达：Bicinchoninic acid(BCA)测定法测定滑膜组织中差异基因相关蛋白浓度，沸水浴10 min，电泳、转膜后用5% 脱脂奶粉封闭液封闭，孵育一抗(GAPDH以1∶1 000稀释；EGFR以1∶1 000稀释；MYC以1∶2 000稀释；RELA以1∶2 000稀释；ITGB2以1∶500稀释；LCK以1∶500稀释)和二抗(1∶50 000稀释)，显影成像。
1.4 主要观察指标基因筛选个数、功能；实时荧光定量PCR测定关键基因mRNA的表达，结果以2-ΔΔCt计算法数值表示；Western blot测定关键基因蛋白的表达，结果以吸光度比值表示。
1.5 统计学分析运用SPSS(26.0版本)对数据进行单因素方差分析和t检验，结果用x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。此文统计学方法得到武汉大学统计学专家审核。

讨论

RA发病机制复杂，涉及多个致病基因的调控，因此对RA差异基因进行分析，完善RA致病基因网络，可为RA靶点治疗提供方向。
分析数据集GSE55235，结果显示，RA滑膜组中2 064个基因存在差异性表达，其中625个基因表达上调，提示RA发病是由众多基因相互作用导致的结果。对这些差异基因在RA中发挥的功能作用进行基因本体论功能富集分析，结果发现这些基因主要参与免疫反应激活细胞表面受体信号通路和抗原受体介导的信号通路等生物反应。在关节炎小鼠模型中，白细胞介素18受体与白细胞介素18结合后通过白细胞介素18受体信号通路刺激肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β过表达，促进关节软骨的破坏及炎症的进展。辅助性T细胞17在小鼠关节滑膜中通过T细胞受体信号通路激活单核细胞产生白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α，导致慢性炎症和关节破坏的发生[5-6]。
对上述差异性基因进行蛋白互作网络的构建，筛选出10个Hub基因，分别为EGFR、MYC、RELA、ITGB2、LCK、EPHB2、IRF4、NRAS、FN1和MAPK1。
MYC在RA患者中通过抑制脂肪酸合成介导滑膜细胞的自噬过程，抑制MYC的表达在体内外具有抗炎作用，是探索抗炎药物新作用机制的策略之一[7-8]。RELA属于核因子κB家族蛋白，参与神经保护和神经毒性作用，在RA小鼠关节组织中的磷酸化水平升高，促进RA滑膜炎症的发生[9-10]。
ITGB2调节细胞存活、增殖和黏附，与RA的发病有关[11-12]。LCK在RA患者中通过调节酪氨酸残基的细胞内信号分子磷酸化，参与T淋巴细胞的增殖和分化，介导RA疾病的发生和发展[13-14]。EPHB2调控细胞迁移、生长和黏附，目前在关节炎症中相关信息报道较少[15]。IRF4通过参与Ⅰ型干扰素信号通路调节免疫反应，与免疫细胞的成熟和分化有关，在 RA患者中通过核因子κB途径参与RA的发生[16-17]。NRAS调节细胞增殖、分化和生存，其突变可导致自身免疫性疾病的发生[18-19]。FN1与头颈部鳞状细胞癌的病理分级和生存率呈强相关，可作为头颈部鳞状细胞癌潜在的预后生物标志物[20]。MAPK1属于丝裂原活化蛋白激酶家族中的一员，被报道参与调控细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和转移，介导破骨细胞的激活[21-23]。
在上述10个Hub基因中，选用差异性显著的 EGFR、MYC、RELA、ITGB2、LCK进行富集分析，结果提示，这些基因主要参与C型凝集素受体和核因子κB转录因子正向调控等生物学过程，构成黏着斑和细胞膜等细胞成分，介导转录激活活性和磷酸酪氨酸结合等分子功能，在白细胞介素17和转化生长因子β等信号通路中发挥作用。激活核因子κB通路可抑制RA成纤维细胞样滑膜细胞的凋亡，间接导致RA滑膜炎的发生[24-25]。黏着斑是一种在肌动蛋白纤维末端连接细胞外基质的大分子多蛋白组合，参与黏着斑激酶信号通路，促进RA 成纤维滑膜细胞的迁移，可作为治疗RA的潜在靶
点[26-27]。在RA患者滑膜中，白细胞介素17通过促进滑膜细胞产生白细胞介素6、白细胞介素8、血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶1，导致滑膜炎症的发生，在RA患者外周血中，白细胞介素17刺激辅助性T细胞的产生，与RA活动性或关节损伤进展有关[28-30]。转化生长因子β通过促进RA滑膜成纤维细胞的增殖和迁移，导致RA滑膜炎的发生[31]。实时荧光定量PCR和Western blot实验表明，RA组滑膜组织 EGFR、MYC、RELA、ITGB2、LCK基因的mRNA和蛋白表达水平较对照组增高，其中EGFR的mRNA表达水平和蛋白表达水平升高最为明显。
EGFR是一种酪氨酸激酶家族的跨膜受体，与特定配体结合，通过酪氨酸残基磷酸化激活下游MAPK、磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B、Janus激酶/信号转导和转录激活因子蛋白等信号通路，促进DNA合成、细胞增殖和血管生成[32-33]。
EGFR在脑缺血、脊髓损伤和阿尔茨海默症等神经退行性疾病中表达水平升高，诱导神经炎症的发生，并在损伤反应中重新激活星形胶质细胞，导致星形胶质细胞增生[34-35]。在转基因小鼠中诱导人肺癌相关的突变型EGFR基因表达，导致肺腺癌的发生，而抑制EGFR的表达肿瘤发生退化，表明EGFR促进肺癌的发生[36]。在细胞实验中的研究显示，抑制 EGFR可抑制软骨细胞增殖和细胞外基质合成，促进软骨细胞凋亡[37]。在骨关节炎病情进展中，EGFR促进金属蛋白酶的表达和软骨基质的降解，导致软骨破坏[38]。在RA增生的滑膜组织中，EGFR表达水平升高，通过促进滑膜内皮细胞增殖和成纤维细胞产生肿瘤坏死因子α等细胞因子，加重RA滑膜炎症反应，EGFR抑制剂厄洛替尼可减轻小鼠的关节滑膜炎、软骨和骨侵蚀，减少关节滑膜血管翳的形成，抗EGFR的单克隆抗体西妥昔单抗可抑制RA患者滑膜增殖，减缓关节破坏和炎症的进展[39-40]。
此文通过生物信息学分析，筛选出多个与RA滑膜炎发生发展相关的差异基因，完善了RA的基因调控网络，其中EGFR差异性表达最为明显。已有研究显示EGFR可作为RA潜在的治疗靶点，但RA发病机制复杂，对EGFR及其可能涉及的通路进行深入研究，可为RA的靶向治疗提供新的方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

类风湿性关节炎滑膜组织差异基因的筛选和分析

Screening and analysis of differentially expressed genes in synovial tissue of rheumatoid arthritis

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