2.1   骨关节炎组和类风湿性关节炎组滑膜组织circRNA差异表达聚类分析   与类风湿性关节炎组相比，有185种已知的差异表达circRNA，其中有14种上调，171种下调，见图2，以log2(倍数变化)为横轴，-log10(P值)为纵轴，绘制差异表达circRNA的火山图，可以直观地展示差异表达基因的整体分布情况。 横轴代表对照组基因表达的变化率，纵轴代表基因表达变化差异的统计显著性，红色是显著上调的差异表达基因，蓝色代表显著下调的差异表达基因，灰色代表不显著表达的基因，见图3。



2.2   骨关节炎组和类风湿性关节炎组滑膜组织差异表达  circRNA热图分析   衍生基因聚类分析用于确定不同实验条件下基因调控的聚类模式。对基因进行聚类分析，根据样本基因表达谱的相似性，直观地展示基因在不同样本(或不同处理)中的表达情况，获取生物学相关信息。为了更直观地反映聚类的表达模式，横轴为样本，纵轴为筛选出的差异表达基因。不同的颜色表示不同的基因表达水平。颜色由蓝色变为白色变为红色，表示由低表达到高表达，红色表示高表达基因，蓝色表示低表达基因。映射数据的选择基于P值从小到大排序，前100个基因用来绘制热图，见图4。



2.3   骨关节炎组和类风湿性关节炎组滑膜组织circRNA差异表达GO分析    GO富集分析结果的直方图反映了针对生物过程、细胞成分和分子功能富集的GO_Term上差异基因的个数分布情况。根据注释到GO_Term的差异基因数目(S gene number)针对3种GO_function从高到低排序，选择Top25、Top15、Top10 GO_Terms进行绘图。如果有多个GO_Terms对应相同数量的基因编号，则随机选择一个GO_Terms进行绘制，见图5A。GO富集分析的结果通过ggplot2以散点图的形式显示。横轴的rich factor代表GO中的差异基因数/位于该GO的总基因数，Rich factor越大，GO富集的程度越高。纵坐标是GO_Term，是GO途径的注解。P值小于 0.05 表示显著富集。GO富集分析散点图是根据富集的显著性(P值)取Top20的Go_term进行绘图，见图5B。



从图上可以看出，在生物过程(Biological Process)层面，骨关节炎组患者滑膜组织差异表达的circRNA主要富集于蛋白 H3-K36 二甲基化、鞘糖脂生物合成过程、Toll样受体9信号通路的正调控、核糖体蛋白导入细胞核、GTP酶活性的调节等过程。在细胞成分(cellular component)层面，骨关节炎组患者滑膜组织差异表达的circRNA主要富集于细胞膜、高尔基体、细胞内膜结合的细胞器、细胞连接、早期内体膜等细胞组分中。在分子功能(molecular_function)层面，钾离子和钠离子逆向转运蛋白活性、内质网管状网络、激活信号协整器 1 复合物、转移酶活性、非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶活性等均在骨关节炎组中有明显差异表达。
2.4   骨关节炎组和类风湿性关节炎组滑膜组织circRNA差异表达KEGG分析   KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是由日本京都大学和东京大学联合开发的数据库，是系统分析基因功能、联系基因组信息和功能信息的知识库，可以用来查询代谢途径、酶(或编码酶的基因)、代谢产物等，也可以通过BLAST比对查询未知序列的代谢途径信息(www.genome.jp/kegg)。
骨关节炎组和类风湿性关节炎组滑膜组织差异表达的circRNA主要参与了肾素分泌、长期增益效应、人类免疫缺陷病毒1型感染、硒化合物代谢、糖胺聚糖生物合成——硫酸软骨素/硫酸皮肤素、血管内皮生长因子信号通路、长期抑郁、cGMP-PKG信号通路、催乳素信号通路等，见图6A。KEGG分析进一步揭示富集circRNA在已知通路中的表达情况。图6B为血管内皮生长因子信号通路(VEGF signaling pathway)富集分析图，黄色代表注释到某个ko节点的显著差异表达基因既有上调也有下调，实心箭头表示生化反应的方向，虚线箭头连接其他的相关代谢途径。



2.5   骨关节炎组和类风湿性关节炎组滑膜组织差异表达   circRNA-miRNA 蛋白互作网络   见图7。有证据表明circRNA可以通过与miRNA直接结合改变游离miRNA的浓度，从而影响相关miRNA的活性，起到miRNA海绵的作用[10]。




因此，根据以上测序结果创建了一个circRNA-miRNA 相互作用网络，该网络有助于理解差异表达circRNA的作用。在所有185个差异表达的circRNA中，有超过2 000 个miRNA与其产生相互作用并满足包容性标准。最终可视化4个具有代表性的circRNA的相关网络，见图7。
2.6   骨关节炎组和类风湿性关节炎组滑膜组织差异表达   circRNA-miRNA-mRNA轴   circRNA作为内源性竞争性RNA通过碱基互补海绵吸附miRNA的方式来调控下游靶基因。miRNA通过靶向mRNA的3'UTR降低mRNA的稳定性或者抑制mRNA的翻译，进而负向调控靶基因的表达，这类转录后调控模式称作ceRNA假说。ceRNA不仅参与正常细胞的各种生物过程，而且在各类炎症和肿瘤中也发挥重要作用[11]。circRNA-miRNA-mRNA轴在其他疾病中的病理作用得到很多研究，而在骨关节炎及类风湿性关节炎中的研究还较少。由于差异基因靶向的下游mRNA较多，该研究仅将出现频次最高的前3位mRNA位点及其与代表性的3个circRNA形成的circRNA-miRNA-mRNA轴进行可视化，见图8，并针对性的进行相关分析。这些研究将为骨关节炎的发病机制、诊断和治疗提供新的方向。

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原发性膝骨关节炎的疾病发展特征是关节软骨变性、软骨硬化、骨赘形成和滑膜炎，是老年人最常见的慢性关节疾病[1]。在全球范围内，估计有2.5亿人患有膝骨关节炎，并且发病率正在增加[2]。类风湿关节炎是一种病因不明确以滑膜炎症为主的慢性系统性疾病[3]，常伴有关节外器官症状及类风湿指标阳性等情况，存在关节致畸及功能丧失的可能。类风湿关节炎的发病目前认为可能与感染、遗传、性激素等有关，以全身性的发病机制为主[4]。当类风湿关节炎伴发下肢大关节症状时，与骨关节炎的鉴别常常比较困难。尤其是当类风湿因子等指标变化不显著时，骨关节炎与类风湿关节炎常被临床工作者混淆[5]。这类问题易引起临床医生对于关节炎患者病情的认识不足和错误治疗，有效鉴别骨关节炎与类风湿关节炎的手段亟待发现。
最近研究表明滑膜组织与膝骨关节炎发生发展有密不可分的联系[6]。滑膜炎可影响骨关节炎患者的症状表现和软骨退变程度。在骨关节炎的不同阶段，滑膜组织被成纤维细胞如滑膜细胞和其他免疫细胞浸润，临床上常通过关节镜活检滑膜组织可以帮助诊断骨关节炎。因此，该研究主要检测骨关节炎患者滑膜组织。
环状RNA(circRNA)是一大类在真核细胞的细胞质中普遍存在的非编码RNA，这类内源性RNA的特点是结构稳定、组织表达特异性高[7]。有最新文献提到，circRNA作为miRNA的“海绵”，可以自然地隔离并竞争性地抑制miRNA的活性[8]。目前已有研究证明circRNA参与多种疾病的发展，例如动脉粥样硬化和神经系统疾病[9]。然而，circRNA对骨关节炎发病机制的总体作用仍然未知，circRNA在骨关节炎与类风湿关节炎中的差异表达，目前的文献也较少探讨。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   该研究为涉及人体组织的基因测序对照研究。目前文献认为骨关节炎与类风湿关节炎的发病机制不同，故猜测这两类患者滑膜样本的circRNA序列也有所不同，所以该研究以类风湿关节炎滑膜样本为对照组，筛选出与骨关节炎滑膜样本差异表达的circRNA具体位点，主要运用R语言对差异表达的circRNA位点进行聚类分析，并进行GO及KEGG富集通路分析。
1.2   时间及地点   实验于2021年3-5月在南京医科大学附属无锡市第二人民医院实验室完成，其中2021-03-01/04-31完成标本采集与保存。
1.3   对象   入组患者均为严重膝关节病变且主动要求进行关节置换的患者。
原发性膝骨关节炎患者均满足以下诊断标准：①近1个月内反复膝关节疼痛；②X射线片(站立或负重位)示关节间隙变窄、软骨下骨硬化或囊性变、关节骨赘形成；③年龄≥40岁；④术中见关节液清亮，白细胞< 2×106 L-1；⑤活动时有骨摩擦感；⑥晨僵≤30 min。
类风湿性关节炎患者均满足以下诊断标准：①受累关节的数目≥3个；②类风湿因子和抗CPP抗体增高，血沉和C-反应蛋白增高；③膝关节X射线片可见典型的类风湿性关节炎放射学改变，包括骨质侵蚀或受累关节及其邻近部位有明确的骨质疏松；④发生晨僵至少6周，每次>1 h。该研究对于入组标准把控较严格，例如隐匿性的类风湿性关节炎(有影像学表现但类风湿因子阴性)则不予入组研究。

从10例行全膝关节置换患者的膝关节中分离出滑膜组织(类风湿性关节炎2例，原发性膝骨关节炎8例)，见图1。将新鲜材料立即转移到液氮中保存。所有患者均签署知情同意书，并按照无锡市第二人民医院伦理委员会的规定进行治疗。对10例患者滑膜组织进行了整个转录组分析。由于无法通过手术获得健康人的滑膜组织，因此将8例膝骨关节炎患者作为骨关节炎组，将2例类风湿性关节炎患者作为对照组。由于RNA-seq对于样本保存要求较高，储存时间过长会损失RNA片段，所以选取了2个月内诊断明确且进行手术的2例类风湿性关节炎患者。

1.4   方法   
1.4.1   RNA文库的构建和测序   使用 Trizol 试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)根据既定程序分离和纯化所有样品RNA，使用 NanoDrop ND-1000(NanoDrop，Wilmington，Germany，USA)定量和纯化每个样品的RNA。RNA 的完整性由 Agilent 2100 评估，RIN 值 > 7.0。根据 Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Illumina，San Diego，USA)的手册，去除总RNA中大约5 μg核糖体RNA序列。核糖体RNA被去除后，在高温下使用二价阳离子将剩余的RNA片段化成更小的片段。将裂解的RNA片段反转录以创建cDNA，将其与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、RNase H和dUTP进行反应，合成第二链DNA。然后，将A碱基添加到每条链的平末端，以准备将其连接到索引的衔接子。每个衔接子包含一个T碱基突出端，用于将衔接子与A尾片段化的DNA连接。将单索引或双索引衔接子连接至片段，并使用AMPureXP磁珠进行大小选择。对第二链DNA进行热不稳定的UDG酶处理，用PCR扩增对产物进行连接：在95 ℃初始变性3 min，然后在室温下变性；在98 ℃变性15 s，在60 ℃进行退火15 s，在72 ℃时延伸30 s，8个循环；最后72 ℃延伸5 min。最终cDNA文库的平均插入大小是(300±50) bp，之后在Illumina Hiseq 4000 (LC Bio, China)平台上根据供应商推荐的协议进行了配对末端测序。
1.4.2   circRNA文库的生物信息学分析   使用Cutadapt删除包含链接器污染、劣质碱基和未确定碱基的读数，然后使用FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)检查序列的质量，使用 Bowtie2和Hisat2将读数映射到物种的基因组，剩余的读数(未映射的读数)仍然使用顶帽融合技术放置在基因组中。使用CIRCExplorer2和CIRI将映射的读数组装成一个circRNA，接下来使用顶帽融合技术将未映射的引线识别反向拼接的引线。所有样品都产生了它们自己的环状RNA。通过R包选择差异表达的circRNA——Edge R及其log2(变化放大倍数)> 1或log2(变化放大倍数)<-1且差异有显著性意义(P < 0.05)。用R语言处理完数据后，进行GO及KEGG等聚类分析，做进一步调查。
1.4.3   circRNA 及 miRNA相互作用分析   根据目前的文献，circRNA可以与mRNA竞争细胞质中的 miRNA 靶标。也就是说，circRNA充当内源竞争RNA (ceRNA)，影响转录后miRNA的调节功能。课题组将对此进行详细分析以进行后续验证实验。对于动物，circRNA-miRNA相互作用分析主要使用Targetscan和miRanda软件进行分析。Targetscan根据种子区域预测miRNA目标。miRanda主要基于 circRNA和miRNA之间结合的自由能，值越小，两者的结合越强。根据circRNA-miRNA相互作用分析的targetmimics规则独立开发内部脚本，最后使用cytoscape 创建一个circRNA-miRNA相互作用网络图。 
1.5   主要观察指标   ①每例样本的RNA完整性(RIN值> 7.0)，以保证测量结果的参考价值；②差异表达circRNA的具体位点及表达情况；③GO及KEGG等聚类分析得出的具体富集通路；④circRNA靶基因位点的预测。
1.6   统计学及生物信息学分析   数据运用SPSS 25.0统计学软件进行分析，对比得出差异表达位点，筛选log2(倍数变化)> 1或log2(倍数变化)<-1且具有显著差异(P < 0.05)的位点。通过R工具包datasets，ggplot2，Bioconductor等对差异表达的circRNA基因进行可视化和聚类分析：包括GO及KEGG分析。使用Targetscan和miRanda软件预测circRNA的靶基因，并利用cytoscape v3.6.0进行相关可视化操作。

随着测序技术的进步，以前被认为是mRNA剪接错误副产物的circRNA正在成为研究热点。根据最新研究表明，circRNA 能够通过多种机制调节基因表达，包括调节转录、与RNA 结合蛋白相互作用和翻译蛋白质[12]。研究最广泛的调节机制是circRNA 作为 miRNA 海绵的作用。越来越多的研究工作证明，circRNA作为竞争性内源性RNAs调节多种生理和病理过程，并有可能成为多种肿瘤的理想生物标志物，例如肝细胞癌、胃肿瘤和膀胱肿瘤[13]。
近年来，对circRNA与骨骼疾病之间的关联研究越来越多[14]。然而，circRNA在骨关节炎中的表达和功能是一个全新的领域，亟需被关注。2016 年，LIU 等[15]首次使用circRNA芯片总结了circRNA在骨关节炎软骨中的表达构型，发现有71个circRNA存在差异表达。他们进一步证明了circRNA-100876(也称为 circRNA-CER)作为miR-136的海绵功能，与骨关节炎中软骨细胞的细胞外基质降解有关[16]。此外，机械应力也可能导致软骨细胞中circRNA的异常表达。还有研究证明：circRNA-MSR 控制肿瘤坏死因子α表达并在软骨细胞外基质降解过程中发挥作用[17]。has-circ-0045714 通过促进软骨细胞增殖对骨关节炎软骨发挥保护作用，以及 
has-circ-0045714 的致病作用——circ-0005105通过海绵miR-26a促进细胞外基质降解[18]。在关节炎小鼠模型中也发现了circRNA的异常表达[14]。ZHOU等[19]使用circRNA微阵列分析了白细胞介素1β介导的骨关节炎软骨细胞中的circRNA表达，发现了大约 255 种不同的 circRNA，并且证明了circRNA-Atp9b作为 miR-138-5p的海绵来调节骨关节炎进展。这些研究验证了circRNA在骨关节炎进展中的重要作用。
目前，骨关节炎已被认为是一种炎症状态，而不是简单的“磨损”问题，软骨磨损只是骨关节炎病理特征的一部分[20]。近期越来越多研究认为骨关节滑膜炎会导致严重的临床症状[21]。但是目前还没有详尽的研究直接测定骨关节炎滑膜中的circRNA。因此，课题组直接针对滑膜细胞circRNA进行测序，检测到185个在骨关节炎患者滑膜样本中差异表达的 circRNA。针对差异基因分别进行了GO及KEGG分析。此外，还预测了选定circRNA的目标miRNA，并创建circRNA-miRNA相互作用网络以研究circRNA的调控机制。研究结果表明，circRNA与滑膜炎的调节有关，并且差异表达的circRNA可能通过与炎症和代谢相关的途径发挥作用。
骨关节炎滑膜组织与类风湿性关节炎滑膜组织相比，有185种已知的差异表达circRNA，其中有14种上调，171种下调。circRNA15424、circRNA4156、hsa_circ_0006942等位点差异表达较显著，后期可作为骨关节炎与类风湿性关节炎的生物标志物进行研究，可对两种疾病进行基因层面的鉴别。检出的差异表达circRNA包括了多种已有报道的位点。hsa_circ_0000111已被多个研究证明与类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病有关[22]，而circBbs9已在多年前被证明由白细胞介素18释放，在类风湿性关节炎等疾病中促进白细胞的迁移、黏附和活化，敲除该位点可一定程度上减轻炎症反应[23]。该研究中骨关节炎组高表达的circRNA15424也在多项骨关节炎组织测序中被发现上调现象，具体机制尚未可知，后期可通过敲除EMB观察滑膜细胞变化来进一步了解其作用机制。除此以外，在骨关节炎组织中显著差异表达的hsa_circ_0054853、hsa_circ_0099504、ciRNA197等在关节方面为首次检出，尚无相关报道，该部分位点可能成为治疗骨关节炎的关键靶点。
根据GO功能分析结果，发现差异表达的circRNA在组蛋白 H3-K36 二甲基化、鞘糖脂生物合成过程、Toll样受体信号通路的正调控、核糖体蛋白输入细胞核和GTP酶活性的调节等多个通路中富集。DNA甲基化或组蛋白修饰水平上的各种表观遗传改变与调节软骨细胞分解代谢和合成代谢有关。已有相关研究发现组蛋白H3-K27甲基化可直接抑制WIF-1表达，从而升高促骨性关节炎软骨降解的β-连环蛋白信号[24]。虽然目前对于组蛋白 H3-K36 二甲基化的研究多在癌症领域[25]，但也许其对于骨关节炎疾病进程也存在某方面影响。YANG等[26]研究证明由Toll样受体2和4介导，可产生炎性细胞因子、趋化因子和基质降解酶，引起先天性免疫反应导致膝关节滑膜炎症，故Toll样受体信号通路的正调控可增强此类炎症反应。富集在该通路上的circRNA-PTPN22(hsa_circ_0000111)在骨关节炎组显著低表达。有许多研究已证明，PTPN22调节TCR下游的信号级联，人类PTPN22的突变与1型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和Graves病以及其他自身免疫性疾病有关[27]。该通路通过上调PTPN22加剧类风湿性关节炎的炎症反应。 DEN HOLLANDER等[28]研究证明核糖体蛋白S3是一种多功能DNA修复内切酶和核糖体蛋白，其通过激活CASP8/CASP3诱导细胞凋亡的作用可能与骨关节炎有关。研究结果可由此进行猜测，通过抑制富集在该通路上的hsa_circ_0002854、hsa_circ_0129314，以此阻止核糖体蛋白进入细胞核，有可能减轻滑膜炎症，延缓骨关节炎软骨退变进程。已有成熟的理论证明补充GTP和α-骨化醇可以通过减少氧化应激和炎症而增加骨量，表明GTP和α-骨化醇在慢性炎症患者的骨健康中具有重要作用[29]。结合该研究，通过circRNA调节GTP酶活性也许可以有效增加骨量，减缓慢性关节炎症反应。然而，circRNA 在这些通路中的参与和详细机制仍然难以捉摸，该结果为理解circRNA在骨关节炎病理生理学中的作用提供了新的认识。
KEGG富集分析通路中，肾素分泌、长效增效、血管内皮生长因子信号通路、cGMP-PKG信号通路等被认为与炎症介导反应有密不可分的联系。血管内皮生长因子是促血管生成细胞因子的一种，对无菌性炎症至关重要，并且已知位于转录因子HIF-1信号通路的下游[30]。特别的是，该通路上富集的hsa_circ_0067520在骨关节炎滑膜组织中却为显著低表达，在某些样本中甚至无表达，而在类风湿性关节炎滑膜中高表达。血管内皮生长因子水平通常与炎症程度相关，这似乎说明类风湿性关节炎滑膜炎症一定程度上比骨关节炎严重。有文献显示，类风湿性关节炎关节滑液中的血管内皮生长因子水平高于骨关节炎[31]，但骨关节炎软骨下骨中的血管内皮生长因子水平较高，与骨关节炎严重程度有关[32]，关于滑膜中血管内皮生长因子的测定目前没有文献报道。从侧面证明了骨关节炎主要由软骨部分产生炎症，后波及周围的关节液、滑膜等；而类风湿性关节炎为自身免疫性疾病，由研究结果可推测类风湿性关节炎的炎症极有可能从关节周围软组织发生，后使关节软骨等部分发生侵蚀性的改变。已有多项研究证明炎症和疼痛相关的神经反应与cGMP-PKG有一定关联[33]。除此之外，该研究发现糖胺聚糖生物合成也是富集通路之一，糖胺聚糖生物合成产物之一硫酸软骨素是关节滑液的主要成分[34]。
由于ceRNA机制是circRNA研究工作的重要部分，该研究也检测了骨关节炎滑膜中circRNA的表达构型，并描述了circRNA-miRNA的蛋白互作网络图。先前已报道使用 miRNA 微阵列或 miRNA 测序，miR-16家族、miR-95家族、miR-128和miR-218-5p中的几个成员在骨关节炎中失调[35]。注意到一些上述 miRNA 可以与该网络图中的一种以上 circRNA 相互作用，因此，它们的功能有助于解释已验证的circRNA的功能。软骨细胞分泌的外泌体可通过miR-95-5p调节HDAC2/8的表达影响软骨细胞的分化和软骨基质的合成[36]。miR-128a可通过诱导Atg2解除调控抑制软骨细胞自噬，从而加重骨关节炎进展[37]。miR-218-5p上调通过抑制雷帕霉素信号通路的磷酸肌醇3激酶/Akt/哺乳动物靶点保护骨关节炎小鼠免受软骨降解[38]。对于该研究分析出的某些高度相关miR位点，例如miR-129家族、miR-181家族等位点，目前尚无文献阐述。仍需要详细研究类似miR-129、miR-181在骨关节炎滑膜中的分子机制。该研究提供骨关节炎中circRNA的ceRNA机制蛋白互作网络图，然而大多数差异表达的circRNA尚未注释，非常有必要进行进一步的研究以揭示这些circRNA的基本机制。
通过对ceRNA网络的进一步深入研究，可以预测出大量与差异表达circRNA相互作用miRNA的下游靶点，即mRNA。由此也得到了连贯的circRNA-miRNA-mRNA轴，可用来预测骨关节炎和类风湿性关节炎发生发展过程中各种生物过程机制的可能性。比较高频出现的下游位点包括LARGE1，RASA3和ZNF808，并进行了可视化。由此得到了例如circRNA112-miRNA129-RASA3轴，circRNA154 -miRNA199-LARGE1轴等，其中的具体调控机制值得进一步研究。RASA3是内皮细胞中Rap1的一个关键调节因子，它控制着黏附特性和血管腔的完整性[39]。LARGE1在骨骼肌中常有较高表达[40]。后续可继续采用RNA-seq技术针对mRNA进行检测，以研究其与circRNA的调控机制。
总之，目前的研究主要总结了circRNA在骨关节炎滑膜组织中的表达，接下来进行了GO和KEGG 通路分析以注释差异表达的circRNA潜在作用，探索其分子机制，并使用了生物信息学方法创建了circRNA-miRNA蛋白互作网络。然而，仍需深入研究circRNA在骨关节炎滑膜组织中的详尽机制。希望这项研究能够引起人们对骨关节炎及膝关节滑膜炎的关注，启发更多研究人员研究circRNA在骨关节炎滑膜组织中的作用，并帮助寻找治疗骨关节炎的新靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
环状RNA：是一类特殊的非编码RNA分子，也是RNA领域最新的研究热点。与传统的线性RNA(含5'和3'末端)不同，环状RNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，环状RNA分子富含miRNA结合位点，在细胞中起到miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平，这一作用机制被称为竞争性内源RNA机制。通过与疾病关联的miRNA相互作用，环状RNA在疾病中发挥着重要的调控作用。
RNA-seq：即转录组测序技术，就是用高通量测序技术进行测序分析，该研究中用以反映circRNA的表达水平。标准的工作流程从实验室提取RNA开始，到mRNA富集或去除核糖体RNA，cDNA反转录以及制备由接头连接的测序文库。然后使用高通量测序平台测序，每一个样本通常会被测序到10 000 000-30 000 000读长。最后，实验得到的数据通过比对或拼接测序的读长到转录组，量化覆盖转录本的读长，过滤和样本间归一化，用统计模型描述每个基因在各个样本组之间表达水平的差异。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨关节炎和类风湿关节炎是常见的风湿性疾病，主要累及关节。骨关节炎是最普遍的肌肉骨骼疾病，也是关节炎的最常见形式，涉及关节软骨、软骨下骨、膜囊、韧带、滑膜和关节周围肌肉的结构改变，疼痛是主要症状。骨关节炎的标志是滑膜炎、关节软骨变性和下层骨重塑。单细胞测序作为新兴起的技术，在不同研究方向均得到了广泛应用。该研究直接利用人体组织进行测序，所得结果较有临床参考意义。课题组直接针对滑膜细胞circRNA进行测序，检测到185个在骨关节炎患者滑膜样本中差异表达的 circRNA。针对差异基因分别进行了GO及KEGG分析。此外，还预测了选定circRNA的目标miRNA，并创建circRNA-miRNA相互作用网络以研究circRNA的调控机制。研究结果表明，circRNA与滑膜炎的调节有关，并且差异表达的circRNA可能通过与炎症和代谢相关的途径发挥作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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