人脂肪间充质干细胞成软骨分化过程中差异表达长链非编码RNA鉴定及功能

doi:10.12307/2023.370

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (15): 2325-2332.doi: 10.12307/2023.370

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人脂肪间充质干细胞成软骨分化过程中差异表达长链非编码RNA鉴定及功能

孙红1，2，邓进2，3，彭国璇1，2，庄勇1，刘淼1，宁旭1，杨华1

贵州医科大学附属医院，1骨科，3急诊外科，贵州省贵阳市 550004；2贵州医科大学临床医学院，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2022-05-05 接受日期:2022-06-28 出版日期:2023-05-28 发布日期:2022-10-17
通讯作者: 杨华，主任医师，贵州医科大学附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004
作者简介:孙红，男，1990年生，汉族，硕士，主治医师，主要从事骨与关节退变的基础与临床研究。
基金资助:
贵州省卫生健康委科学技术基金(gzwjkj2020-1-120)，项目负责人：孙红；贵州省卫生健康委科学技术基金(gzwkj2021-261)，项目负责人：杨华；贵州省科技厅基础研究计划(黔科合基础-ZK[2021]一般391)，项目负责人：杨华；贵州医科大学附属医院国家自然科学基金青年基金培育计划项目(gyfynsfc-2021-12)，项目负责人：孙红；贵州省研究生科研基金立项课题(黔教合YJSKYJJ[2021]157)，项目负责人：孙红；贵阳市科技局计划(筑科合同[2018]1-78)，项目负责人：庄勇

Identification and function of differentially expressed long noncoding RNAs in the chondrogenesis of human adipose-derived mesenchymal stem cells

Sun Hong1, 2, Deng Jin2, 3, Peng Guoxuan1, 2, Zhuang Yong1, Liu Miao1, Ning Xu1, Yang Hua1

1Department of Orthopedics, 3Department of Emergency Surgery, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2022-05-05 Accepted:2022-06-28 Online:2023-05-28 Published:2022-10-17
Contact: Yang Hua, Chief physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Sun Hong, Master, Attending physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
Science and Technology Fund of Guizhou Provincial Health Commission, No. gzwjkj2020-1-120 (to SH); Science and Technology Fund of Guizhou Provincial Health Commission, No. gzwkj2021-261 (to YH); Fundamental Research Program of Science and Technology Department of Guizhou Province, No. [2021] 391 (to YH); National Natural Science Foundation Youth Fund Cultivation Program of Guizhou Medical University Affiliated Hospital, No. gyfynsfc-2021-12 (to SH); Project of Guizhou Provincial Postgraduate Scientific Research Fund, No. YJSKYJJ[2021]157 (to SH); Planning of Guiyang Science and Technology Bureau, No. [2018]1-78 (to ZY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
长链非编码RNA：是一类长度大于200个核苷酸、不参与或很少参与蛋白质编码的RNA分子，其与表观遗传、转录水平和转录水平后调控等密切相关，因此可在多个水平调控细胞分化，而长链非编码RNA异常调控则可导致肿瘤、神经以及骨关节退行性疾病等多种疾病的发生。
脂肪间充质干细胞成软骨分化：脂肪间充质干细胞是一种来源于脂肪组织的成体干细胞，同时具有多向分化能力，可向脂肪、骨、软骨细胞分化。脂肪间充质干细胞在特定生长因子作用下可快速向软骨细胞分化和增殖，从而在软骨缺损修复及软骨组织工程等方面扮演着重要角色。

背景：人脂肪间充质干细胞成软骨分化过程受多种因素影响。研究证实，长链非编码RNAs在表观遗传调控、转录以及转录后水平调控等过程中扮演着重要角色，而目前其在人脂肪间充质干细胞成软骨分化过程中表达谱的改变以及调控作用鲜有报道。
目的：探讨人脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化过程中差异表达长链非编码RNAs及其功能。
方法：以人脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化0 d(未诱导组)、14 d(诱导组)细胞为研究对象，利用转录组测序技术筛选成软骨诱导分化前后差异表达倍数变化2倍及以上的长链非编码RNAs和mRNAs，并通过qRT-PCR对测序结果进行验证。采用生物信息学分析对差异表达基因行GO功能分析和KEGG通路富集分析，并筛选长链非编码RNAs邻近基因以及共表达基因。
结果与结论：①与未诱导组相比，诱导组中显著差异表达的长链非编码RNAs共有816条，mRNAs共有5 138条；②GO功能和KEGG信号通路分析发现，差异表达基因富集的主要生物学过程包括细胞进程、生物调节和代谢过程等；主要通路包括黏附斑激酶、胰岛素信号通路、Wnt信号通路等；③对差异表达长链非编码RNAs行邻近基因和共表达基因分析发现，部分长链非编码RNAs如SNHG16、XLOC_003886可能在脂肪间充质干细胞成软骨分化和软骨退变中发挥重要作用；④结果表明，长链非编码RNA的表达谱在脂肪间充质干细胞诱导成软骨分化过程中发生了明显改变；差异表达长链非编码RNAs的生物学功能可能与邻近基因和共表达基因功能密切相关，从而调控脂肪间充质干细胞成软骨分化。然而，其具体调控作用和分子机制有待实验进一步证实。

https://orcid.org/0000-0002-4195-501X (孙红)；https://orcid.org/0000-0002-2133-3408 (杨华)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 长链非编码RNA, 脂肪间充质干细胞, 成软骨分化, 转录组测序, 生物信息学分析

Abstract: BACKGROUND: The chondrogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells is affected by many factors. Studies have confirmed that long noncoding RNAs (lncRNAs) play important roles in epigenetic regulation, transcription and post-transcriptional regulation. However, there are few reports on the changes of its expression profile and its regulatory role during the chondrogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To preliminarily analyze the differentially expressed lncRNAs and their potential functions during the chondrogenesis of human adipose-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: The human adipose-derived mesenchymal stem cells at 0 day (undifferentiated group) and 14 days (differentiated group) after chondrogenic differentiation were used as research objects. RNA-seq was used to screen lncRNAs and messenger RNAs (mRNAs) with expressed fold change larger than twice between groups. Quantitative real time PCR (qRT-PCR) was used to verify the sequencing results. Bioinformatics analyses including GO function analysis and KEGG pathway analysis were performed for differentially expressed genes to screen adjacent genes and co-expressed genes of lncRNAs.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the undifferentiated group, a total of 816 lncRNAs and 5 138 mRNAs were significantly differentially expressed in the differentiated group. (2) GO function and KEGG signaling pathway analysis showed that differentially expressed genes were enriched in several biological processes including cellular processes, biological regulation, and metabolic processes, and multiple pathways including focal adhesion kinase, insulin signaling pathway, and Wnt signaling pathway. (3) Analysis results of adjacent genes and co-expressed genes of differentially expressed lncRNAs indicated that some lncRNAs such as SNHG16 and XLOC_003886 might play critical roles in the chondrogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells and cartilage degeneration. (4) These findings suggest that the expression profiles of lncRNAs were significantly altered during the chondrogenesis of adipose-derived mesenchymal stem cells. The biological functions of differentially expressed lncRNAs may be closely related to the functions of adjacent genes and co-expressed genes, thereby regulating the chondrogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. However, further experiments should be employed to uncover the regulatory roles and underlying molecular mechanisms of differentially expressed lncRNAs.

Key words: long noncoding RNA, adipose-derived mesenchymal stem cell, chondrogenesis, RNA-seq, bioinformatics analysis

中图分类号:

孙红, 邓进, 彭国璇, 庄勇, 刘淼, 宁旭, 杨华. 人脂肪间充质干细胞成软骨分化过程中差异表达长链非编码RNA鉴定及功能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(15): 2325-2332.

Sun Hong, Deng Jin, Peng Guoxuan, Zhuang Yong, Liu Miao, Ning Xu, Yang Hua. Identification and function of differentially expressed long noncoding RNAs in the chondrogenesis of human adipose-derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(15): 2325-2332.

图/表（结果） 10

2.1 脂肪间充质干细胞成软骨分化鉴定结果在成软骨诱导液作用下通过微球法诱导脂肪间充质干细胞向软骨方向分化，24 h后即见细胞微球形成。诱导分化后3，14 d后，阿利新蓝染色提示细胞微球切片均呈阳性，且诱导14 d较诱导3 d时染色深，表明此时有大量软骨基质糖胺聚糖形成，说明脂肪间充质干细胞诱导14 d后已成功地向软骨方向分化，见图1。

2.2 lncRNAs和mRNAs表达谱分析转录组测序结果表明，脂肪间充质干细胞向软骨分化过程中lncRNAs和mRNAs表达谱发生了明显改变，见图2，3。与未诱导组相比，诱导组lncRNAs表达差异倍数变化2倍以上者共有816条，其中442条表达升高，374条表达降低。|log2FC|> 5的lncRNAs共有307条，其中189条上调和118条下调。与未诱导组相比，诱导组mRNAs表达差异倍数变化2倍以上者共有5 138条，其中2 931条表达升高，2 207条表达降低。|log2FC|> 5的mRNAs共有2 008条，其中1 234条表达升高，774条表达下降。部分表达差异改变的lncRNAs和mRNAs见表1，2。同时挑选2个lncRNAs包括MIR4697HG(log2FC=8.535)、TUG1(log2FC=-12.215)以及2个mRNAs包括FN1(log2FC=18.204)、THBS1(log2FC=-15.127)进行qRT-PCR验证，结果表明与测序结果表达趋势一致，见图4。

2.3 GO和KEGG富集分析对差异表达的基因行GO功能富集分析结果如图5所示。GO功能分析结果表明，差异表达基因富集的主要生物学过程为细胞进程、单生物过程、生物调节、代谢过程和对刺激反应等；主要细胞组分包括细胞、细胞区域、细胞器、细胞膜和细胞器部分；主要分子功能包括蛋白结合、催化活性、分子功能调节、信号转导活性和分子转导活性等。

对差异表达的基因行KEGG通路分析结果如图6所示。KEGG通路分析结果表明，差异表达基因富集的主要信号通路包括黏附斑激酶、肌动蛋白细胞骨架调节、细胞因子-细胞因子受体、胰岛素信号通路、Wnt信号通路和转化生长因子β信号通路等。

2.4 lncRNAs与邻近基因联合分析 lncRNAs发挥功能的模式复杂多样，其中lncRNAs可在转录和转录后水平调控与其坐标邻近的蛋白编码基因表达，从而发挥相应生物学作用[19]。邻近基因联合分析即顺式调控分析，是通过程序识别lncRNAs顺式调节区域，筛选差异表达的lncRNAs 上游和下游 300 kb范围内的所有邻近蛋白质编码基因。结果发现，共有450个差异表达lncRNAs可调节邻近799个基因表达，其中有110个为差异表达基因。部分差异表达lncRNAs与其邻近基因见表3。

2.5 lncRNAs与共表达基因联合分析此外，lncRNAs的功能还与其共同表达蛋白编码基因相关[19]。共表达基因联合分析，即通过分析lncRNAs与蛋白编码基因表达量的相关性，从而预测其靶基因。结果发现，143个差异表达lncRNAs与283个基因共同表达，其中最大正相关基因有142个，差异表达基因有139个；最大负相关基因有141个，差异表达基因有8个。部分差异表达lncRNAs与其共表达基因见表4。

参考文献

[1] BORRELLI J JR, OLSON SA, GODBOUT C, et al. Understanding Articular Cartilage Injury and Potential Treatments. J Orthop Trauma. 2019;33 Suppl 6:S6-S12.
[2] ANDERSSON JK, HAGERT E, BRITTBERG M. Cartilage Injuries and Posttraumatic Osteoarthritis in the Wrist: A Review. Cartilage. 2021; 13(1_suppl):156S-168S.
[3] ZHAO X, HU DA, WU D, et al. Applications of Biocompatible Scaffold Materials in Stem Cell-Based Cartilage Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 2021;9:603444.
[4] MENDE W, GÖTZL R, KUBO Y, et al. The Role of Adipose Stem Cells in Bone Regeneration and Bone Tissue Engineering. Cells. 2021;10(5):975.
[5] SHI YY, NACAMULI RP, SALIM A, et al. The osteogenic potential of adipose-derived mesenchymal cells is maintained with aging. Plast Reconstr Surg. 2005;116(6):1686-1696.
[6] PUISSANT B, BARREAU C, BOURIN P, et al. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. Br J Haematol. 2005;129(1):118-129.
[7] MAZINI L, ROCHETTE L, AMINE M, et al. Regenerative Capacity of Adipose Derived Stem Cells (ADSCs), Comparison with Mesenchymal Stem Cells (MSCs). Int J Mol Sci. 2019;20(10):2523.
[8] KOPP F, MENDELL JT. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 2018;172(3):393-407.
[9] RANSOHOFF JD, WEI Y, KHAVARI PA. The functions and unique features of long intergenic non-coding RNA. Nat Rev Mol Cell Biol. 2018;19(3): 143-157.
[10] SUN H, PENG G, NING X, et al. Emerging roles of long noncoding RNA in chondrogenesis, osteogenesis, and osteoarthritis. Am J Transl Res. 2019;11(1):16-30.
[11] HUYNH NP, GLOSS CC, LORENTZ J, et al. Long non-coding RNA GRASLND enhances chondrogenesis via suppression of the interferon type II signaling pathway. Elife. 2020;9:e49558.
[12] YANG Q, HAN Y, LIU P, et al. Long Noncoding RNA GAS5 Promotes Osteogenic Differentiation of Human Periodontal Ligament Stem Cells by Regulating GDF5 and p38/JNK Signaling Pathway. Front Pharmacol. 2020;11:701.
[13] XU Y, DUAN L, LIU S, et al. Long intergenic non-protein coding RNA 00707 regulates chondrocyte apoptosis and proliferation in osteoarthritis by serving as a sponge for microRNA-199-3p. Bioengineered. 2022;13(4):11137-11145.
[14] BUNNELL BA, FLAAT M, GAGLIARDI C, et al. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 2008;45(2):115-120.
[15] 李聪聪,姚楠,黄丹娥,等.人髌下脂肪垫干细胞的鉴定及成软骨分化[J].中国组织工程研究,2021,25(19):2976-2981.
[16] ZHANG Z, KANG Y, ZHANG Z, et al. Expression of microRNAs during chondrogenesis of human adipose-derived stem cells. Osteoarthritis Cartilage. 2012;20(12):1638-1646.
[17] ZHANG Z, HUANG G, MAO G, et al. Characterization of exosomal long non-coding RNAs in chondrogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Mol Cell Biochem. 2021;476(3):1411-1420.
[18] LI H, ZHAO X, WEN X, et al. Inhibition of miR-490-5p Promotes Human Adipose-Derived Stem Cells Chondrogenesis and Protects Chondrocytes via the PITPNM1/PI3K/AKT Axis. Front Cell Dev Biol. 2020;8:573221.
[19] STATELLO L, GUO CJ, CHEN LL, et al. Gene regulation by long non-coding RNAs and its biological functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021;22(2): 96-118.
[20] URLIĆ I, IVKOVIĆ A. Cell Sources for Cartilage Repair-Biological and Clinical Perspective. Cells. 2021;10(9):2496.
[21] PANG HL, ZHAO QQ, MA Y, et al. Long Noncoding RNA H19 Participates in the Regulation of Adipose-Derived Stem Cells Cartilage Differentiation. Stem Cells Int. 2019;2019:2139814.
[22] MICHIGAMI T. Current understanding on the molecular basis of chondrogenesis. Clin Pediatr Endocrinol. 2014;23(1):1-8.
[23] 彭旭,张晓梅,魏诗航,等.骨髓间充质干细胞向软骨及骨分化：Wnt5a/PCP信号通路作用的研究与进展[J].中国组织工程研究, 2016,20(51):7717-7723.
[24] 刘宽,吴兴. Hedgehog信号调控骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化：调控方式及其串话机制尚待研究[J].中国组织工程研究, 2014,18(37):6040-6045.
[25] ZHOU D, GAN L, PENG Y,et al. Epigenetic Regulation of Dental Pulp Stem Cell Fate. Stem Cells Int. 2020;2020:8876265.
[26] DYKES IM, EMANUELI C. Transcriptional and Post-transcriptional Gene Regulation by Long Non-coding RNA. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2017;15(3):177-186.
[27] WANG L, LI Z, LI Z, et al. Long noncoding RNAs expression signatures in chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2015;456(1):459-464.
[28] CAO Z, HUANG S, LI J, et al. Long noncoding RNA expression profiles in chondrogenic and hypertrophic differentiation of mouse mesenchymal stem cells. Funct Integr Genomics. 2017;17(6):739-749.
[29] SOMOZA RA, WELTER JF, CORREA D, et al. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells: challenges and unfulfilled expectations. Tissue Eng Part B Rev. 2014;20(6):596-608.
[30] SHIN H, LEE MN, CHOUNG JS, et al. Focal Adhesion Assembly Induces Phenotypic Changes and Dedifferentiation in Chondrocytes. J Cell Physiol. 2016;231(8):1822-1831.
[31] YU H, LIU Y, YANG X, et al. Strontium ranelate promotes chondrogenesis through inhibition of the Wnt/β-catenin pathway. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):296.
[32] MATTA C, MOBASHERI A. Regulation of chondrogenesis by protein kinase C: Emerging new roles in calcium signalling. Cell Signal. 2014; 26(5):979-1000.
[33] FISCHER J, KNOCH N, SIMS T, et al. Time-dependent contribution of BMP, FGF, IGF, and HH signaling to the proliferation of mesenchymal stroma cells during chondrogenesis. J Cell Physiol. 2018;233(11):8962-8970.
[34] KOVERMANN NJ, BASOLI V, DELLA BELLA E, et al. BMP2 and TGF-β Cooperate Differently during Synovial-Derived Stem-Cell Chondrogenesis in a Dexamethasone-Dependent Manner. Cells. 2019; 8(6):636.
[35] DUAN J, SHEN T, DONG H, et al. Association of the Expression Levels of Long-Chain Noncoding RNA TUG1 and Its Gene Polymorphisms with Knee Osteoarthritis. Genet Test Mol Biomarkers. 2021;25(2):102-110.
[36] TANG LP, DING JB, LIU ZH, et al. LncRNA TUG1 promotes osteoarthritis-induced degradation of chondrocyte extracellular matrix via miR-195/MMP-13 axis. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2018;22(24):8574-8581.
[37] HAN H, LIU L. Long noncoding RNA TUG1 regulates degradation of chondrocyte extracellular matrix via miR-320c/MMP-13 axis in osteoarthritis. Open Life Sci. 2021;16(1):384-394.
[38] LI Z, WANG J, YANG J. TUG1 knockdown promoted viability and inhibited apoptosis and cartilage ECM degradation in chondrocytes via the miR-17-5p/FUT1 pathway in osteoarthritis. Exp Ther Med. 2020;20(6):154.
[39] JIANG H, PANG H, WU P, et al. LncRNA SNHG5 promotes chondrocyte proliferation and inhibits apoptosis in osteoarthritis by regulating miR-10a-5p/H3F3B axis. Connect Tissue Res. 2021;62(6):605-614.
[40] SUN Y, KANG S, PEI S, et al. MiR93-5p inhibits chondrocyte apoptosis in osteoarthritis by targeting lncRNA CASC2. BMC Musculoskelet Disord. 2020;21(1):26.
[41] SHI C, ZHENG W, WANG J. lncRNA-CRNDE regulates BMSC chondrogenic differentiation and promotes cartilage repair in osteoarthritis through SIRT1/SOX9. Mol Cell Biochem. 2021;476(4):1881-1890.
[42] MAO G, KANG Y, LIN R, et al. Long Non-coding RNA HOTTIP Promotes CCL3 Expression and Induces Cartilage Degradation by Sponging miR-455-3p. Front Cell Dev Biol. 2019;7:161.
[43] FENG L, YANG ZM, LI YC, et al. Linc-ROR promotes mesenchymal stem cells chondrogenesis and cartilage formation via regulating SOX9 expression. Osteoarthritis Cartilage. 2021;29(4):568-578.
[44] CHENG W, HAO CY, ZHAO S, et al. SNHG16 promotes the progression of osteoarthritis through activating microRNA-93-5p/CCND1 axis. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2019;23(21):9222-9229.
[45] FAN H, DING L, YANG Y. lncRNA SNHG16 promotes the occurrence of osteoarthritis by sponging miR‑373‑3p. Mol Med Rep. 2021;23(2):117.
[46] ZHU J, YU W, WANG Y, et al. lncRNAs: function and mechanism in cartilage development, degeneration, and regeneration. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):344.
[47] MA C, WU L, SONG L, et al. The pro-inflammatory effect of NR4A3 in osteoarthritis. J Cell Mol Med. 2020;24(1):930-940.
[48] SONG J, KIM D, LEE CH, et al. MicroRNA-488 regulates zinc transporter SLC39A8/ZIP8 during pathogenesis of osteoarthritis. J Biomed Sci. 2013;20(1):31.
[49] KIM JH, JEON J, SHIN M, et al. Regulation of the catabolic cascade in osteoarthritis by the zinc-ZIP8-MTF1 axis. Cell. 2014;156(4):730-743.
[50] ELLMAN MB, YAN D, AHMADINIA K, et al. Fibroblast growth factor control of cartilage homeostasis. J Cell Biochem. 2013;114(4):735-742.
[51] VAN LENT PL, SPAN PN, SLOETJES AW, et al. Expression and localisation of the new metalloproteinase inhibitor RECK (reversion inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs) in inflamed synovial membranes of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2005;64(3): 368-374.
[52] KIMURA T, OKADA A, YATABE T, et al. RECK is up-regulated and involved in chondrocyte cloning in human osteoarthritic cartilage. Am J Pathol. 2010;176(6):2858-2867.

引言

关节软骨是一种无血管、神经分布的结缔组织，具有细胞类型单一、高度分化等组织学特点[1]。因此，由创伤、异常机械应力等原因导致的缺损往往难以通过软骨自身修复，而局灶性软骨缺损则可加速骨关节炎发生[2]。越来越多的研究表明，细胞移植和组织工程软骨是治疗软骨缺损的重要手段[3]。脂肪间充质干细胞是一种来源于脂肪组织的成体干细胞，具有自我更新、多向分化潜能和易于获取等特点，是组织工程常用的种子细胞之一[4]。来源于年轻供体的脂肪间充质干细胞具有更高的增殖率，随着供体年龄增长，脂肪干细胞仍能保持一定的分化能力[5]，同时脂肪间充质干细胞还保持着分化为中胚层细胞的潜力，其通常具有较低的免疫原
性[6]。另外，脂肪干细胞还具有易于分离、获取的特点，使得它在组织工程和再生医学领域的应用范围更大[7]。因此，脂肪间充质干细胞常被用作组织工程和再生医学领域的种子细胞[4]。脂肪间充质干细胞在特定培养条件以及转化生长因子β3刺激下可向软骨分化，研究证实脂肪间充质干细胞来源的软骨细胞也能分泌Ⅱ型胶原、糖胺聚糖等细胞外基质[4]。脂肪间充质干细胞成软骨分化过程受多种复杂因素调控，深入理解其调控网络将有助于突破软骨再生瓶颈。
长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的RNA分子，几乎不具有蛋白编码功能，其转录受聚合酶Ⅱ调控[8]。lncRNAs具有复杂的二级和高级结构，可与DNA、RNA和蛋白结合，作为重要调控因子参与细胞增殖、分化等多个生物学过程[9]。有研究证实，lncRNAs与间充质干细胞成软骨分化、成骨分化以及骨关节炎发生密切相关[10]。例如，HUYNH等[11]发现lncRNA GRASLND在间充质干细胞成软骨分化中表达升高，抑制GRASLND表达则会引起软骨样细胞外基质表达减少。深入研究发现，lncRNA GRASLND通过影响Ⅱ型干扰素信号通路，从而促进间充质干细胞成软骨分化。LncRNA GAS5在人牙周韧带干细胞成骨分化中存在差异表达，体外实验证实GAS5可通过GDF5和p38/JNK信号通路促进人牙周韧带干细胞成骨分化[12]。LINC00707 是一种表达于细胞质的基因间lncRNA，并在骨关节炎组织中表达升高；过表达LINC00707可促进骨关节炎软骨细胞凋亡、抑制骨关节炎细胞增殖[13]。然而，lncRNAs在脂肪间充质干细胞成软骨分化过程中的表达变化、作用及机制目前尚未被完全阐明。
该研究采用转录组测序技术，探讨脂肪间充质干细胞诱导成软骨分化前后lncRNAs和mRNAs表达谱的变化，筛选差异表达lncRNAs和mRNAs；利用GO和KEGG富集分析鉴定差异表达基因相关的生物学过程和信号通路；采用生物信息学分析预测差异表达lncRNAs邻近基因和共表达基因。该研究通过以上分析明确可能参与脂肪间充质干细胞成软骨分化调控的lncRNAs，以期为治疗骨关节炎软骨缺损提供一定的实验基础。

材料方法

1.1 设计体外细胞对照实验，组间对比主要采用独立样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2020年6月至2021年10月在贵州医科大学贵州省再生医学重点实验室完成。
1.3 材料胎牛血清、高糖型DMEM培养基、胰蛋白酶、青链霉素(Gibco公司，美国)；Trizol试剂、RNA提取试剂盒、QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN公司，德国)；标准阿利新蓝染色试剂盒(索莱宝公司，北京)；反转录试剂盒PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)、定量PCR试剂TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus)(宝日医生物技术有限公司，北京)；成软骨诱导分化基础培养液(Cyagen公司，美国)；Ⅰ型胶原酶(Sigma公司，美国)等。
1.4 实验方法
1.4.1 原代脂肪间充质干细胞分离及培养该研究获得贵州医科大学附属医院伦理委员会批准，批准号为【2020伦审第(016)号】。经患者知情同意并签署知情同意书，获取6例行人工膝关节置换术患者的髌下脂肪垫标本，按文献报道方法采用0.075%Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织获取脂肪间充质干细胞[14-15]。将分离的脂肪间充质干细胞接种到高糖型DMEM培养基的75 cm2培养瓶中，置于37 ℃、100%湿度、体积分数为5% CO2细胞培养箱中培养。每隔2 d 更换1次培养液，当贴壁生长≥80%融合时，进行细胞传代培养。
1.4.2 脂肪间充质干细胞成软骨分化诱导脂肪间充质干细胞成软骨分化按文献报道的方法进行诱导[16-18]。每200 mL完全成软骨诱导培养液包含194 mL高糖型DMEM培养基、2 mL 转化生长因子β3(10 mmol/L)、2 mL ITS+Supplement(10 mmol/L)、600 μL抗坏血酸(3 mmol/L)、20 μL地塞米松(100 nmol/L)、200 μL丙酮酸钠(1 mmol/L)和200 μL脯氨酸(1 mmol/L)。选择第3代脂肪间充质干细胞，制成细胞浓度为2×1010 L-1的浓稠悬液；将细胞悬液滴入24孔板(每组3个复孔)的中心位置，每孔12.5 μL，置于细胞培养箱中，记录时间并等待90 min；90 min后取出24孔板，可见细胞紧密地集合成团块状，每孔缓慢加入完全成软骨诱导分化培养液500 μL，避免冲散细胞团，加入完毕后将24孔板放回细胞培养箱；隔日更换细胞培养液，诱导14 d后用于后续实验。未诱导分化脂肪间充质干细胞立即加入Trizol试剂用于后续提取总RNA。
1.4.3 细胞微球固定及阿利新蓝染色将成软骨诱导分化3，14 d的细胞微球转入1.5 mL离心管中，并用体积分数为4%甲醛溶液室温下固定24 h，用乙醇梯度脱水、二甲苯透明后行组织冰冻切片，然后根据标准阿利新蓝染色试剂盒步骤行组织切片阿利新蓝染色，显微镜下观察软骨基质形成情况。
1.4.4 总RNA提取及鉴定成软骨诱导分化0 d及14 d后，样本中加入1 mL Trizol试剂，按RNA试剂盒说明书步骤抽提总RNA。使用1%琼脂糖凝胶电泳法测定RNA完整性，使用Nanodrop 2000超微量分光光度计测定样品RNA浓度，根据A260/A280 比值鉴定RNA纯度。A260/A280 均介于1.8-2.0之间的RNA样本可用于后续转录组测序以及实时荧光定量PCR实验。
1.4.5 实时荧光定量PCR 根据TAKARA反转录试剂盒说明书步骤将RNA反转录为cDNA。将得到的cDNA依据TAKARA定量PCR试剂盒配制检测体系，使用CFX96 PCR仪(Bio-Rad公司，美国)进行PCR反应。该研究分别挑选表达差异倍数位于前10位的lncRNAs和mRNAs各2个用于验证。涉及的qRT-PCR引物序列分别为：MIR4697HG(Forward，5’-GAA GTG TGT GCA GGC TTG-3’，Reverse，5’-GGA AAA GGC TCT GTC GTG GA-3’)、TUG1(Forward，5’-GAC AGA GGC GAC AGG AAC GAC G-3’；Reverse，5’-CAC CAT GCA ACA TCG AAC CG-3’)、FN1(Forward，5’-AAA TGG CCA GAT GAT GAG C-3’，Reverse，5’-TAA CAC GTT GCC TCA TGA-3’)、 HBS1(Forward，5’-GCT CCA GTC CTA CCA GTG TC-3’，Reverse，5’-TCA GTC ACT TGC GGA TGC T-3’)、GAPDH(Forward，5’-ACC CAG AAG ACT GTG GAT GG-3’，Reverse，5’-GAG GCA GGG ATG ATG TTC TG-3’)，所有引物均由上海生工合成。结果使用2-ΔΔCt相对定量法进行分析。
1.4.6 转录组测序及生物信息学分析该研究转录组测序由广州赛哲生物科技股份有限公司(http://www.sagene.com.cn)协助完成。首先提取6份样本包括成软骨分化未诱导组和诱导组各3份的总RNA，去除核糖体RNA，并将剩余RNA随机打断成长度为200-500核苷酸的短片段，以短片段RNA为模板，用六碱基随机引物合成cDNA第一链，加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二链，依次经纯化、EB缓冲液洗脱、末端修复、加碱基A以及连接测序接头，随后利用UNG(Uracil-N-Glycosylase)酶降解第二条链，然后利用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增；最后建好的测序文库用Illumina HiSeqTM 2500进行测序。
通过 FASTQC(v0.11.5)软件预处理原始数据，使用TopHat2(v2.1.1)软件将每个样品测序得到的reads分别比对至基因组，再利用 cufflinks(v2.2.1)软件组装基因，获得基因在不同组的表达水平，最后使用edgeR(v3.14.0)软件进行差异表达分析。LncRNAs和基因表达的差异使用P 值和差异倍数变化(fold change，FC)的对数表示，筛选标准为|log2FC| > 1且P值及错误发现率(false discovery rate， FDR)均 < 0.05，并对上述获得的差异表达基因行基因本体论(Geneontology，GO)功能分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of genes and Genome，KEGG)通路分析、邻近基因分析和共表达基因分析。
1.5 主要观察指标 ①采用阿利新蓝染色观察成软骨诱导分化3，14 d软骨基质形成情况；②采用转录组测序分析成软骨分化0，14 d差异表达lncRNAs和mRNAs，并利用生物信息学初步分析lncRNAs的潜在功能；③各自挑选2个lncRNAs和mRNAs，采用qRT-PCR验证测序结果可靠性。
1.6 统计学分析该研究采用GraphPad Prism 8.4软件对数据进行统计分析。qRT-PCR数据符合正态分布，以x±s描述，组间比较用独立样本 t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过贵州医科大学统计学专家审核。

讨论

关节软骨缺损是骨关节炎的主要病理特征表现，其一旦损伤则很难通过软骨自身修复愈合。当前，基于间充质干细胞的细胞移植和组织工程软骨已逐渐成为修复关节软骨缺损的潜在治疗策略[20]。lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA分子，现有证实lncRNAs在脂肪间充质干细胞成软骨分化、软骨细胞特性维持等方面扮演着重要角
色[10，21]。深入探讨lncRNAs调控脂肪间充质干细胞定向成软骨分化分子机制，将为骨关节炎相关软骨缺损治疗提供新的思路。该研究分析了成软骨分化过程中lncRNAs表达谱，同时利用生物学信息分析鉴定了差异表达lncRNAs的潜在功能和所涉及的信号通路。
间充质干细胞定向诱导成软骨分化是一个复杂的调控过程，众多细胞因子、生长因子以及转录因子等已被证实在成软骨分化中扮演着重要角色[22]。间充质干细胞成软骨分化过程中还伴随着诸多信号通路的改变，包括Wnt、成纤维细胞生长因子以及印度刺猬蛋白信号通路等[23-24]。表观遗传调控是基因表达调控的重要作用方式，越来越多文献证实表观遗传调控参与了间充质干细胞成软骨分化进程[25]。lncRNAs是一类重要的非编码RNA，其在表观遗传调控中发挥重要作用[26]。目前已有报道证实lncRNAs在间充质干细胞成软骨分化过程中发生了差异表达。比如，Wang等[27]率先使用微阵列芯片技术对比了人骨髓间充质干细胞成软骨分化前后lncRNA表达谱变化，结果表明成软骨分化14 d后共有2 166 条上调、1 472条下调。CAO等[28]利用小鼠胚胎干细胞系C3H10T1/2诱导成软骨分化14 d后发现，相比于未分化细胞共有3 614条lncRNAs发生差异表达。上述结果均表明，lncRNAs可能参与间充质干细胞成软骨分化调控。脂肪间充质干细胞也是一种成体多能干细胞，在特定条件下同样可诱导分化为软骨细胞。ZHANG等[17]分析了脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化21 d外泌体与未诱导分化外泌体之间lncRNAs的表达谱变化，结果表明共有23条上调、163条下调，提示差异表达的lncRNAs可能以外泌体的作用方式调控脂肪间充质干细胞成软骨分化。目前，脂肪间充质干细胞成软骨分化过程中其本身lncRNAs表达谱的变化报道较少。该研究使用完全成软骨诱导分化培养液诱导脂肪间充质干细胞向软骨分化，阿利新蓝染色表明成软骨诱导分化14 d后有大量软骨细胞外基质形成，提示脂肪间充质干细胞已成功向软骨分化。同时，利用转录组测序分析了诱导分化14 d与0 d之间lncRNAs表达谱的变化差异，结果表明，脂肪间充质干细胞成软骨分化14 d较0 d有816条lncRNAs差异表达，同时伴随着有5 138条mRNAs差异表达。以上结果提示，脂肪间充质干细胞成软骨分化过程中lncRNAs表达谱发生了明显改变。
该研究进一步通过GO功能富集分析发现，差异表达基因主要富集于细胞外基质调控、细胞黏附、血管生成、细胞增殖调控等生物学过程，因此与脂肪间充质干细胞的增殖和分化调控密切相关[29]。KEGG通路富集分析发现，差异表达基因主要涉及的信号通路包括黏附斑激酶信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节、细胞因子-细胞因子受体、胰岛素信号通路、Wnt信号通路、PI3K-Akt信号通路和转化生长因子β信号通路等。这些信号通路如黏附斑激酶信号通路[30]、PI3K-Akt信号通路[18]、Wnt信号通路[31]、钙信号通路[32]、胰岛素信号通路[33]、转化生长因子β信号通路均在成软骨分化调控中扮演着重要角色[34]。因此，差异表达lncRNAs很可能通过参与上述生物学过程和信号通路，从而调控脂肪间充质干细胞成软骨分化。
该研究鉴定的部分lncRNAs已被证实可参与成软骨分化调控和骨关节炎发生等过程。据报道，lncRNA TUG1以及其单核苷酸多态性特征与骨关节炎严重程度密切相关[35]。深入研究发现，TUG1可以“海绵”效应吸附miR-17-5p、miR-195和miR-320c，竞争性调控下游靶基因FUT1和MMP-13，从而调控软骨细胞凋亡、细胞外基质降解[36-38]。JIANG等[39]研究表明，lncRNA SNHG5在骨关节炎软骨组织中表达降低，进一步研究证实SNHG5可通过调控miR-10a-5p/H3F3B信号轴抑制软骨细胞凋亡。骨关节炎软骨样本中lncRNA CASC2表达升高，过表达lncRNA CASC2能促进脂多糖介导的软骨细胞凋亡[40]。SHI等[41]研究发现，骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中lncRNA CRNDE、SIRT1以及软骨标志物逐渐升高，干扰CRNDE表达则能降低SIRT1稳定性、抑制SOX9表达。深入研究表明，CRNDE 通过 SIRT1/SOX9 信号轴调控骨髓间充质干细胞成软骨分化，从而促进骨关节炎软骨缺损修复。以上结果提示，差异表达lncRNAs不仅可能参与脂肪间充质干细胞成软骨分化调控，还与骨关节炎发生、发展密切相关。
调节邻近蛋白编码基因表达是lncRNAs发挥作用的主要功能之一[19]。该研究发现450个差异表达lncRNAs可调节邻近110个差异基因的表达。例如，编码lncRNA SNHG16基因位于第17号染色体，在成软骨分化过程中lncRNA SNHG16表达下降，而位于编码lncRNA SNHG16基因上游30 kb的基因ST6GALNAC2亦在成软骨分化过程中表达降低，因此，SNHG16很可能通过转录水平调节ST6GALNAC2基因表达，从而参与成软骨分化调控。有研究表明，与成软骨分化相关的lncRNAs同样也能调控骨关节炎发生、发展[41-43]。据报道，SNHG16在人关节软骨组织中表达降低，敲低SNHG16可抑制软骨细胞活性、增殖和细胞周期进程，促进软骨细胞凋亡。进一步研究证实，SNHG16可通过影响miR-93-5p、miR‑373‑3p表达，促进骨关节炎疾病进程[44-45]。以上结果提示，lncRNA SNHG16不仅可能参与成软骨分化调控，还可能是治疗骨关节炎的潜在靶点。
lncRNAs另一种重要作用机制是与其共表达的编码基因功能相关，后者作用决定了lncRNAs的功能[8，46]。该研究结果表明，有139个基因和8个基因分别与143个差异表达lncRNAs存在正相关和负相关关系。进一步分析发现，与最大正相关基因和最大负相关基因共同相关的lncRNAs有6个，同时筛选发现了11个基因与这6个lncRNAs共表达。这些基因中已有部分基因被证实在成软骨分化和骨关节炎进程发挥着重要作用。比如，NR4A3是核受体亚家族 4 成员，是细胞功能和炎症的重要调节因子，软骨细胞过表达NR4A3能加速细胞外基质降解、促进细胞炎症反应[47]。SLC39A8是一种锌离子转运体，其在骨关节炎软骨组织上表达升高。体内实验证实，小鼠软骨组织中SLC39A8表达升高可促进软骨基质降解、软骨缺损，而抑制其表达可减少骨关节炎动物关节软骨细胞外基质降解，从而减缓骨关节炎疾病进程[48-49]。FGF-2是成纤维细胞生长因子家族的成员之一，目前研究证实FGF-2 选择性激活FGF受体1，通过上调基质降解酶表达、抑制细胞外基质生成，从而影响软骨细胞稳态维持[50]。RECK被证实是一种金属基质蛋白酶抑制剂，其在骨关节炎患者滑膜组织中低表达[51]。KIMURA等[52]发现，RECK 在人骨关节炎软骨组织中表达升高，可抑制软骨细胞迁移、促进增殖，从而促进软骨细胞集落形成。lncRNAs功能与共表达基因功能密切相关，深入探讨这些共表达基因在成软骨分化、骨关节炎发生中的作用，将有助于更全面地理解lncRNAs在软骨形成、稳态维持中的作用及具体机制。
该研究存在一定的局限性。首先，尽管该研究获得了大量与成软骨分化相关的lncRNAs和基因，但其主要基于转录组测序数据和生物信息学分析，lncRNAs在脂肪间充质干细胞成软骨分化中的调控作用以及与靶基因的互作关系还需实验进一步证实；再者，该研究所获数据来自于小样本测序资料，因此局限了其向临床转化应用。课题组接下来将筛选和深入探讨该研究所获lncRNAs，以期揭示它们在软骨形成和退变中的分子功能和机制。
综上所述，该研究探讨了脂肪间充质干细胞诱导成软骨分化过程中lncRNAs表达谱的变化，这些差异表达lncRNAs可能参与了脂肪间充质干细胞成软骨分化调控，进一步生物信息学分析发现，部分lncRNAs可通过调控邻近基因和共表达基因表达，从而在软骨发育、稳态和退变中发挥重要作用。由于lncRNAs具有较高的组织、细胞特异性，深入理解这些差异基因的功能和分子机制可为骨关节炎软骨缺损提供潜在的治疗靶点。

人脂肪间充质干细胞成软骨分化过程中差异表达长链非编码RNA鉴定及功能

Identification and function of differentially expressed long noncoding RNAs in the chondrogenesis of human adipose-derived mesenchymal stem cells

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[1]	李志超, 谭国庆, 苏辉, 徐展望, 薛海鹏. 非编码RNAs作为潜在治疗靶点在脊髓损伤中的调控效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 758-764.
[2]	邵子晨, 李华南, 顾兵, 章晓云, 孙伟康, 刘永钱, 甘斌. 痛风过程中微小RNA、长链非编码RNA和环状RNA介导降尿酸、抗炎及调控骨代谢的协同调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 765-771.
[3]	胡新明, 乔艳华, 王肖帆, 李林玉, 赵冰. 长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1参与盆腔器官脱垂的机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 669-675.
[4]	文虹杰, 陈仲, 杨华刚, 徐永清. 骨髓炎状态下成骨诱导大鼠骨髓间充质干细胞转录组的测序分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(15): 2333-2338.
[5]	蔡波, 李晓晓, 张凌寒, 刘彦星, 毛跟红. CRISPR/Cas9技术联合脂质体转染子宫内膜癌细胞单质粒基因敲除方法首次编辑免疫相关基因HLA-DRA#br#[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(15): 2356-2362.
[6]	马雯晴, 张惠荣, 刘辉, 董丽丽, 杨眷娣. 敲低NIPBL基因调控小鼠骨髓间充质干细胞向软骨的分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(10): 1477-1483.
[7]	黄彬, 郑金旭, 张军. 非编码RNA与特发性肺纤维化进程中的干细胞异常[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(1): 130-137.
[8]	高俞锦, 彭双麟, 马治超, 陆诗, 曹花月, 王浪, 肖金刚. 糖尿病骨质疏松症模型小鼠脂肪干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 999-1004.
[9]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[10]	亢腾, 蓝奉军, 覃浩, 刘钢. 长链非编码RNA与骨质疏松[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(32): 5242-5247.
[11]	王慧, 王翠菊, 郑钧元, 王华, 郭宝娟, 陈培, 杨旭芳. 改良法原代培养人脂肪间充质干细胞及其鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(31): 5002-5007.
[12]	林波, 陈鑫宇, 金秋, 朱芝漫, 赵文慧. 脂肪间充质干细胞来源外泌体miR-126-3p对人脐静脉内皮细胞糖脂毒性的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(30): 4773-4779.
[13]	王丹丹, 禹亚彬, 刘世奇, 严雨楼, 张建淮. 人脐带间充质干细胞向肝细胞分化过程中长链非编码RNA核富集转录本1的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(30): 4847-4851.
[14]	高子茏, 李婷, 吕政, 沈骅睿. 补骨脂素联合转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(30): 4884-4888.
[15]	李瑞语, 史旭, 陈奇, 左华, 李克振. 转化生长因子β3介导不同来源的间充质干细胞成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(30): 4834-4839.