2.1   免疫细胞和功能浸润程度   使用ssGSEA分析了GSE63359数据集中的29个免疫细胞及功能免疫程度(图1)。得到的免疫细胞相关基因集有活化树状突细胞、B细胞、CD8+ T细胞、树状突细胞、未成熟树状突细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、浆细胞样树状突细胞、辅助性T细胞、滤泡辅助性T细胞、Th1细胞、Th2 细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、调节性T细胞；免疫功能则包括抗原呈递共抑制、抗原呈递共刺激、趋化因子C-C-基序受体、检查点、细胞活化因子、人类白细胞抗原、炎症促进、主要组织相容性复合体Ⅰ类分子、低度炎症、T细胞共抑制、T细胞共刺激、Ⅰ型干扰素反应、Ⅱ型干扰素反应。



2.2   免疫浸润相关性及差异性分析   免疫细胞相关性热图展示了树状突细胞和肥大细胞呈极强的正相关性(r=0.87)，肿瘤浸润淋巴细胞和调节性T细胞呈极强的正相关性(r=0.84)，中性粒细胞和辅助性T细胞呈极强的正相关性(r=0.81)，树状突细胞和滤泡辅助性T细胞呈极强的正相关性(r=0.81)，中性粒细胞和调节性T细胞呈强的正相关性(r=0.79)，中性粒细胞和肿瘤浸润淋巴细胞呈强正相关性(r=0.75)，辅助性T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞呈强正相关性(r=0.74)，肥大细胞和滤泡辅助性T细胞呈强正相关性(r=0.73)；肥大细胞和肿瘤浸润淋巴细胞呈极强的负相关性(r=-0.81)，肥大细胞和调节性T细胞呈强负相关性(r=-0.79)，滤泡辅助性T细胞和调节性T细胞呈强负相关性(r=-0.72)，见图2A。免疫功能相关性热图展示了低度炎症和Ⅰ型干扰素反应呈极强的正相关性(r=0.93)，炎症促进和主要组织相容性复合体Ⅰ类分子呈强正相关性(r=0.77)，抗原呈递共抑制和趋化因子C-C-基序受体呈强正相关性(r=0.7)，见图2B。

通过箱图对骨关节炎患者与健康人群的外周血进行组间免疫浸润细胞和功能差异分析，见图3，P < 0.05则代表差异有显著性意义。结果显示，在骨关节炎组中树状突细胞(P < 0.001)、未成熟树状突细胞(0.01 < P < 0.05)、巨噬细胞(0.01 < P < 0.05)、肥大细胞(0.001 < P < 0.01)、中性粒细胞(0.001 < P < 0.01)、抗原呈递共抑制(0.001 < P < 0.01)和趋化因子C-C-基序受体(P < 0.001)显著增加，而B细胞(0.001 < P < 0.01)、Th2细胞(0.001 < P < 0.01)和T细胞共刺激(0.01 < P < 0.05)则显著减少。



2.3   铜死亡基因与免疫浸润的相关性分析   基于ssGSEA及铜死亡基因表达矩阵2个结果文件，此次研究得到铜死亡基因与免疫细胞及功能的关联性评分图，见图4，结果显示，SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、LIAS、FDX1、DLST、DLD、DLAT和DBT基因与免疫浸润中的1个或多个细胞及功能具有显著相关性。



2.4   风险模型构建与验证   将上述结果中的10个铜死亡基因(与免疫浸润具有显著相关性)纳入风险研究，并基于二分类逻辑回归分析，构建列线图模型，以计算总评分来分析骨关节炎患者的风险概率，结果显示，铜死亡基因PDHB可能是骨关节炎的风险因子(图5)。受试者工作特征曲线图(AUC=0.784)显示列线图模型对骨关节炎患者风险因素的评估具有较好的预测能力(图6A)。另外，C指数校准曲线图显示，列线图模型结果与实际结果一致性较高(图6B)。







2.5   功能相关性分析及药物预测   将筛选到的10个铜死亡基因上传至仙桃学术平台，进行富集分析。基因本体富集分析由生物学过程、细胞组成和分子生物学功能三部分组成，用于分析骨关节炎的功能富集。结果显示，铜死亡基因主要与丙酮酸乙酰辅酶A生物合成过程、丙酮酸代谢过程、乙酰辅酶A生物合成过程、一元羧酸代谢过程、细胞氨基酸分解代谢过程等生物学过程以及氧化还原酶活性(作用于供体的醛或氧代基团，二硫化物作为受体)、酰基转移酶活性(转移除氨基酰基以外的基团)、氧化还原酶活性[作用于供体的硫基团，NAD(P)作为受体]、硫转移酶活性、2铁和2硫簇结合等分子生物学功能密切相关，其过程涉及线粒体基质、细胞内细胞器腔、氧代戊二酸脱氢酶复合物、线粒体α-酮戊二酸脱氢酶复合物等细胞组分(图7)。KEGG结果显示，铜死亡基因主要富集在三羧酸循环循环、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、丙酸代谢、色氨酸代谢相关信号通路上(图7)。

另外，此次研究还利用Coremine Medical数据库预测介导骨关节炎铜死亡相关基因的潜在中药，以P < 0.05作为筛选标准，共得到27味中药，具体情况见表2；此外，因PDHB(此次研究的骨关节炎风险因子)未能搜索到相关中药，故此次研究进一步通过Coremine Medical数据库预测其中药活性成分，结果显示，红景天苷可能是介导PDHB调控骨关节炎免疫浸润的潜在中药活性成分，总的来说，共预测到27味中药和1种中药活性成分(表2)。



2.6   骨关节炎铜死亡相关基因miRNA-mRNA网络构建   此次研究利用FunRich软件对铜死亡相关基因的上游miRNA进行预测，共得到包括has-miR-7a-5p、has-miR-7e-5p、has-miR-96-5p在内的29个miRNA，将二者间的作用关系输入到仙桃学术，从而对miRNA-mRNA调控网络进行可视化处理，见图8。

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骨关节炎是一种以关节破坏、骨质增生和关节软骨退行性病变为特征的慢性疾病[1]。一项美国调查结果表明，社区成人中骨关节炎的发病率可达10.4%[2]。而目前骨关节炎的发病机制尚不清楚，根据相关研究表明，骨关节炎是多种因素共同作用的结果[3-5]。随着现代医学的不断发展，人们发现免疫系统在骨关节炎的发展过程中起着十分重要的作用，免疫细胞浸润介导了骨关节炎的自身免疫应答，诱导趋化因子、促炎细胞因子以及蛋白酶分泌，进而扰乱免疫平衡来加速软骨侵蚀[6-9]。除此之外，宿主免疫系统的反应也是生物材料充分整合所需要考虑的一个问题，针对机体的免疫反应制定相应的生物材料设计方案，则是解决该问题的关键所在。例如，LOHMANN等[10]成功研发了一种基于糖胺聚糖的水凝胶，这种水凝胶能够通过强静电相互作用有效清除促炎因子，以此来减少单核细胞和多核中性粒细胞的迁移和浸润。因此，针对骨关节炎免疫浸润的发病机制进行探索，可为减轻生物材料植入后机体炎症反应和防止患者骨关节炎病情进一步恶化提供一些新的思路。

众所周知，铜作为机体必需酶的辅助因子，在人类生命活动中发挥着重要作用[11]。正常细胞内铜的浓度非常低，其主要通过跨浓度梯度的动态平衡机制来防止有害的胞内游离铜积累，从而维持细胞的铜稳态[12-13]。而目前最新的一项研究表明，不同于以往已知的细胞程序性死亡(如铁死亡、凋亡等)，铜死亡依赖于线粒体呼吸。在这个过程中，铜与三羧酸循环的脂化组分直接结合，使得脂酰化蛋白聚集，铁-硫簇蛋白丢失，导致蛋白毒性应激致细胞死亡[14]。而铜稳态在免疫浸润方面的重要性，也在近期的一些相关性研究中有所体现[15-16]。TAN等[15]的研究发现，巨噬细胞上的铜螯合可消除赖氨酰氧化酶样 4介导的程序性死亡分子配体1呈递，从而抑制细胞的免疫逃逸。CHOI等[16]的研究则表明，氯碘羟喹(常见的铜螯合剂)可有效减少致脑炎免疫细胞(CD4、CD8等)的浸润。

由此可见，阐明铜死亡在免疫浸润方面的作用机制具有十分重要的研究意义。然而，目前尚未有铜死亡介导免疫浸润从而影响骨关节炎病程发展的相关性研究。基于此，此次研究首次通过结合骨关节炎芯片数据和铜死亡相关基因来对骨关节炎中铜死亡介导免疫浸润的具体机制进行阐述。作者采用GEO数据库(具体网址见表1)的GSE63359数据集进行免疫细胞和功能相关性及差异性分析，同时结合TSVETKOV等[14]研究提供的13个铜死亡基因，分析它们与免疫细胞及功能的相关性，并构建风险模型，最后基于上述所得到的骨关节炎相关铜死亡基因进行基因本体、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析、中药以及miRNA预测，从而为骨关节炎中铜死亡的调控机制研究提供一些理论支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   基因数据来源及预处理   为了获取骨关节炎的相关基因芯片数据，此次研究以“Osteoarthritis”为检索词，通过GEO数据库进行搜索和筛选。

纳入标准：①通过阵列或高通量测序的mRNA表达谱；②数据集中组织样本需来自于人体，且包含正常对照组和骨关节炎患者组；③健康组和骨关节炎组的样本量总计需70例及以上。

基于此，作者检索到1个符合条件的数据集GSE63359，共有72个样本，其中包含46个骨关节炎患者和26个健康人的样本，数据样本来自于人体外周血。下载GSE63359数据集的原始和系列矩阵文件后，利用仙桃学术平台(具体网址见表1)将探针表达矩阵转换为基因表达矩阵。铜死亡基因则来源于TSVETKOV团队近期的一项报道[14]，分别为SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、FDX1、DLD、DLST、DBT、LIAS、DLAT、GCSH、ATP7A和ATP7B，结合标准化后基因表达矩阵得到铜死亡相关基因表达矩阵文件。该研究方案的实施符合《赫尔辛基宣言》和广西中医药大学附属瑞康医院对研究的相关伦理要求。
1.2   浸润免疫细胞和功能的提取和量化   为了对转化后的基因表达矩阵进行浸润免疫细胞和功能的提取和量化，在MsigDB数据库(具体网址见表1)中输入“IMMUNITY”关键词，搜索相应gmt文件。接着通过“GSVA”R包对转化后的表达矩阵进行单样本基因集富集分析(single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA)评分，ssGSEA是一种免疫浸润分析的工具，其中共包含29项免疫评分，从而可估算每个样本的免疫浸润程度，并通过“pheatmap”软件包绘制热点图。
1.3   免疫细胞之间和免疫功能之间相关性及差异性分析   为了分析免疫细胞之间以及免疫功能之间的相关性，基于ssGSEA表达矩阵结果，通过R语言中的“corrplo”软件包对其进行相关性分析，并绘制热图；另外，为了比较免疫细胞及功能在骨关节炎组和对照组中的差异性，将样本分组情况和ssGSEA表达矩阵结果进行整合，通过“ggpubr”R语言软件包进行秩和检验，并绘制箱图。
1.4   铜死亡相关基因与免疫浸润相关性分析   为了分析铜死亡基因在免疫细胞及功能的相关性情况，采用“psych”R语言软件包对ssGSEA和铜死亡基因表达矩阵2个结果文件进行分析，并构建相关性热图。
1.5   风险模型构建与验证   为了进一步验证铜死亡基因和免疫浸润相关性模型结果，将铜死亡基因表达矩阵和样本分组情况作为输入文件，构建逻辑回归风险模型，计算中位值，大于中位值则为高表达，反之则为低表达。通过“rms”R语言软件包，构建了nomogram风险预测图，从而计算出每个铜死亡基因的风险得分，并通过校准曲线和受试者工作特征曲线进行验证，以衡量nomogram模型的识别能力。
1.6   功能相关性分析及药物   将筛选得到的铜死亡相关基因输入Enrichr网站(具体网址见表1)，进行基因本体、KEGG富集分析。随后，将富集分析的文本结果作为输入文件，运用仙桃学术平台对结果进行可视化。另外，通过Coremine Medical数据库(具体网址见表1)预测骨关节炎铜死亡相关基因的潜在治疗中药，以P < 0.05作为筛选标准。文章统计学方法已经广西中医药大学附属瑞康医院和桂林市中医医院生物统计学专家审核。
1.7   铜死亡相关基因miRNA预测   FunRich软件被用于蛋白基因功能富集和相互作用网络分析。为进一步了解铜死亡相关基因的表达机制，此次研究利用FunRich软件预测其上游的miRNA，最后将miRNA-mRNA关系输入到仙桃学术平台，对该调控网络进行可视化处理。

铜死亡是近期新发现的一种细胞死亡形式，其特征是细胞内游离铜积累，蛋白质脂化导致细胞毒性应激，从而诱导细胞死亡[14]。然而目前尚未有铜死亡在骨关节炎中的相关机制研究。基于此，此次研究通过GEO数据库下载相关芯片，并对其免疫浸润相关性和差异性进行分析，然后将结果与铜死亡基因进行整合，并构建风险模型，最终筛选出10个与骨关节炎免疫浸润相关的铜死亡基因，包括SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、LIAS、DLD、FDX1、DLST、DLAT、DBT，其中风险模型结果显示，铜死亡基因PDHB可能是骨关节炎的风险因子。

PDHB和PDHA1是丙酮酸脱氢酶复合体的2种E1亚型，主要位于细胞的线粒体中，可将葡萄糖衍生的丙酮酸催化为乙酰辅酶A[17-19]，乙酰辅酶A则通过调控组蛋白乙酰化来促进炎症细胞因子的表达[20]。并且，一项骨关节炎相关的动物实验也显示，过多积累的乙酰辅酶A，在基质金属蛋白酶的刺激下，会导致小鼠出现严重的软骨降解和软骨细胞凋亡[21]。除此之外，丙酮酸脱氢酶复合体还是三羧酸循环循环中必不可少的一部分[22]。在它催化下衍生的乙酰辅酶A与草酰乙酸结合生成柠檬酸，后者则加入到三羧酸循环循环当中[23-24]。最近的一项研究表明，糖皮质激素可通过促进三羧酸循环循环，从而调节巨噬细胞(免疫细胞)炎症激活和抗炎极化[25]。除此之外，柠檬酸还可转化为衣康脂酸[26-27]。衣康脂酸是一种抗炎代谢物，可抑制琥珀酸脱氢酶介导的琥珀酸氧化[27-28]，并激活抗炎转录因子[29]。由此可见，药物靶向调控三羧酸循环循环和乙酰辅酶A的生成，尤其是调控PDHB(此次研究的骨关节炎风险因子)的生物学活动，可能是新的一种抗骨关节炎策略。 

SLC31A1被认为是还原Cu+的高亲和力转运蛋白[30]。既往的一项研究显示，哺乳动物免疫系统在与微生物病原体抗争时，铜离子发挥着重要作用，他们发现在细菌感染后，机体内巨噬细胞上调SLC31A1，并通过ATP7A消除胞内的积累铜[31]。LIPT1、LIAS和DLD是编码线粒体硫辛酸途径的3个重要基因[14]。ABDUL等[32]的研究表明，使用硫辛酸激动剂进行慢性治疗时，硫辛酸可通过调节免疫系统减少肥胖诱导的机体炎症。另外，线粒体脂肪酸的合成与LIPT1、LIAS密不可分[33]。一项研究表明，取自骨关节炎患者的成骨细胞在游离脂肪酸的诱导下，会分泌更多的促炎细胞因子，而相关通路的信号分子表达却未有改变，这表明游离脂肪酸参加软骨下骨损伤可能更多依赖于炎症反应和免疫系统，而非相关信号通路[34]。FDX1编码一种小的铁硫蛋白，参与线粒体细胞色素的减少和各种类固醇激素的合成[35]。而在TSVETKOV等[14]的研究当中，FDX1是铜死亡的关节调控因子，它可将Cu2+还原为更具有毒性的Cu+，并且它同时还是蛋白质脂酰化的上游调节因子。近期的一项肺癌研究显示，FDX1的敲除可改善线粒体代谢功能障碍，从而减轻机体的炎症反应[36]。DLST、DLAT是编码线粒体蛋白质脂酰化的2个重要基因[14]。UDUMULA等[37]的研究表明，DLST的抑制降低了髓样细胞的氧化磷酸化和免疫抑制标志物的表达，从而调节免疫微环境。COLLIOU等[38]则通过相关研究发现，DLAT基因的表达可显著增加肠道Th17细胞，从而预防相关炎症疾病。DBT调节着支链氨基酸的降解，是线粒体多酶支链α-酮酸脱氢酶复合体的转酰基酶组分[39]。AHN等[39]研究表明，在低氧状态下，过氧化物还蛋白V与DBT结合，可调控细胞的氧化应激、线粒体转运等生物学活动。综上所述，尽管目前铜死亡相关基因在骨关节炎免疫调控方面的机制研究较少，但根据以往的研究和此次研究结果可以推测，铜死亡基因可能在骨关节炎免疫浸润方面发挥着重要作用，而如何通过调节免疫细胞铜稳态来防治骨关节炎，则需要开展进一步深入研究。

另外，结合免疫浸润差异性分析结果和铜死亡免疫浸润相关性结果，不难发现，树状突细胞、肥大细胞、抗原呈递共抑制以及趋化因子C-C-基序受体可能在铜死亡基因调控骨关节炎中扮演着重要作用。树状突细胞是一群抗原提呈细胞，分泌与慢性炎症性疾病相关的免疫介质、细胞因子和趋化因子[40]。GUO等[41]研究表明，寡脱氧核苷酸诱导的树状突细胞通过增加调节性T细胞和白细胞介素10的表达水平，从而限制骨关节炎小鼠模型关节的炎症反应。肥大细胞是天然免疫系统的快速反应者，对外源性病原体和内源性危险信号可做出快速反应[42]。而近期的一项临床研究表明，骨关节炎组平均肥大细胞数量、滑膜炎评分和血管数量均显著高于对照组[43]。抗原呈递细胞是机体内具有摄取、处理和传递抗原信息的一种辅佐细胞，可诱发T、B细胞的免疫应答。LI等[44]的实验显示，经血间充质干细胞可通过抑制抗原递呈细胞，从而减轻机体因移植引发的炎症反应。而趋化因子C-C-基序受体2是目前在骨关节炎领域中研究较多的趋化因子受体之一。WANG等[45]研究表明，CCR2在白细胞介素17A处理的软骨细胞中上调，通过抑制趋化因子C-C-基序受体2表达，可保护Ⅱ型胶原合成，以及减轻白细胞介素17A诱导的RUNT相关转录因子2过表达，从而延缓软骨细胞肥大的发展。

除此之外，此次研究还通过Coremine Medical数据库预测了骨关节炎铜死亡相关基因的潜在治疗中药，如温莪术、片姜黄、郁金、黄芩等。温莪术、片姜黄、郁金来源于中药温郁金的不同部位。现代药理学研究发现，温郁金中的化学成分主要为姜黄素类化合物、单萜类、二萜类、生物碱等成分[46]。根据相关研究表明，姜黄素可通过抑制相关细胞因子和酶，从而发挥抗炎作用[47]。HENROTIN等[48]研究亦显示，姜黄素可通过促进Ⅱ型胶原表达以及抑制β1整合素从而发挥保护软骨细胞的作用。而常青等[49]研究发现，黄芩根部的重要活性成分黄芩苷可显著降低大鼠软骨细胞中白细胞介素6、基质金属蛋白酶的表达，从而起到抗炎和保护软骨的作用。另外，此次研究还预测到一种可能靶向调控PDHB(独立风险因子)的活性成分，即红景天苷。近期的一项骨关节炎模型大鼠实验显示，随着红景天苷用药的不断增大，大鼠纤维增生和软骨损伤情况呈逐渐减轻的趋势，炎症相关因子白细胞介素7和白细胞介素23的表达也均显著降低[50]。综上所述，此次研究所预测到的中药及活性成分在既往研究中已被证实对骨关节炎具有一定的治疗作用，但多局限于炎症因子的检测及对软骨细胞的影响，鲜有在免疫方面的具体机制研究。而此文通过骨关节炎相关芯片和生物信息学技术，不仅分析了免疫浸润之间的相关性以及它们在骨关节炎组和对照组中的差异性，还分析得到了铜死亡基因与免疫细胞及功能之间的关联情况，这对于后续骨关节炎免疫方面的深入研究及铜死亡机制在该领域的相关性研究都具有一定的参考价值。

另外，此次研究还通过FunRich软件对铜死亡相关基因的上游miRNA进行了预测，共得到29个相关的miRNA。随着生物测序数据量的增加，通过生物信息学分析预测非编码RNA与疾病之间的关联，对后续生物实验的进一步开展是十分有利的[51]。通过大数据分析来预测和量化人类非编码RNA与疾病之间的关联，可以有效地找到最相关的RNA-疾病进行实验验证，从而减少生物实验的时间和成本[52]。

综上所述，此次研究的分析结果对于后续铜死亡在骨关节炎免疫方面的基础研究具有一定的参考价值，可在一定程度上减少实验中不必要的浪费。但此次研究仍存在一定的局限性：第一，所采用的芯片数据虽然已满足研究所需的样本量，但仍有可能因样本量过少从而导致结果存在一定偏倚；第二，尽管已经筛选出骨关节炎相关的铜死亡基因，但未能阐明其具体作用机制，这有待后续研究进一步深入挖掘。  
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
铜死亡：是近期新发现的一种细胞程序性死亡，主要依赖于线粒体呼吸，铜与三羧酸循环的脂化组分直接结合，促使脂酰化蛋白聚集和铁-硫簇蛋白丢失，蛋白质脂化导致蛋白毒性应激，最终致使细胞死亡。
生物信息学：是指整合计算机科学、生物学和信息技术，以此分析复杂生物数据的一门学科。

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骨关节炎是一种以关节破坏、骨质增生和关节软骨退行性病变为特征的慢性疾病，其发病机制目前尚不清楚。随着现代医学的不断发展，人们发现免疫系统在骨关节炎的发展过程中发挥着重要作用。而铜死亡是近期新发现的一种细胞程序性死亡，主要依赖于线粒体呼吸，铜与三羧酸循环的脂化组分直接结合，促使脂酰化蛋白聚集和铁-硫簇蛋白丢失，蛋白质脂化导致蛋白毒性应激，最终致使细胞死亡。尽管目前已有学者开展了细胞铜含量对肿瘤免疫微环境影响的实验，但尚未有铜死亡介导免疫浸润从而影响骨关节炎病程发展的相关性研究。基于此，此次研究首次通过结合骨关节炎芯片数据和铜死亡基因来对骨关节炎中铜死亡介导免疫浸润的具体机制进行阐述，从而为后续铜死亡在骨关节炎免疫方面的相关性研究提供一些理论帮助。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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