运动损伤滑膜组织转录组数据分析及骨关节炎关键通路和特征基因

doi:10.12307/2023.683

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (28): 4554-4558.doi: 10.12307/2023.683

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运动损伤滑膜组织转录组数据分析及骨关节炎关键通路和特征基因

付东阁，何静子

延安大学体育学院，陕西省延安市 716000

收稿日期:2022-08-22 接受日期:2022-10-19 出版日期:2023-10-08 发布日期:2023-01-29
通讯作者: 何静子，博士，延安大学体育学院，陕西省延安市 716000
作者简介:付东阁，男，1989年生，山东省平度市人，汉族，2021年韩国又石大学毕业，博士，主要从事运动损伤骨关节炎药理学的研究。
基金资助:
延安大学博士科研启动基金(YDBK2022-20)，项目负责人：付东阁

Key pathways and hub genes of osteoarthritis based on transcriptome data of sports injury synovial tissue

Fu Dongge, He Jingzi

Physical Culture Institute, Yanan University, Yanan 716000, Shaanxi Province, China

Received:2022-08-22 Accepted:2022-10-19 Online:2023-10-08 Published:2023-01-29
Contact: He Jingzi, PhD, Physical Culture Institute, Yanan University, Yanan 716000, Shaanxi Province, China
About author:Fu Dongge, PhD, Physical Culture Institute, Yanan University, Yanan 716000, Shaanxi Province, China
Supported by:
Doctoral Research Startup Fund of Yanan University, No. YDBK2022-20 (to FDG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

Cytoscape插件CytoHubba：Hub基因通常都是具有代表性的一些基因，Cytohubba是Cytoscape软件用于识别hub节点的插件，先用STRING网站构建PPI网络，当存在上百个基因的对应关系时，就需要再利用插件通过拓扑网络算法给每个基因赋值，排序发现其关键基因(hub gene)和子网络。cytoHubba根据nodes在网络中的属性进行排名。它提供了11种拓扑分析方法，包括Degrre，Edge Percolated component(EPC)，Maximum neighborhood component(MNC)，Density of Maximum Neighborhood Component(DNNC)，Maximal Clique Centrality(MCC)，six centralities(Botteleneck，EcCentricity，Closeness，Radiality，Betweenness，Stress)，得分越高越关键。
GEO2R：是一个交互式web工具，针对 GEO 数据库中表达谱芯片进行进一步差异分析的工具，利用这个工具可以比较 GEO 系列数据中的两组或更多组样品，获得差异性表达基因。GEO2R是使用GEOquery和limma R包对原始提交者提供的处理过的数据表执行比较。GEOR2 分析工具同时可以获得火山图、平均差图、 UMAP图、韦恩图、表达密度图、P 值直方图、样本分位数图、平均方差趋势图。

背景：研究表明，骨关节炎与滑膜炎密不可分，因此基于滑膜组织探索骨关节炎发病机制具有重要的临床意义。
目的：基于生物信息学方法分析骨关节炎患者滑膜组织与正常人滑膜组织转录组数据，从滑膜角度探索骨关节炎的诊疗靶点，并为骨关节炎提供后续研究思路。
方法：从Gene Expression Omnibus (GEO) 数据库中筛选含有骨关节炎滑膜组织和健康滑膜组织的数据集，得到GSE55457和GSE55235数据集，2个数据集均包含有10个骨关节炎滑膜样本和健康者滑膜样本。用GEO2R在线工具分别对GSE55457和GSE55235数据集进行差异表达分析，取校正后P值(adj.P) < 0.05的基因并通过在线工具仙桃学术取2个数据集共同的上调和下调差异表达基因。并对差异基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。利用STRING数据库对差异基因进行核心蛋白互作网络分析(PPI)，并使用Cytoscape软件中的插件CytoHubba中的7种算法(BottleNeck，Clossness，Degree，DNNC，EPC，NNC和MCC)对STRING结果进行可视化，每种算法取分数最高的前10个基因，最后挑选7种算法的交集基因作为骨关节炎的关键基因。

结果与结论：①从上述2个数据集中获得200个共同上调差异基因和124个共同下调差异基因。将得到的324个差异基因进行GO分析，结果表明差异基因主要与DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、poly(A) 结合、血小板源性生长因子受体结合、糖皮质激素受体结合等有关；而KEGG结果显示差异基因主要富集在MAPK 信号通路、胰岛素信号通路、破骨细胞分化、甲状旁腺激素的合成、分泌和作用等通路上。②PPI蛋白交互网络分析筛选得到2个骨关节炎关键基因，即热休克蛋白90αA类成员1(HSP90AA1)和细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)。③结果说明，HSP90AA1和SOCS3在骨关节炎滑膜和健康者滑膜组织中差异表达，并可能成为骨关节炎的监测标志物和治疗靶点，这一发现为骨关节炎的分子机制研究提供了思路。

https://orcid.org/0000-0002-4848-5495 (付东阁)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, 滑膜, 生物信息学, 差异表达基因, 关键基因, 治疗靶点

Abstract: BACKGROUND: Osteoarthritis is inseparable from synovitis, so it has important clinical significance to explore osteoarthritis pathogenesis based on synovial tissue.
OBJECTIVE: To explore the diagnosis and therapeutic targets of osteoarthritis from the perspective of synovium through analyzing the transcriptome data of synovial tissues between patients with osteoarthritis and healthy controls based on bioinformatics methods, as well as to provide follow-up research ideas for osteoarthritis.
METHODS: Datasets containing normal and osteoarthritis synovial tissues were screened from Gene Expression Omnibus (GEO) database. GSE55457 and GSE55235 were selected, both of which contained 10 synovial tissue samples of osteoarthritis and 10 synovial tissue samples of healthy controls. GEO2R was utilized to perform differential gene expression analysis of GSE55457 and GSE55235 datasets, and genes with adjusted P values (adj.P) < 0.05 were collected. The online tool Xiantao Academy was used to obtained common up-regulated and down-regulated differentially expressed genes in the two datasets. GO functional annotation and KEGG pathway enrichment analysis for differentially expressed genes were performed. The STRING database was used to perform protein-protein interaction analysis. The results were visualized in Cytoscape software through CytoHubba App by 7 algorithms (BottleNeck, Clossness, Degree, DNNC, EPC, NNC and MCC). The top 10 genes with the highest scores were picked out for each algorithm, and the intersected genes of 7 algorithms were selected as the hub genes of osteoarthritis.
RESULTS AND CONCLUSION: 200 common up-regulated differential genes and 124 common down-regulated differential genes were gained from the above two datasets. The results of GO analysis for the 324 differential genes showed that these genes were mainly associated with the DNA-binding transcription factor binding, RNA polymerase II specific DNA-binding transcription factor binding, poly(A) binding, platelets-derived growth factor receptor binding, glucocorticoid receptor binding, etc. KEGG analysis showed that the differential genes were mainly enriched in MAPK signaling pathway, insulin signaling pathway, osteoclast differentiation as well as parathyroid hormone synthesis, secretion and action pathways. Protein-protein interaction network analysis screened two hub genes of osteoarthritis, namely heat shock protein 90α class A member 1 (HSP90AA1) and suppressors of cytokine signaling 3 (SOCS3). These findings confirm that HSP90AA1 and SOCS3 are differentially expressed in synovial tissue of patients with osteoarthritis and healthy subjects, and may serve as surveillance markers and therapeutic target, which provide sound ideas for further study of molecular mechanisms of osteoarthritis.

Key words: osteoarthritis, synovial membrane, bioinformatics, differentially expressed gene, hub gene, therapeutic target

中图分类号:

付东阁, 何静子. 运动损伤滑膜组织转录组数据分析及骨关节炎关键通路和特征基因[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4554-4558.

Fu Dongge, He Jingzi. Key pathways and hub genes of osteoarthritis based on transcriptome data of sports injury synovial tissue[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(28): 4554-4558.

图/表（结果） 5

2.1 差异表达基因的筛选研究选择的数据集GSE55457，包括10例骨关节炎滑膜组织样本和10例健康者滑膜组织样本，所选样本转录组数据分布情况见图1A，其UMAP图见图1B。基于筛选标准adjust P < 0.05，共筛选出1 574个差异表达基因，包括1 122个上调表达基因，452个下调表达基因，火山图如图1C。数据集GSE55235，包括10例骨关节炎滑膜组织样本和10例健康者滑膜组织样本，所选样本转录组数据分布情况见图1D，其UMAP图见图1E。基于筛选标准adjust P < 0.05，共筛选出1 816个差异表达基因，包括721个上调表达基因，1 095个下调表达基因，火山图如图1F。随后，对上下调基因分别取两数据集的交集，见图2，其中上调基因200个，下调基因124个。取两数据集前100个上调基因的交集，共获得8个基因(JUN，ZFP36L2，DUSP1，MAFF，GRB10，APOLD1，VEGFA，FKBP5)；取其前100个下调基因的交集，共获得9个基因(EPYC，SCRG1，GAP43，CD300A，WNT5B，CX3CR1，IGKC，TLR7，PART1)。

2.2 差异基因的功能富集分析将筛选得到的324个差异表达基因进行GO功能注释和KEGG富集分析，GO分析结果表明差异表达基因生物学过程主要和脂肪细胞分化、RNA剪接调控、通过剪接体调控mRNA的剪接、转移酶活性的负调控、激酶活性的负调控有关；细胞组分主要和核斑点、细胞质核糖核蛋白颗粒、核糖核蛋白颗粒、Copi涂层囊泡、细胞质应激颗粒有关，而分子功能主要与DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、poly(A) 结合、血小板源性生长因子受体结合、糖皮质激素受体结合有关，见图3。而KEGG主要富集在MAPK信号通路、胰岛素信号通路、破骨细胞分化、甲状旁腺激素的合成、分泌和作用等通路，见图4。

2.3 骨关节炎关键基因的识别将筛选得到的324个差异表达基因输入至STRING数据库，设置筛选的条件是：combined score > 0.9，下载所得结果，之后采用Cytoscape软件中的插件CytoHubba里的7种算法(BottleNeck，Clossness，Degree，DNNC，EPC，NNC 和MCC)，取每种算法里分数最高的前10个基因，见图5；然后取交集，所获交集基因HSP90AA1、SOCS3被确定为骨关节炎核心基因，见表1。

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引言

骨关节炎是临床上最常见的退行性全关节疾病，以关节软骨退化和软骨下骨结构改变并伴有滑膜炎症和骨赘形成为病理特征，是导致患者疼痛和关节功能障碍甚至残疾的主要原因[1-3]。流行病学研究显示，全世界大约有2.5亿人正遭受骨关节炎的影响，并且随着人口老龄化和肥胖的加剧，骨关节炎患病率逐渐上升，严重影响患者的生活质量并造成巨大的社会经济负担[3-5]。
尽管对骨关节炎发病机制和治疗靶点的研究不断深入，相关药物的开发也不断增多，但除晚期患者进行关节置换手术外，临床上能显著改善患者病情的非侵入性方法仍是有限[6]。因此，寻找骨关节炎的发病机制及相关治疗靶点至关重要。
滑膜是一种特殊的结缔组织，环绕着关节，形成滑囊和脂肪垫，具有营养关节、分泌滑液并润滑关节的作用。滑膜的炎症常常伴随着炎症细胞的浸润、滑膜血管的增生和炎症因子的释放等过程。早在20世纪90年代，影像学证据发现骨关节炎常常伴随着滑膜炎的发生[7]。近年来，大量研究表明滑膜炎不仅是导致骨关节炎患者症状(如关节积液和关节疼痛)的重要因素，其严重程度与骨关节炎病情进展有关，而且发现滑膜炎存在于骨关节炎发生发展的各个阶段[8-10]。另外，研究显示滑膜滑液中促炎因子的水平与骨关节炎风险密切相关[11]，同时在体外羊骨关节炎模型中，关节内注射抗炎药物透明质酸明显改善了骨关节炎病情[12]。从机制上讲，滑膜炎症细胞的浸润(包括巨噬细胞的极化等)，其分泌大量促炎因子，从而加重关节软骨的损害[13-15]。以上研究表明，骨关节炎与滑膜炎密不可分，滑膜组织参与骨关节炎的病情进展[16]。因此基于滑膜组织探索骨关节炎发病机制具有重要的临床意义。
近年来，高通量技术快速发展，基因芯片和基因测序已成为研究疾病必要且高效的方法之一。生物信息学是生命科学领域的有力工具，可从基因组学、转录组学以及代谢组学等层面揭示疾病关键信息。该研究拟通过生物信息学方法，基于骨关节炎患者滑膜组织和正常滑膜组织的转录组数据，进行差异表达基因分析、功能富集和蛋白互作网络(protein-protein interaction network，PPI network) 分析，运用STRING和Cytoscape插件CytoHubba筛选骨关节炎关键基因，探讨骨关节炎发生发展中的调节基因，为探索骨关节炎发病机制和寻找治疗干预的适宜分子靶点提供理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计基因表达数据可视化分析。
1.2 时间及地点实验于2021年12月至2022年6月在延安大学体育学院完成。
1.3 数据来源该研究中分析的基因表达数据是从GEO(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库下载。经过仔细分析，选择了数据集GSE55457和GSE55235。2个数据集各包括10例骨关节炎患者滑膜样本和10例健康者滑膜样本。
1.4 方法
1.4.1 差异表达基因筛选利用GEO2R在线工具对数据集GSE55457和GSE55235的骨关节炎滑膜样本与正常滑膜样本分组并进行差异基因分析。Adj.P < 0.05的基因被认为是差异表达基因，并获取其火山图、UMAP图进行可视化。取2个数据集所获差异基因中共同上调和下调的基因，并以韦恩图形式展示。韦恩图的汇制是通过在线工具(https://www.xiantao.love/)完成。
1.4.2 差异表达基因的GO/KEGG富集分析 GO(Gene Ontology)分析是大规模功能研究常用的分析方法，其对基因功能的研究可分为3个方面，即生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组分(CC)。KEGG通路分析被用于将差异表达基因分配给特定的途径，从而分析出疾病状态下显著改变的代谢通路。将差异表达基因输入在线工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)，获取基因功能注释数据。P < 0.05为差异有统计学意义。
1.4.3 基因的蛋白互作网络(PPI) 将骨关节炎差异表达基因输入STRING数据库(Search Tool for the Rtrieval of Interacting Genes，http://string-db.org/)，筛选的条件是：combined score > 0.9，之后利用Cytoscape软件(www.cytoscape.org/)将PPI网络可视化。在这个网络中具有更高关联度的节点在维持整个网络的稳定性方面更为重要，Cytoscape软件中的插件CytoHubba可以根据多种算法来计算每个蛋白质节点的分数。在该研究中，采用了7种算法(BottleNeck，Clossness，Degree，DNNC，EPC，NNC 和MCC)，取每种算法里分数最高的前10个基因，然后取交集，所获交集基因被确定为核心基因。

讨论

骨关节炎是一种缓慢进展的退行性关节疾病，最终导致不可逆转的关节结构变化，临床症状上常以慢性疼痛为表型[17]。由于缺乏早期诊断指标，骨关节炎患者往往失去最佳的治疗机会，预后不良。越来越多的研究表明，关节组织滑膜的慢性炎症是关节损伤、关节破坏和残疾的重要原因[18]。此外，利用抗炎药物和抗炎干预措施对骨关节炎治疗相关的体内体外研究显示具有良好的骨关节炎改善作用[19-21]。因此，识别骨关节炎滑膜组织中的生物标志物基因对于加深骨关节炎潜在机制的理解和识别新的治疗靶点至关重要。生物信息学是基于大数据的研究，是筛选骨关节炎分子标记和治疗靶点的强有力的策略。该文章基于生物信息学方法，通过对GSE55457和GSE55235数据集中骨关节炎滑膜组织和正常滑膜组织进行差异基因表达分析，以adj.P < 0.05为筛选条件获得各自差异基因后取交集，共得到200个上调和124个下调差异表达基因，随后将这些基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析，最后利用STRING进行PPI分析，通过插件CytoHubba里的7种算法计算各自分数后取每种算法得分最高的前10个基因，交集后得到2个骨关节炎核心基因，即HSP90AA1、SOCS3。
GO分析结果显示，差异表达基因主要与DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、poly(A) 结合、血小板源性生长因子受体结合、糖皮质激素受体结合等分子功能有关，这些结果提示差异表达基因主要参与相关基因的转录调节以及mRNA翻译过程。此外，有研究表明血小板源性生长因子可以通过多种机制发挥软骨保护作用，且可以通过抗炎作用减轻骨关节炎疾病进展[22-23]。因此，血小板源性生长因子及其受体紊乱可能是骨关节炎发病的重要机制。差异表达基因与糖皮质激素受体结合分子功能有关，提示糖皮质激素受体信号通路与骨关节炎进展可能相关[24]。另外，合成糖皮质激素可用于减轻骨关节炎炎症和疼痛。患者反应的变化和与长期使用的相关并发症的可能性导致需要更好地了解糖皮质激素受体信号在骨关节炎中的作用[25]。
KEGG通路富集分析结果显示，差异表达基因主要富集在MAPK信号通路、胰岛素信号通路、破骨细胞分化、甲状旁腺激素的合成、分泌和作用等通路上。既往研究显示MAPK是调控细胞增殖和发育的关键信号分子，同时也参与软骨组织形态发生，因此MAPK可能参与骨关节炎的发病过程[26]。相关Meta分析表明2型糖尿病是骨关节炎发展的独立危险因素[27]。患有骨关节炎和2型糖尿病的肥胖患者关节滑液中促炎细胞因子肿瘤坏死因子水平高于未患2型糖尿病的患者[28]。此外，糖尿病合并骨关节炎患者的成纤维样滑膜细胞显示胰岛素抵抗，这意味着胰岛素降低了促进骨关节炎发展的促炎和分解代谢介质产生的能力[29]。另外，高糖诱导骨关节炎成纤维样滑膜细胞中血管内皮生长因子分泌和活性氧生成增加，促进滑膜血管生成、组织损伤和炎症反应[30]。这些研究结果表明胰岛素信号通路异常参与了骨关节炎的进展。破骨细胞分化是骨关节炎发展的重要病理因素，相关研究表明抑制破骨细胞生成可改善骨关节炎[31-33]，间接提示滑膜相关基因表达可促进破骨细胞分化并由此影响骨关节炎病情进展。甲状旁腺激素由甲状旁腺合成和分泌，调节体内的钙磷代谢稳态。虽然未有文献报道甲状旁腺激素与骨关节炎的相关研究，但钙离子结晶、软骨钙化可促进骨关节炎病理过程[34-35]，提示钙磷代谢相关蛋白对于骨关节炎中软骨的稳态至关重要。
通过PPI蛋白交互网络分析研究差异表达基因的相互关系，得到HSP90AA1、SOCS3两个核心基因。热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是由细胞应激诱导的保护和维持细胞完整性和功能的蛋白家族。HSP90AA1即热休克蛋白90αA类成员1，是热休克蛋白家族的一员。在骨关节炎滑膜中，HSP60、HSP70和HSP90是HSP家族中最丰富的成员[36]。有研究显示膝骨关节炎患者血清和滑膜液中HSP70水平高于健康对照组，并与影像学疾病严重程度相关[37]。另外，在内侧半月板不稳定(DMM)小鼠模型中，过表达HSP70家族成员HSPA1A可以消除软骨侵蚀，而对内侧半月板不稳定诱导的骨赘形成或软骨下骨板增厚没有影响[38]。然而，尚未有文献报道滑膜HSP90AA1在骨关节炎中的作用，因此，此次筛选出的HSP90AA1可为后续研究提供基础。
细胞因子信号转导抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3，SOCS3)是细胞因子信号转导(SOCS)家族抑制子的一个成员，可负反馈调节多种炎症因子表达。研究表明SOCS3在骨关节炎中表达上调，其上调是由于机体的自我保护作用导致的，抑制SOCS3表达增加了软骨细胞炎症细胞的表达，反之减轻关节损伤。机制上，SOCS3通过下调核转录因子κB和环氧化酶2来发挥抗炎和抑制软骨细胞增殖的作用[39]。由此可猜测，SOCS3可能通过其抗炎作用抑制滑膜组织的炎症，进而介导骨关节炎的进展。需要注意的是，虽然筛选的其他基因在文中未讨论，但不可否认它们在骨关节炎中的作用。例如，MYC是一组癌基因，有研究表明C-myc基因沉默可促进白细胞介素1β诱导的大鼠软骨细胞增殖，抑制其凋亡和细胞因子表达。因此，此次筛选的其他基因，虽未作为核心基因，但仍有可能在骨关节炎滑膜的炎症中发挥作用，并以此参与骨关节炎的进展过程。
然而，此次研究完全通过生物信息学的方法筛选骨关节炎关键通路和特征基因，尚未在动物和细胞上进行分子生物学实验验证；此外，虽然是通过2个数据集进行筛选，然而2个数据集的样本例数较少，得出的结论仍需要大样本数据进行展开验证。
综上，研究通过生物信息学方法筛选得到2个与滑膜相关的骨关节炎关键基因：HSP90AA1、SOCS3。这2个基因在滑膜中的异常表达可能是骨关节炎发病的重要分子机制，并可能成为骨关节炎相关的生物标志物。靶向这2个基因可能为骨关节炎药物研发提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

运动损伤滑膜组织转录组数据分析及骨关节炎关键通路和特征基因

Key pathways and hub genes of osteoarthritis based on transcriptome data of sports injury synovial tissue

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