淫羊藿苷改善甲状腺功能减退模型大鼠的垂体发育

doi:10.12307/2023.151

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (28): 4546-4553.doi: 10.12307/2023.151

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淫羊藿苷改善甲状腺功能减退模型大鼠的垂体发育

白改改1，赵玉娟2，魏家凯2，黄文娣2，安瑶2，王志2

西安市儿童医院，1内分泌遗传代谢科，2新生儿科，陕西省西安市 710000

收稿日期:2021-11-24 接受日期:2022-02-25 出版日期:2023-10-08 发布日期:2023-01-29
通讯作者: 王志，硕士，主治医师，西安市儿童医院新生儿科，陕西省西安市 710000
作者简介:白改改，女，1985年生，陕西省子长县人，汉族，2012年西安交通大学医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事内分泌遗传代谢方面的研究。

Icariin improves pituitary development in hypothyroidism model rats

Bai Gaigai1, Zhao Yujuan2, Wei Jiakai2, Huang Wendi2, An Yao2, Wang Zhi2

1Department of Endocrine Genetics and Metabolism, 2Department of Neonatology, Xi’an Children’s Hospital, Xi’an, Shaanxi 710000, China

Received:2021-11-24 Accepted:2022-02-25 Online:2023-10-08 Published:2023-01-29
Contact: Wang Zhi, Master, Attending physician, Department of Neonatology, Xi’an Children’s Hospital, Xi’an, Shaanxi 710000, China
About author:Bai Gaigai, Master, Attending physician, Department of Endocrine Genetics and Metabolism, Xi’an Children’s Hospital, Xi’an, Shaanxi 710000, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

甲状腺功能减退：甲状腺功能减退症(简称甲减)，是由于甲状腺激素合成及分泌减少，或其生理效应不足所致机体代谢降低的一种疾病。按其病因分为原发性甲减、继发性甲减及周围性甲减3类。
垂体：位于丘脑下部的腹侧，为一卵圆形小体，可分为腺垂体和神经垂体两大部分。垂体是人体最重要的内分泌腺，分前叶和后叶两部分，它分泌多种激素，如生长激素、促甲状腺激素、促肾上腺皮质激素、促性腺素、催产素、催乳素、黑色细胞刺激素等，还能够贮藏并释放下丘脑分泌的抗利尿激素，这些激素对代谢、生长、发育和生殖等有重要作用。

背景：甲状腺功能减退常伴随着垂体合成分泌激素分泌不足，有研究表明淫羊藿苷对甲状腺功能减退引起的垂体激素分泌不足有确切疗效，但其作用机制还不清楚。
目的：探究淫羊藿苷对大鼠甲状腺功能减退后垂体合成分泌激素的影响及机制。
方法：①40只新生雌性SD大鼠随机分为对照组、模型组及75，150，300 mg/kg淫羊藿苷组，每组8只，后4组给予丙基硫氧嘧啶1.5 mg/(kg·d)灌胃处理构建甲状腺功能减退大鼠模型，各淫羊藿苷剂量组给予75，150，300 mg/kg淫羊藿苷干预治疗，检测各组miR-17-5p、LIM同源框4(LIM homeobox 4，LHX4)、PROP成对同源1蛋白(prop paired end homology 1 protein，PROP1)和HESX1表达，以及垂体合成分泌激素含量。②采用锂盐处理共培养的大鼠甲状腺细胞和垂体前叶细胞，给予不同浓度淫羊藿苷(10，30，50，70，100 μmol/L)干预，CCK-8试剂盒检测垂体前叶细胞活力；ELISA试剂盒检测促卵泡激素、生长激素和促甲状腺激素水平；实时荧光定量PCR检测miR-17-5p表达；Western印迹法检测PROP1和HESX1蛋白水平；采用双荧光素报告酶基因和RNA结合蛋白免疫沉淀实验检测miR-17-5p和LHX4的结合关系。

结果与结论：①体内实验结果显示，150 mg/kg淫羊藿苷组较模型组促甲状腺激素含量降低(P < 0.05)，生长激素(P < 0.01)和促卵泡激素(P < 0.05)含量显著升高；此外，150 mg/kg淫羊藿苷组较模型组血清游离三碘甲状腺原氨酸、血清游离甲状腺素、血清三碘甲状腺原氨酸和血清甲状腺素激素分泌水平增加；②用50，70，100 μmol/L淫羊藿苷干预能够增强大鼠垂体前叶细胞活力(P < 0.01)，其中70 μmol/L淫羊藿苷干预效果最佳(P均< 0.01)；③淫羊藿苷处理抑制了锂盐处理的大鼠垂体前叶细胞中miR-17-5p表达增加，上调PROP1和HESX1表达(P均< 0.05)；④锂盐处理组细胞上清液中生长激素和促卵泡激素含量明显降低，促甲状腺激素含量增加，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.01)；⑤用不同浓度淫羊藿苷干预细胞后，生长激素和促卵泡激素含量增加(P < 0.01)，促甲状腺激素水平明显降低(P < 0.05)，70 μmol/L时干预效果最佳(P < 0.01)；⑥与对照组相比，转染miR-17-5p mimic抑制锂盐处理的大鼠垂体前叶细胞活力(P < 0.05)，下调细胞中PROP1和HESX1的蛋白表达，增加促甲状腺激素含量(P < 0.05)，减少生长激素和促卵泡激素含量(P均< 0.01)，而转染miR-17-5p inhibitor与转染miR-17-5p mimic的作用相反；⑦LHX4是miR-17-5p的靶基因，过表达LHX4增加细胞活力，促进PROP1和HESX1蛋白表达(P均< 0.01)，减少促甲状腺激素含量(P < 0.05)，增加生长激素和促卵泡激素含量(P < 0.01)；⑧提示淫羊藿苷可能通过miR-17-5p/LHX4轴恢复失调的垂体合成分泌激素水平。

https://orcid.org/0000-0002-3034-7289(白改改)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 淫羊藿苷, 甲状腺功能减退, miR-17-5p/LHX4轴, 生长素, 促甲状腺激素, 促卵泡激素

Abstract: BACKGROUND: Hypothyroidism is often accompanied by inadequate secretion of pituitary synthetic secretory hormones. Some studies have shown that icariin has an exact effect on pituitary hormone secretion deficiency caused by hypothyroidism, but the mechanism is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect and mechanism of icariin on pituitary hormone synthesis and secretion after hypothyroidism in rats.
METHODS: (1) Forty newborn female Sprague-Dawley rats were randomized into control, model, 75, 150, 300 mg/kg icariin groups with 8 rats in each group. The rats in the latter four groups were intragastrically treated with propylthiouracil (1.5 mg/kg/day) to construct a hypothyroid rat model, and treated with different doses (0, 75, 150, and 300 mg/kg) of icariin. The expression of miR-17-5p, LIM homeobox 4 (LHX4), prop paired end homology 1 protein (PROP1), and HESX1 was detected, as well as hormone content synthetized and secreted by the pituitary gland. (2) Co-cultured rat thyrocytes and anterior pituitary cells were treated with lithium salt, and different concentrations of icariin (10, 30, 50, 70, 100 μmol/L) were administered. Anterior pituitary cell viability was assessed by cell counting kit-8. Follicle-stimulating hormone, growth hormone, and thyroid-stimulating hormone levels were detected by ELISA kits. miR-17-5p expression was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. PROP1 and HESX1 protein levels were measured by western blot assay. The binding relationship between miR-17-5p and LHX4 was examined by RNA binding protein immunoprecipitation and dual luciferin reporter assays.
RESULTS AND CONCLUSION: In vivo results showed that the treatment with 150 mg/kg icariin decreased the contents of thyroid-stimulating hormone and significantly increased the contents of growth hormone and follicle-stimulating hormone compared with the model group. In addition, the hormone secretion levels of serum free triiodothyronine, serum free thyroxine, serum triiodothyronine, and serum thyroxine were increased in the 150 mg/kg icariin group compared with the model group. Intervention with 50, 70 and 100 μmol/L icariin could enhance the cell viability of rat anterior pituitary cells (P < 0.01), among which 70 μmol/L icariin had the best effect (P < 0.01). Icariin treatment inhibited the increased expression of miR-17-5p and upregulated the expression of PROP1 and HESX1 in lithium salt-treated rat anterior pituitary cells (P < 0.05). The contents of growth hormone and follicle-stimulating hormone in the cell supernatant of the lithium salt treated group were obviously decreased, and the content of thyrotropin was significantly increased compared with the control (P < 0.01). When the cells were intervened with different doses of icariin, the contents of growth hormone (P < 0.01) and follicle stimulating hormone (P < 0.01) increased, the level of thyroid-stimulating hormone (P < 0.01) decreased significantly, and the best intervention effect was achieved at 70 μmol/L, with a significant difference (P < 0.01). Compared with the control group, transfection with miR-17-5p mimic inhibited cell viability of anterior pituitary cells (P < 0.05), downregulated the protein expression of PROP1 and HESX1 in the cells, increased thyrotropin content (P < 0.05), and decreased growth hormone (P < 0.01) and follicle-stimulating hormone (P < 0.01) contents in the cells (P < 0.01), whereas transfection with miR-17-5p inhibitor had the opposite effect as transfection with miR-17-5p mimic. LHX4 is a target gene of miR-17-5p. Overexpression of LHX4 increased cell viability, promoted PROP1 and HESX1 protein expression (P < 0.01), reduced thyrotropin content (P < 0.05), and increased growth hormone (P < 0.01) and follicle-stimulating hormone (P < 0.05) contents. To conclude, icariin may restore the level of secretory hormones synthesized by dysregulated pituitary gland through the miR-17-5p/LHX4 axis.

Key words: icariin, hypothyroidism, miR-17-5p/LHX4 axis, growth hormone, thyroid-stimulating hormone, follicle-stimulating hormone

中图分类号:

白改改, 赵玉娟, 魏家凯, 黄文娣, 安瑶, 王志. 淫羊藿苷改善甲状腺功能减退模型大鼠的垂体发育[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4546-4553.

Bai Gaigai, Zhao Yujuan, Wei Jiakai, Huang Wendi, An Yao, Wang Zhi. Icariin improves pituitary development in hypothyroidism model rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(28): 4546-4553.

图/表（结果） 10

2.1 实验动物数量分析共40只SD雌性大鼠纳入实验，其中模型组有1只小鼠手术过程中死亡，系实验人员操作失误，余无特殊，针对这只小鼠已进行后续实验补充。
2.2 淫羊藿苷对大鼠垂体前叶细胞合成分泌激素的影响淫羊藿苷对大鼠垂体前叶细胞无明显毒副反应，当给予70 μmol/L
淫羊藿苷干预大鼠垂体前叶细胞时，细胞活力较未干预组显著升高(P < 0.05)，见图1A。与对照组相比，锂盐处理组细胞活力明显降低，而给予50，70，100 μmol/L淫羊藿苷干预后细胞活力明显增加，其中70 μmol/L淫羊藿苷干预效果最佳，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图1B。故选择50，70，100 μmol/L剂量作为观察组进行后续实验。与对照组相比，锂盐处理组细胞中miR-17-5p的表达显著升高，而给予不同浓度淫羊藿苷处理后miR-17-5p的表达明显下调，其中70 μmol/L淫羊藿苷组最显著(P < 0.01)，见图1C。Western印迹结果显示，当用锂盐处理细胞后，PROP1和HESX1的蛋白表达较对照组显著降低(P < 0.01)，给予淫羊藿苷干预后表达上调，在浓度为70 μmol/L时达到峰值，该结果与锂盐处理组相比差异有显著性意义(P < 0.01)，见图1D-F。

锂盐处理组细胞上清液中生长激素和促卵泡激素含量明显降低，促甲状腺激素含量增加，该结果与对照相比具有显著性意义(P < 0.01)。用不同剂量淫羊藿苷干预细胞后，生长激素和促卵泡激素含量增加，促甲状腺激素水平明显降低，70 μmol/L时干预效果最佳，差异有显著性意义(P < 0.01)，见表1。

2.3 MiR-17-5p对大鼠垂体前叶细胞合成分泌激素的影响 miR-17-5p过表达效率和干扰效率见图2A。与锂盐+NC mimic组相比，锂盐+miR-17-5p mimic组细胞活力显著降低，锂盐+miR-17-5p inhibitor组细胞活力较锂盐+NC inhibitor组显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2B。Western印迹结果显示，锂盐+miR-17-5p mimic组PROP1和HESX1的蛋白水平较锂盐+NC mimic组显著下调，而锂盐+miR-17-5p inhibitor组PROP1和HESX1蛋白水平较锂盐+NC inhibitor组明显升高，以上比较差异均有显著性意义(P < 0.01)，见图2C-E。

与锂盐+NC mimic组相比，转染miR-17-5p mimic后细胞上清中生长激素和促卵泡激素水平明显降低(P < 0.01)，促甲状腺激素水平增加(P < 0.05)。与锂盐+NC inhibitor组相比，转染miR-17-5p inhibitor后细胞上清中生长激素和促卵泡激素水平明显增加(P < 0.01)，促甲状腺激素水平降低(P < 0.05)，以上比较差异均有显著性意义，见表2。

2.4 LHX4是miR-17-5p的靶基因 miR-17-5p和LHX4的结合序列见图3A。荧光素酶报告基因实验结果显示，与NC mimic组相比，miR-17-5p与野生型LHX4 3’UTR共转染后，检测到荧光素酶活性显著降低，差异有显著性意义(P < 0.01)。而与突变型LHX4 3’UTR共转染后，荧光素酶活性无明显变化，见图3B。RNA免疫共沉淀结果显示，miR-17-5p在LHX4抗体上的富集显著高于IgG组，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图3C。此外，miR-17-5p mimic组LHX4 mRNA和蛋白表达水平较NC mimic组显著降低，miR-17-5p inhibitor组LHX4 mRNA和蛋白表达水平较NC inhibitor明显上调，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图3D-F。

2.5 LHX4对大鼠垂体前叶细胞合成分泌激素的影响此次实验测得转染pcDNA-LHX4过表达效率为pcDNA-3.1组的(3.14±0.18)倍，转染LHX4 siRNA干扰效率为NC siRNA组的(0.35±0.05)倍，差异有显著性意义(P < 0.01)。与锂盐+pcDNA-3.1组相比，锂盐+pcDNA-LHX4组细胞活力显著增强；与锂盐+NC siRNA组比较，锂盐+LHX4 siRNA组细胞活力降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。Western印迹结果显示，锂盐 +pcDNA-LHX4组PROP1和HESX1的蛋白水平较锂盐+pcDNA-3.1组显著上调；锂盐+LHX4 siRNA组PROP1和HESX1蛋白水平较锂盐+NC siRNA组明显降低，以上比较差异均有显著性意义(P < 0.01)，见图4。

与锂盐+pcDNA-3.1组相比，锂盐+pcDNA-LHX4组细胞上清中生长激素和促卵泡激素水平明显升高(P < 0.01)，促甲状腺激素水平降低(P < 0.05)；与锂盐+NC inhibitor组相比，锂盐+LHX4 siRNA组细胞上清中生长激素和促卵泡激素水平明显减少(P < 0.01)，促甲状腺激素水平增加(P < 0.05)，以上比较差异均有显著性意义，见表3。

2.6 淫羊藿苷对新生甲状腺功能减退大鼠垂体合成分泌激素的影响与对照组相比，模型组大鼠体质量随时间变化升高，淫羊藿苷治疗后体质量显著降低(P < 0.05)，见图5A，其中150 mg/kg组效果最显著(P < 0.01)。与对照组相比，模型组大鼠脑垂体组织中miR-17-5p表达水平显著上调，LHX4、PROP1和HESX1蛋白水平明显降低。给予不同剂量淫羊藿苷治疗后，miR-17-5p表达降低，LHX4、PROP1和HESX1蛋白水平显著升高，差异与模型组相比差异有显著性意义(P < 0.01)，见图5B-F。

与对照组相比，模型组大鼠血清中生长激素和促卵泡激素水平明显降低，促甲状腺激素含量升高，采用不同剂量淫羊藿苷治疗后生长激素和促卵泡激素含量显著升高，促甲状腺激素含量降低，以上比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，其中150 mg/kg剂量组效果最为显著(P < 0.01)，见表4。

与对照组相比，模型组大鼠血清中血清游离三碘甲状腺原氨酸、血清游离甲状腺素、血清三碘甲状腺原氨酸和血清甲状腺素激素分泌水平明显降低，采用不同剂量淫羊藿苷治疗后血清游离三碘甲状腺原氨酸、血清游离甲状腺素、血清三碘甲状腺原氨酸和血清甲状腺素激素浓度显著升高，以上比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，其中150 mg/kg剂量组效果最为显著(P < 0.01)，见表5。

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引言

新生儿期发病的甲状腺功能减退患者表现有骨骼生长发育缓慢、体质量增加等，其主要原因之一是甲状腺激素不足导致联合性垂体激素缺乏症[1]。通常该病是由于新生儿出生时下丘脑-垂体-甲状腺轴功能障碍而导致的甲状腺激素产生不足，或伴有轻微到严重的甲状腺激素缺乏症。低水平的甲状腺激素除导致促甲状腺激素水平升高以外，尚可能引起其他激素，如促肾上腺皮质激素、生长激素、催乳素以及促肾上腺皮质激素下游激素-肾上腺皮质激素的变化[2-3]。长期的低甲状腺激素水平使垂体增大增生，严重者容易与垂体瘤(继发引起垂体功能减退)相混淆。生长激素是垂体前叶分泌的一种肽类激素，是人出生后促生长最主要的激素，甲状腺激素与生长激素有协同促进作用，甲状腺功能正常是保证生长激素效应的前提[4]。除生长激素外，下丘脑分泌的促卵泡激素和促甲状腺激素同样在机体发育中起到重要作用。甲状腺功能减退症患者由于甲状腺激素分泌减少，对垂体反馈抑制减弱，进而促甲状腺激素细胞增生肥大，久之腺垂体增大，甚至发生腺瘤。一方面，垂体促甲状腺激素细胞数目增多，体积增大；另一方面，促肾上腺皮质激素生长激素细胞数目减少，从而继发出现肾上腺皮质功能不足、生长激素缺乏[5]。
研究表明，黄酮类对甲状腺功能减退具有很良好的治疗作用。有研究报道称白杨素通过调节海马5-羟色胺和多巴胺逆转雌性小鼠甲状腺功能减退引起的抑郁样行为[6]；另有研究表明类黄酮白杨素可能通过调节神经营养系统中的突触可塑性来逆转与甲状腺功能减退引起的记忆缺陷相关的行为和神经化学改变[7]；亦有研究报道称黄酮类物质参与调控下丘脑-垂体-肾上腺轴[8]。淫羊藿苷作为研究较为广泛的黄酮类化合物，已被报道具有广泛的药理学和生物学特性，包括抗炎、抗骨质疏松、抗衰老特性以及促进毛发生长的活
性[9-11]。据报道淫羊藿苷通过调控下丘脑-垂体-肾上腺轴作用及激素分泌水平起到抗抑郁特性[12]。除此以外，淫羊藿苷通过调控下丘脑-垂体-肾上腺轴作用及激素分泌水平参与皮肤炎症的修复[13]。研究表明联合性垂体激素缺乏症患儿血清中发现miR-17-5p水平升高，可以作为诊断儿童联合性垂体激素缺乏症的生物标志物[14]。此外，内分泌干扰物氯氰菊酯通过促进miR-17-5p、miR-330-3p和miR-331-3p表达引起大鼠甲状腺功能减退[15]。因此，作者推测淫羊藿苷可能通过调节miR-17-5p的表达改善甲状腺功能减退引起的垂体合成分泌激素紊乱，该实验旨在研究淫羊藿苷在新生小鼠甲状腺功能减退引起垂体合成分泌激素不足过程中的作用及机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计动物体内实验和细胞学体外实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2018年12月至2020年7月在西安市儿童医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物无特定病原体级新生雌性SD大鼠40只，体质量5-10 g，购自西安交通大学实验动物中心，许可证号：SCXK(陕)2017-0007。实验方案经西安市儿童医院动物实验伦理委员会批准，批准号为XACH2017-0135。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 试剂及仪器淫羊藿苷购自西安康诺化工有限公司；丙基硫氧嘧啶购自美国MCE公司；锂盐购自MCE公司；DMEM培养液、胎牛血清购自美国Hyclone公司；青霉素-链霉素、0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液购自美国Sigma公司；Trizol试剂盒购自美国Sigma公司；转染试剂Lipofectamine®3000购自美国Sigma公司；PROP成对同源1蛋白(prop paired end homology 1 protein，ROP1)、LIM同源框4(LIM homeobox 4，LHX4)及HESX1等一抗及相应二抗购自美国Santa Cruz公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自美国Millipore公司；RNA提取试剂盒购自美国Millipore公司；反转录试剂盒购自美国Millipore公司；蛋白提取试剂盒购自美国Millipore公司；ELISA试剂盒购自美国Millipore公司；引物合成由上海生工合成；CCK-8试剂盒购自美国Millipore公司；miR-17-5p模拟物(mimic)、miR-17-5p抑制剂(inhibitor)、模拟物阴性对照(NC mimic)、抑制剂阴性对照(NC inhibitor)由上海生工合成。
高通量实时荧光定量PCR仪(Roche公司，瑞士)；Western blot系统(北京六一仪器厂DYY-7C)；台式低温高速离心机(日本KUBOTA公司)；细胞培养箱(上海力申科学仪器公司)；凝胶成像分析仪(广州瑞丰实验设备有限公司)；双荧光素酶报告基因检测系统(Promega，美国)。
1.4 方法
1.4.1 动物体内实验
(1)甲状腺功能减退大鼠模型建立及分组：按随机数字表法将40只新生雌性SD大鼠随机选取32只，每日灌服丙基硫氧嘧啶1.5 mg/kg制备模型，连续给药10 d；其余8只大鼠纳入对照组，每日用等量生理盐水灌胃。大鼠头颈部皮下注射促甲状腺激素释放激素后促甲状腺激素无明显变化则建模成功。
将建模成功的大鼠随机分为模型组及75，150，300 mg/kg淫羊藿苷组，每组8只。75，150，300 mg/kg淫羊藿苷组分别给予75，150，300 mg/kg淫羊藿苷灌胃，1次/d，连续给药10 d；模型组给予等体积的生理盐水。
(2)取材：5组大鼠均在实验终止后24 h用相同处理办法取材。大鼠眼眶放血后腹腔注射35 mg/kg戊巴比妥钠麻醉断颈处死，取大鼠脑垂体组织，用预冷的PBS冲洗掉多余血液，将采集的脑垂体组织样本剪碎并在加有组织裂解液的研钵中充分研磨，过滤，PBS冲洗3次，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。将组织匀浆吸入预冷的无菌离心管中，于4 ℃，10 000 r/min条件下离心5 min，取离心后的上清得到组织总蛋白，应用Western blotting检测LHX4、PROP1和HESX1蛋白的表达水平。

各组大鼠静脉采血离心获得血清，用ELISA法检测血清中生长激素、促卵泡激素和促甲状腺激素的分泌水平。

1.4.2 细胞体外实验
(1)细胞培养
大鼠垂体前叶原代细胞培养：新生雌性SD大鼠眼眶放血后腹腔注射35 mg/kg戊巴比妥钠麻醉断颈处死，在无菌条件下摘除垂体前叶组织，将其剪切成0.2-0.5 mm3的碎块，加入4 mL无菌胰蛋白酶液(浓度为25%)，37 ℃恒温水浴30 min，然后加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液2 mL以终止消化。将滤液1 500 r/min离心10 min，使用5 mL DMEM培养液重悬细胞。细胞计数后按6.0×108 L-1的浓度接种于24孔培养板中培养，每孔1 mL。
大鼠甲状腺组织单细胞悬液的制备及细胞的原代培养：新生雌性SD大鼠(购自西安交通大学动物实验中心)眼眶放血后，腹腔注射35 mg/kg戊巴比妥钠麻醉断颈处死，PBS洗涤以充分显露甲状腺组织。将甲状腺组织浸泡于含1 g/LⅠ型胶原酶的组织消化液中于37℃消化2 h。消化后的组织液经Ficoll分离得甲状腺单个核细胞，用RPMI 1640培养基洗2遍，然后调整细胞浓度至2×108 L-1后于6孔板中接种，每3 d半量换液1次。为了探索甲状腺激素对垂体前叶细胞合成分泌激素的影响，采用Transwell系统将大鼠甲状腺细胞与垂体前叶细胞共培养。将1×104个垂体前叶细胞接种在腔室的底板中，并将3×104个甲状腺细胞接种在上腔室中。共培养48 h后，加入30 μmol/L锂盐处理细胞24 h。随后收集垂体前叶细胞，用于后续实验。
淫羊藿苷处理大鼠垂体前叶细胞：分别使用不同剂量(0，10，30，50，70，100 μmol/L)淫羊藿苷处理大鼠垂体前叶细胞24 h，收获细胞检测细胞活力，评估淫羊藿苷对垂体前叶细胞的毒性剂量。随后使用50，70，100 μmol/L的淫羊藿苷处理锂盐诱导的垂体前叶细胞24 h，收获细胞检测实验指标。
(2)载体构建及转染：根据GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GenBank)中LHX4基因序列，采用Oligo 6.0软件设计引物，并交由上海生工合成。将测序正确的LHX4基因克隆到pcDNA-3.1载体中，构建pcDNA-LHX4表达载体。采用siDESIEN软件设计引物，BLAST对比序列同源性，靶向LHX4基因的siRNA序列由上海生工合成。分别使用miR-17-5p模拟物(mimic)、miR-17-5p抑制剂(inhibitor)、模拟物阴性对照(NC mimic)、抑制剂阴性对照(NC inhibitor)转染锂盐处理前和处理后的大鼠垂体前叶细胞，或使用pcDNA-LHX4过表达载体、LHX4 siRNA、pcDNA3.1空载体、NC-siRNA转染锂盐处理后的大鼠垂体前叶细胞，所有转染均使用Lipofectamine®3000根据制造商的说明进行。
(3)实时荧光定量PCR：检测LHX4的mRNA水平和miR-17-5p的表达，按照TRIZOL试剂盒说明书提取各组垂体前叶细胞总RNA。Superscript III反转录酶用于合成cDNA模板。用SYBR ExScript qPCR试剂盒在以下条件下进行：95 ℃预变性2 min，94 ℃变性15 s，55 ℃退火25 s，在72 ℃延伸15 s，进行35个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
实时荧光定量PCR引物序列如下：GAPDH上游5′‐GAC TCA TGA CCA CAG TCC ATG C‐3′, 下游5′‐AGA GGC AGG GAT GAT GTT CTG‐3′；U6上游5′‐CTC GCT TCG GCA GCA CA‐3′，下游5′‐AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT‐3′；miR-17-5p上游5′‐CGG CGG CAA AGT GCT TAC AG‐3′, 下游5′‐GTG CAG GGT CCG AGG T‐3′；LHX4上游5′‐AGC GAC TCA CCT GTC AAG TG‐3′，下游5′‐TAT CTC TGG GCC AGG CTT CT‐3′。依据2-ΔΔCt法计算各样本相对表达量。
(4) Western印迹法检测蛋白表达：检测LHX4、PROP1和HESX1的蛋白表达。将各组大鼠垂体前叶细胞按照每孔1×105的浓度接种于6孔板，24 h后换液，进行无血清培养基培养。采用BCA法进行蛋白定量，各取15 μL样品进行SDS-PAGE，再将蛋白转移至膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗：鼠抗LHX4(1∶1 000，ab50790)、兔抗PROP1(1∶500，ab172084)、鼠抗HESX1(1∶500，ab67728)和兔抗GAPDH(1∶2 500，ab9485)，4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000，ab150077)或山羊抗鼠二抗(1∶2 000，ab6728)37 ℃孵育45 min，用ECL液显影，使用化学发光试剂盒在化学发光系统检测，随后结果采用Image-Pro Plus 6软件(Media Cybernetics)分析，以待测蛋白与内参照GAPDH的灰度值比值作为蛋白的相对表达量。
(5)CCK-8实验检测细胞活力：将各组大鼠垂体前叶细胞按照每孔1×105的浓度接种于96孔板中，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基制成单细胞悬液，置于37 ℃、体积分数5%CO2的条件下培养。每组设5个复孔，待细胞长至80%融合时，于转染后48 h加入20 μL CCK-8溶液。培养24 h，于酶标仪450 nm处检测吸光度(A)值。取5孔A值的平均数，按照下列公式计算细胞相对活力：细胞相对活力(%)=处理组A/对照组A×100%。
(6)激素水平检测：根据制造商的说明，通过ELISA试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)测定大鼠垂体前叶细胞、甲状腺功能减退大鼠血清中促卵泡激素、生长激素和促甲状腺激素水平。
(7)生物信息学分析及双荧光素酶报告基因实验：利用PITA(https://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html)数据库预测miR-17-5p的靶基因。设计合成含有LHX4 3’UTR野生型(LHX4-Wt)或突变型(LHX4-Mut)片段的pmirGLO双荧光素酶报告基因质粒。将上述质粒与miR-17-5p mimic或NC mimic共转染至HEK-293T细胞中，48 h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。
(8)RNA结合蛋白免疫沉淀实验检验miR-17-5p和LHX4的结合：使用RNA结合蛋白免疫沉淀裂解缓冲液裂解大鼠垂体前叶细胞，并将100 μL裂解物与含有磁珠的缓冲液一起温育，所述磁珠与LHX4抗体(1∶20)或对照正常兔免疫球蛋白(IgG，1∶200)共同孵育。IgG作为阴性对照。然后将蛋白酶K缓冲液添加到样品中以消化蛋白质。最后，用Trizol试剂盒从珠子中分离结合的RNA，并用实时荧光定量PCR测定纯化的RNA。
1.5 主要观察指标
细胞检测指标：①细胞活力；②miR-17-5p表达水平；③LHX4、PROP1和HESX1蛋白表达水平；④生长激素、促卵泡激素和促甲状腺激素的分泌水平。
动物实验检测指标：①大鼠体质量；②大鼠脑垂体中miR-17-5p表达水平；③大鼠脑垂体中LHX4、PROP1和HESX1蛋白表达水平；④大鼠血清中生长激素、促卵泡激素和促甲状腺激素的分泌水平。
1.6 统计学分析文章统计学方法已经西安市儿童医院生物统计学专家审核。数据均采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析，呈正态分布的计量资料以x±s表示。采用ANOVA方差分析、Dunnett-t法比较总体和总体中两样本均数之间的差异。以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

全垂体功能降低时会造成联合性垂体激素缺乏症，是一类以生长激素缺乏伴随一至多种垂体激素缺乏为特征的疾病，垂体性侏儒多伴垂体功能降低[16]，临床表现除身材矮小外还包括甲状腺功能减低(甲减)、性发育障碍和肾上腺皮质功能减退[17]。此病是各种原因使垂体激素分泌功能部分或完全丧失的结果，临床上与发病年龄、性别和激素种类、分泌受损程度有关。下丘脑-垂体-肾上腺甲状腺功能减退症是由于各种原因引起垂体合成分泌激素不足所造成的一种疾病，在新生儿中发病率约为1∶4 000，因地区不同存在差异，且女性与男性的比例为2∶1[18]。研究发现，甲状腺功能减退患者血清生长激素水平降低，生长激素对刺激试验的反应减低[19-20]。OHARA等[21]的研究证实，甲状腺功能减退女性患者伴有性激素水平紊乱，促卵泡激素水平降低，是导致女性不孕的主要原因。此外，有报道称甲状腺功能减退症患者的促甲状腺激素、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白B、超敏C-反应蛋白及血管内皮素1水平均高于正常人[22]。传统中药的开发已成为新药研发的途径之一，许多中药及其活性成分可诱导调控人体激素合成水平并改善腺体发育。低中高剂量葛根素能提高大鼠血清生长激素水平并能继续保持较高水平[23-24]，故可利用传统医学探究有效的成分，提高甲状腺功能减退症的临床治疗效果。淫羊藿苷具有广泛的药理学和生物学特性，包括抗炎、抗骨质疏松和抗衰老特性以及促进毛发生长活性等作用，研究报道淫羊藿苷通过下丘脑-垂体-肾上腺轴激素分泌抑制炎症，浓度高达150 μmol/L时未产生任何细胞毒性作用，70 μmol/L时可显著促进细胞活力[13]。此次研究发现不同浓度淫羊藿苷能够缓解大鼠垂体前叶细胞合成分泌生长激素、促卵泡激素以及促甲状腺激素激素紊乱，以中浓度70 μmol/L效果最为显著。
研究报道miR-17-5p在合并垂体激素缺乏症中显著高表达，可能作为合并垂体激素缺乏症儿童的诊断生物标志物。PROP1和HESX1基因被认为能促进垂体的发育，是垂体前叶细胞活力的标志蛋白[25-26]。有研究报道，内分泌干扰物氯氰菊酯通过促进miR-17-5p、miR-330-3p和miR-331-3p表达引起大鼠甲状腺功能减退[15]。此次研究发现淫羊藿苷干预大鼠垂体前叶细胞显著下调miR-17-5p表达，上调PROP1和HESX1蛋白水平；转染miR-17-5p mimic细胞活力降低，生长激素和促卵泡激素分泌增加，促甲状腺激素含量降低，PROP1和HESX1蛋白水平明显减少。
作者进一步检测发现LHX4是miR-17-5p的靶基因，并且抑制miR-17-5p的表达。LHX4同源域转录因子是哺乳动物脑下垂体和脊髓运动神经元正确发育所必需的[27]。LHX4基因突变是复杂疾病的基础，其特征是合并垂体激素缺乏症，在特定情况下，可能由神经系统异常引起的颈部旋转丧失[28]。研究表明在小鼠中，LHX4表达对于正常垂体器官发生至关重要，因为与垂体前叶中产生激素的细胞类型以及发育过程中垂体特异性基因的激活相关。有研究表明，LHX4基因突变导致垂体发育不全和多发性垂体激素缺乏症[29-30]。这与此次研究结果类似，在甲状腺激素降低的垂体前叶细胞和甲状腺功能减退大鼠的激素合成分泌过程中LHX4的表达量升高，并且过表达LHX4能够逆转锂盐对垂体前叶细胞合成分泌激素的抑制作用，显著增加生长激素和促卵泡激素分泌，减少促甲状腺激素水平。
综上所述，此次研究发现淫羊藿苷可能通过调控miR-17-5p/LHX4轴改善新生大鼠甲状腺功能减退引起的垂体合成分泌激素不足。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

淫羊藿苷改善甲状腺功能减退模型大鼠的垂体发育

Icariin improves pituitary development in hypothyroidism model rats

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