淫羊藿苷增强自噬促进小鼠前成骨细胞的分化

doi:10.12307/2022.011

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (1): 64-69.doi: 10.12307/2022.011

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

淫羊藿苷增强自噬促进小鼠前成骨细胞的分化

杨冰璇1 ，姜涛2，贾敏3，李朋4，廖荣臻4，李钊4，邵敏4

1广州中医药大学，广东省广州市 510405；2广东省第二中医院，广东省广州市 510095；3南方医科大学皮肤病医院，广东省广州市 510000；4广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510240

收稿日期:2021-02-22 修回日期:2021-02-26 接受日期:2021-03-31 出版日期:2022-01-08 发布日期:2021-10-23
通讯作者: 李钊，主任医师，硕士生导师，广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510240 邵敏，主任医师，博士生导师，广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510240
作者简介:杨冰璇，女，1995年生，广东省揭阳市人，汉族，广州中医药大学在读硕士，主要从事骨质疏松与骨关节疾病研究。
基金资助:
广州市科技计划项目(201707010463)，项目负责人：邵敏；国家自然科学基金面上项目(81373654)，项目负责人：邵敏

Icariin promotes differentiation of mouse preosteoblasts via activating autophagy

Yang Bingxuan1, Jiang Tao2, Jia Min3, Li Peng4, Liao Rongzhen4, Li Zhao4, Shao Min4

1Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 2Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital, Guangzhou 510095, Guangdong Province, China; 3Dermatology Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; 4The Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China

Received:2021-02-22 Revised:2021-02-26 Accepted:2021-03-31 Online:2022-01-08 Published:2021-10-23
Contact: Li Zhao, Chief physician, Master’s supervisor, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China Shao Min, Chief physician, Doctoral supervisor, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China
About author:Yang Bingxuan, Master candidate, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangzhou Science and Technology Planning Project, No. 201707010463 (to SM); the National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81373654 (to SM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

NF-κB信号通路：是调控细胞增殖、分化、炎症反应的重要信号通路之一。核转录因子κB(NF-κB)在抑制成骨细胞形成和促进破骨细胞形成过程中起关键作用。
自噬：是由自噬相关基因(ATG)介导的一种溶酶体降解途径，在细胞、组织和有机体稳态中发挥基础作用。自噬保护生物体免受各种疾病侵害，包括感染、癌症、神经退行性病变、衰老和心脏病等。

背景：研究发现，淫羊藿苷可促进小鼠前成骨细胞增殖分化。核因子κB信号通路和细胞自噬在成骨细胞分化调节中发挥重要作用，两者是否参与调节淫羊藿苷对小鼠前成骨细胞增殖分化的影响尚不清楚。
目的：探讨淫羊藿苷对小鼠前成骨细胞增殖分化的影响以及核因子κB信号通路和细胞自噬在其中的作用。
方法：①筛选出淫羊藿苷的最佳干预浓度：将小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞分为空白对照组及不同浓度(0.01，0.1，1，10，100 μmol/L)的淫羊藿苷组，MTS检测淫羊藿苷干预后各组小鼠前成骨细胞增殖活性；茜素红染色评估成骨分化水平；Western blot检测淫羊藿苷干预后各组小鼠前成骨细胞成骨分化能力和自噬活性；②加入3-甲基腺嘌呤抑制自噬：实验设置4组，对照组、3-甲基腺嘌呤组、淫羊藿苷组、3-甲基腺嘌呤+淫羊藿苷组，茜素红染色观察细胞矿化结节；Western blot检测细胞碱性磷酸酶、Runx2、p62、LC3、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表达情况。

结果与结论：①淫羊藿苷能促进小鼠前成骨细胞增殖，浓度为10 μmol/L时效果最明显(P < 0.05)；10 μmol/L淫羊藿苷组矿化结节形成明显多于空白对照组，碱性磷酸酶、Runx2蛋白表达显著增加(P < 0.05)；与空白对照组相比，10 μmol/L淫羊藿苷组Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著增加，p62表达减少(P < 0.05)；②予3-甲基腺嘌呤抑制自噬后，与淫羊藿苷组相比，3-甲基腺嘌呤+淫羊藿苷组碱性磷酸酶、Runx2、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达减少，p62表达增加(P < 0.05)；③与对照组相比，淫羊藿苷组p-p65/p65表达减少(P < 0.05)；④结果提示，淫羊藿苷可能通过抑制核因子κB信号通路和增强自噬促进MC3T3-E1细胞成骨分化。

https://orcid.org/0000-0003-1678-3110(杨冰璇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 淫羊藿苷, 自噬, 成骨细胞, 细胞分化, NF-κB信号通路

Abstract: BACKGROUND: Studies have found that icariin can promote the proliferation and differentiation of mouse preosteoblasts. Nuclear factor-κB signaling pathways and autophagy play an important role in the regulation of osteoblast differentiation. Whether they are involved in icariin promoting the proliferation and differentiation of mouse preosteoblasts remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of icariin on the proliferation and differentiation of mouse preosteoblasts and the role of nuclear factor-κB signaling and autophagy.
METHODS: (1) Screening out the best intervention concentration of icariin: Mouse preosteoblasts MC3T3-E1 cells were divided into control group and various icariin groups (0.01, 0.1, 1, 10, 100 μmol/L). MTS was used to detect the proliferation activity of mouse preosteoblasts from different groups after icariin intervention. Osteogenic differentiation was assessed by Alizarin red staining. The osteoblastic differentiation ability and autophagy activity in mouse preosteoblasts from different groups were evaluated by western blot assay after icariin intervention. (2) 3-Methyladenine was added to inhibit autophagy. Four groups were set up: control group, 3-methyladenine group, icariin group, and 3-methyladenine + icariin group. Alizarin red staining was used to observe the mineralized nodules. Western blot assay was utilized to determine the expression levels of alkaline phosphatase, Runx2, p62, LC3, NF-κB p65 and p-NF-κB p65 protein.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Icariin could promote the proliferation of mouse preosteoblasts and the effect was the most obvious at 10 μmol/L (P < 0.05). The formation of mineralized nodules in the 10 μmol/L icariin group was significantly more than that in the control group and the expression levels of alkaline phosphatase and Runx2 protein were significantly increased (P < 0.05). Compared with the control group, the expression levels of Beclin1, LC3 II/LC3 I increased significantly and the expression of p62 decreased in the 10 μmol/L icariin group (P < 0.05). (2) After 3-methyladenine inhibited autophagy, compared with the icariin group, the expression of alkaline phosphatase, Runx2, LC3 II/LC3 I decreased and the expression of p62 increased in the 3-methyladenine + icariin group (P < 0.05). (3) Compared with the control group, the expression of p-p65/p65 decreased in the 10 μmol/L icariin group (P < 0.05). (4) These results indicate that icariin may promote osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells by down-regulation of the nuclear factor-κB signaling and enhancing autophagy.

Key words: icariin, autophagy, osteoblasts, cell differentiation, nuclear factor-κB signaling pathway

中图分类号:

杨冰璇, 姜涛, 贾敏, 李朋, 廖荣臻, 李钊, 邵敏. 淫羊藿苷增强自噬促进小鼠前成骨细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 64-69.

Yang Bingxuan, Jiang Tao, Jia Min, Li Peng, Liao Rongzhen, Li Zhao, Shao Min. Icariin promotes differentiation of mouse preosteoblasts via activating autophagy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(1): 64-69.

图/表（结果） 5

2.1 淫羊藿苷促进MC3T3-E1细胞增殖 MTS检测结果见图1。与空白对照组相比，0.01，0.1，1，10 μmol/L淫羊藿苷组培养24，48 h后，MC3T3-E1细胞的增殖能力均提高(P < 0.05)；当淫羊藿苷浓度为10 μmol/L时，效果最明显，说明淫羊藿苷能促进成骨细胞增殖。

2.2 淫羊藿苷促进MC3T3-E1细胞成骨分化成骨诱导液培养21 d后，染色结果见图2A：1 μmol/L和10 μmol/L淫羊藿苷组与空白对照组相比，矿化结节形成增加(P < 0.05)，说明淫羊藿苷能促进MC3T3-E1成骨细胞钙结节的形成从而促进成骨分化。Western blot结果见图2C-E：与空白对照组相比，0.1，1，10 μmol/L淫羊藿苷组Runx2蛋白的表达水平均显著增强(P < 0.05)；10 μmol/L淫羊藿苷组能够显著提高碱性磷酸酶蛋白的表达量(P < 0.05)。结果进一步表明淫羊藿苷能促进MC3T3-E1细胞成骨分化。

2.3 淫羊藿苷增强MC3T3-E1细胞自噬见图3。与空白对照组相比，在0.1，1，10 μmol/L淫羊藿苷组中自噬蛋白Beclin 1和LC3蛋白相对表达量呈浓度依赖性地增加，同时p62蛋白表达量逐渐减少，提示淫羊藿苷能增强MC3T3-E1细胞自噬。当淫羊藿苷浓度为10 μmol/L时，效果最明显(P < 0.05)。综合上述结果，此次研究选择10 μmol/L作为后续实验的干预浓度。

2.4 抑制自噬逆转淫羊藿苷促MC3T3-E1细胞成骨分化为了进一步研究淫羊藿苷是否通过自噬增强MC3T3-E1细胞的成骨性，后续实验分为4组：对照组、3-甲基腺嘌呤组、淫羊藿苷组、3-甲基腺嘌呤+淫羊藿苷组处理细胞，见图4。见图4A，D，E所示：加入3-甲基腺嘌呤后，与对照组相比，3-甲基腺嘌呤组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降，而p62蛋白的水平增加(P < 0.05)；与淫羊藿苷组相比，3-甲基腺嘌呤+淫羊藿苷组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降，而p62蛋白的水平增加(P < 0.05)，说明3-甲基腺嘌呤可以抑制10 μmol/L淫羊藿苷对自噬的促进作用。见图4A-C所示：与对照组相比，淫羊藿苷组能显著促进成骨分化蛋白碱性磷酸酶、Runx2的表达(P < 0.05)；并且当自噬被抑制后，与淫羊藿苷组相比，3-甲基腺嘌呤+淫羊藿苷组碱性磷酸酶、Runx2表达水平的作用减弱(P < 0.05)。见图4F结果显示：3-甲基腺嘌呤抑制自噬后，与淫羊藿苷组相比，3-甲基腺嘌呤+淫羊藿苷组矿化结节形成显著减少。Western blot分析结果和茜素红染色结果一致，说明抑制自噬逆转10 μmol/L淫羊藿苷促MC3T3-E1细胞成骨分化。

2.5 淫羊藿苷抑制NF-κB信号通路 Western blot检测小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞中p65蛋白和p-p65蛋白的表达情况，见图5。与对照组相比，淫羊藿苷组p-p65的表达明显下降，p-p65/p65比值下降(P < 0.05)，表明淫羊藿苷能抑制NF-κB信号通路。

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引言

骨质疏松症是一种以骨量减少和骨脆性增加为特征的疾病，骨量和骨微结构的保持依赖于成骨细胞和破骨细胞功能的动态平衡。随着人口的老龄化，骨质疏松已成为亟待解决的全球公共健康问题[1]。研究发现雌激素替代疗法能有效预防和治疗绝经后骨质疏松症，但同时也增加了绝经后女性患心血管疾病和乳腺癌等疾病的风险，不建议作为长期治疗方法[2]，因此寻找合适的药物治疗骨质疏松症是迫切且必要的。传统中药中的植物雌激素由于在结构和功能于上与人体雌激素相似，且没有严重的不良反应，在骨质疏松症的应用研究中逐渐增加[3]。淫羊藿苷(icariin，ICA)是从淫羊藿中提取的黄酮类化合物[4]，其结构与雌激素相似，且具有抗炎症[5-6]、抗肿瘤[7]、抗抑郁和抗氧化等多种生物活性[8-10]，临床上可用于改善骨质疏松[11]，但确切机制不明。
自噬是由自噬相关基因(ATG)介导的一种溶酶体降解途径，在细胞、组织和有机体稳态中发挥基础性作用[12- 13]。核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是骨质疏松症中抑制骨形成的关键因子[14]，其信号通路的激活会抑制成骨细胞的功能[15]。NF-κB信号通路和细胞自噬在成骨细胞分化调节中发挥重要作用[16]。为此，该研究探讨淫羊藿苷对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响及NF-κB信号通路与细胞自噬在其中的作用。

自噬活性被激活，抑制自噬抑制成骨分化能力。目前有文献发现淫羊藿苷对软骨细胞的自噬和凋亡具有良好的调节作用。

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，多组间均数比较采用单因素方差分析和LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2020年1至12月在广州中医药大学岭南医学研究中心骨伤科实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1 Subclone 14)从中国科学院细胞库购买。
1.3.2 实验主要药物与试剂淫羊藿苷(icariin)购自美国sigma公司，HPLC级(≥94%)；α-MEM培养基购自美国HyClone公司；胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；Runx2
(ab23981)、碱性磷酸酶(ab832J9)、Beclin 1(ab207612)抗体均购自Abcam公司；LC3B抗体(#3868)、Phospho-NF-κB p65抗体(#3033)和NF-κB p65抗体(#8242)均购自Cell Signaling公司；p62抗体(18420-1-AP)和β-Actin抗体(66009-1-lg)均购自Proteintech公司；MTS细胞增殖试剂盒购自贝博生物科技有限公司；3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)购自上海源叶生物。
1.4 实验方法
1.4.1 配制淫羊藿苷溶液将10 mg淫羊藿苷溶解于148 μL二甲基亚砜中制成100 mmol/L的淫羊藿苷储备液，分装，保存于-20 ℃冰箱；用α-MEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)，将淫羊藿苷储备液稀释为以下浓度：0.01，0.1，1，10，100 μmol/L。
1.4.2 细胞培养 MC3T3-E1细胞接种于α-MEM培养基中(含体积分数10%胎牛血清)，置于37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱静置培养。等待细胞生长到对数期时，消化细胞，然后传代。密切观察细胞生长状态，当细胞生长融合率达到80%时，传代1次，取第3，4代细胞进行实验。

1.4.3 MTS法检测细胞活性将MC3T3-E1细胞吹打混匀，用96孔板设置细胞为5×103个/孔均匀铺板。培养1 d后，吸走原有培养基，设置为空白对照组及0.01，0.1，1，10，
100 μmol/L淫羊藿苷组，干预培养细胞24，48 h，每组均设置6个复孔。干预结束后，按照试剂盒说明书加入10 μL MTS溶液，放置培养箱中1 h。将96孔板放置酶标仪上，设置490 nm波长检测吸光度。
1.4.4 茜素红染色将MC3T3-E1细胞吹打混匀，用12孔板设置细胞为5×104个/孔均匀铺板，分为空白对照组及0.01，0.1，1，10，100 μmol/L淫羊藿苷组。淫羊藿苷各组分别用含50 mg/L抗坏血酸、10 mol/L β-甘油磷酸钠的不同剂量淫羊藿苷成骨诱导液干预培养细胞3周。观察细胞状态后吸去培养基，用PBS洗涤细胞2次，多聚甲醛浸泡30 min固定细胞形态，PBS洗涤2次去除多聚甲醛。配置体积分数为0.2%的茜素红染液将细胞避光染色30 min，室温静置。染色后的细胞用蒸馏水冲洗3次。大体观察是否有橘红色沉淀，镜下观察细胞是否有矿化结节。
1.4.5 Western blot检测蛋白表达将MC3T3-E1细胞吹打混匀，用6孔板设置细胞为1×105个/孔均匀铺板，分为空白对照组及0.01，0.1，1，10，100 μmol/L淫羊藿苷组。培养1 d后，更换各组淫羊藿苷成骨诱导液干预培养2 d，用PBS将干预后的MC3T3-E1细胞洗涤2次，加入RIPA裂解缓冲液裂解细胞提取蛋白质。通过SDS-PAGE分离，将蛋白转移到PVDF膜上，用相应的一抗和二抗进行孵育检测。使用的抗体包括Runx2、碱性磷酸酶、Beclin 1、LC3、p62、Phospho-NF-κB p65、NF-κB p65一抗及对应的二抗。将膜置于化学发光成像系统中显影，采用ImageJ 软件分析结果，计算各条带的灰度值。
1.4.6 加入自噬抑制剂后分组检测相关指标经上述实验筛选出淫羊藿苷的最佳干预浓度(10 μmol/L)作为后续实验的干预浓度，加入5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3MA)抑制自噬。实验设置分组为：对照组、3-甲基腺嘌呤组(5 mmol/L)、淫羊藿苷组(10 μmol/L)、3-甲基腺嘌呤
(5 mmol/L)+淫羊藿苷组(10 μmol/L)。
(1)茜素红染色观察细胞矿化结节：用12孔板设置细胞为5×104个/孔均匀铺板，按组别每孔分别加入相应溶液100 μL。检测步骤同1.4.4。
(2)Western blot检测细胞中碱性磷酸酶、Runx2、p62、LC3、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表达：用6孔板设置细胞为1×105个/孔均匀铺板，按组别每孔分别加入相应溶液100 μL。检测步骤同1.4.5。
1.5 主要观察指标 ①淫羊藿苷干预后，小鼠前成骨细胞增殖情况及茜素红染色结果；前成骨细胞碱性磷酸酶、Runx2、Beclin1、LC3、p62蛋白的表达情况；②淫羊藿苷和3-甲基腺嘌呤共同干预后，小鼠前成骨细胞中碱性磷酸酶、Runx2、p62、LC3、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表达情况以及茜素红染色情况。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计分析，实验数据以x±s表示，所有实验重复3次。两组间均数比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较进行LSD检验。所有统计分析结果以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨质疏松症的主要特征是骨形成受抑制而骨吸收增加[1]，使患者骨骼脆弱，骨折风险增加[17]。淫羊藿苷是一种黄酮类化合物，具有类似雌激素的性质，可诱导骨形成和抑制骨吸收。研究表明，在卵巢切除术引起的骨质疏松症大鼠中，采用淫羊藿苷治疗有效减轻了骨丢失[18]。
成骨细胞是骨形成最关键的功能细胞，其增殖和分化活性是成骨的关键[19-21]。MTS结果显示淫羊藿苷能促进MC3T3-E1细胞增殖，浓度为10 μmol/L时效果最明显。碱性磷酸酶是成骨分化的早期标志，通常碱性磷酸酶活性越高，分化越成熟[22]。Runx2在早期也对细胞成骨分化起重要作用，是众多成骨相关通路的下游转录因子，Runx2转录减少会导致成骨分化水平降低[23]。此次实验通过对碱性磷酸酶、Runx2进行Western blot检测，发现与对照组相比，10 μmol/L
淫羊藿苷处理组碱性磷酸酶、Runx2蛋白的表达量均显著增加，同时矿化结节形成明显增加，表明淫羊藿苷能促进MC3T3-E1细胞成骨分化。
自噬是细胞分化过程中合适的能量补充过程。自噬过程中产生的降解物质被循环利用，可作为细胞代谢的营养供
给[24]。在成骨分化过程中，自噬活性被激活，抑制自噬抑制成骨分化能力[25]。目前有文献发现淫羊藿苷对软骨细胞的自噬和凋亡具有良好的调节作用[26]。另有报道淫羊藿苷可以通过增加自噬活性来增强骨髓间充质干细胞的成骨分化，从而预防小鼠卵巢切除术引起的骨丢失[27]。为了阐明自噬是否参与了淫羊藿苷促进MC3T3-E1细胞成骨分化，此次实验对LC3、Beclin1和p62蛋白进行Western blot检测。微管相关蛋白LC3调控自噬体的发生，LC3在正常条件下以LC3Ⅰ的形式存在，当自噬被激活时，可以观察到LC3Ⅰ到LC3Ⅱ的转化[28]，
LC3Ⅱ/LC3Ⅰ逐渐增加[29]。Beclin1是自噬体形成过程中的另一个必需蛋白[30]，它不仅是PI3K复合体的组成部分，还是主要的自噬调节因子[31]。p62/SQSTM1是自噬的选择性底物，在自噬小体与溶酶体结合降解内容物时被大量消耗[32]。因此，在自噬激活过程中，Beclin1和LC3Ⅱ上调，同时p62下降；相反，抑制自噬导致Beclin1和LC3Ⅱ减少，并导致p62积累。此次研究表明，随着淫羊藿苷浓度升高促进MC3T3-E1细胞成骨分化的同时，自噬水平逐渐升高，提示淫羊藿苷可能通过增强自噬影响MC3T3-E1细胞成骨分化。敲除自噬相关基因(ATG)和使用PI3K激酶药理阻断剂3-甲基腺嘌呤是抑制自噬的最常见方法[33]。为了反证自噬在淫羊藿苷促进MC3T3-E1细胞成骨分化中的作用，后续实验采用3-甲基腺嘌呤抑制自噬。实验结果显示与淫羊藿苷组相比，3-甲基腺嘌呤+淫羊藿苷组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降，而p62蛋白的含量增加，提示3-甲基腺嘌呤可以抑制10 μmol/L淫羊藿苷对自噬的促进作用；同时成骨分化蛋白碱性磷酸酶、Runx2的表达减弱，提示抑制自噬水平可以抑制10 μmol/L淫羊藿苷对MC3T3-E1细胞成骨分化的促进作用，进而说明淫羊藿苷通过增强自噬影响MC3T3-E1细胞成骨分化。
NF-κB是在调控细胞的增殖、分化、炎症中重要的转录因子[34]，在抑制成骨细胞形成和促进破骨细胞形成过程中起关键作用[35]。已知淫羊藿苷通过抑制NF-κB信号通路，诱导人牙周膜成纤维细胞增殖、迁移以及成骨分化[36]。p-p65是NF-κB通路的关键蛋白，能显示NF-κB信号通路的激活程度。研究发现淫羊藿苷能明显降低MC3T3-E1细胞成骨分化过程中p-p65的表达水平，提示淫羊藿苷通过抑制p-p65调控NF-κB信号通路。已经表明NF-κB可反式激活许多自噬相关基因(如Beclin1)[31]，NF-κB p65以及其他NF-κB相关分子可以作为自噬降解的靶点，同时调控自噬过程[37]。自噬与NF-κB信号通路是有重叠的，它们之间的相互影响仍有争议，取决于细胞类型和刺激类型[38]。研究发现低浓度脂多糖通过成骨细胞中的NF-κB信号通路激活自噬并促进细胞增殖，从而促进骨折愈合[39- 40]。另有报道NF-κB信号通路抑制剂SN50培养的小鼠成骨细胞MC3T3-E1中自噬体表达且呈剂量依赖性升高[16]。又有报道淫羊藿苷通过抑制NF-κB信号通路降低肿瘤坏死因子α诱导的软骨细胞凋亡和自噬抑制[26]。因此作者认为淫羊藿苷可能通过抑制NF-κB信号通路而增强自噬，从而促进MC3T3-E1细胞成骨分化。
综上所述，自噬在淫羊藿苷促进成骨细胞分化中起到关键作用，有望为淫羊藿苷治疗骨质疏松提供新的作用靶点，其具体的作用机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。研究未能检测淫羊藿苷对MC3T3-E1细胞在NF-κB信号通路上下游其他相关蛋白表达水平的影响，未能加入NF-κB通路抑制剂PDTC进行研究，故在未来的研究中将对淫羊藿苷靶向调节NF-κB通路作用进行深入研究。

自噬活性被激活，抑制自噬抑制成骨分化能力。目前有文献发现淫羊藿苷对软骨细胞的自噬和凋亡具有良好的调节作用。

淫羊藿苷增强自噬促进小鼠前成骨细胞的分化

Icariin promotes differentiation of mouse preosteoblasts via activating autophagy

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