3D打印淫羊藿苷/脱钙骨基质修复兔股骨髁骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2313

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (34): 5461-5466.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2313

• 组织工程骨材料Tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

3D打印淫羊藿苷/脱钙骨基质修复兔股骨髁骨缺损

张虎雄¹，李微²，杨物鹏¹，新苏雅拉图¹

¹鄂尔多斯市中心医院骨科，内蒙古自治区鄂尔多斯市 017000；²鄂尔多斯应用技术学院，内蒙古自治区鄂尔多斯市 017000

收稿日期:2019-12-06 修回日期:2019-12-12 接受日期:2020-01-11 出版日期:2020-11-08 发布日期:2020-09-11
通讯作者: 李微，讲师，鄂尔多斯应用技术学院，内蒙古自治区鄂尔多斯市 017000
作者简介:张虎雄，男，1982年生，内蒙古自治区鄂尔多斯市人，汉族，副主任医师，主要从事骨科创伤和骨科康复研究。

3D-printed icariin/decalcified bone matrix material promotes the repair of femoral condyle defects in rabbits

Zhang Huxiong¹, Li Wei², Yang Wupeng¹, New Suyaratu¹

¹Department of Orthopedics, Ordos Central Hospital, Ordos 017000, Inner Mongolia Autonomous Region, China; ²Ordos Institute of Applied Technology, Ordos 017000, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2019-12-06 Revised:2019-12-12 Accepted:2020-01-11 Online:2020-11-08 Published:2020-09-11

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

脱钙骨基质：主要由93%胶原、5%可溶性蛋白及2%残余矿化基质组成的商业化生物材料，包含不同浓度的骨形态发生蛋白、生长因子及转化生长因子，具备良好的骨传导与骨诱导能力，可以单独或联合其他材料广泛用于骨折、骨不连、骨肿瘤、骨融合、股骨头坏死等治疗中。

结构模型指数：是描述骨小梁组成结构中板层结构和杆状结构比例的参数。如果结构中骨小梁主要为板层结构，那么结构模型指数接近于0；如果结构中骨小梁主要为杆状结构，那么结构模型指数接近于3，该值越小骨小梁越成熟。

背景：淫羊藿苷可促进骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化，具有良好的促成骨性能。脱钙骨基质具备良好的骨传导与骨诱导能力，可以单独或联合其他材料广泛用于骨修复中。

目的：观察3D打印淫羊藿苷/脱钙骨基质材料的缓释性能、细胞相容性与体内成骨性能。

方法：利用3D打印技术制备淫羊藿苷/脱钙骨基质材料与脱钙骨基质材料，检测淫羊藿苷/脱钙骨基质材料的体外缓释性能。将骨髓间充质干细胞分别接种于两种材料表面，以单独培养的细胞为对照，于设定的时间点进行活/死染色、MTT、碱性磷酸酶活性与骨钙素含量检测。取新西兰大白兔30只，建立股骨髁骨缺损模型后分3组处理：对照组不植入任何材料，一组植入脱钙骨基质与同种异体兔骨髓间充质干细胞复合物，另一组植入淫羊藿苷/脱钙骨基质材料与同种异体兔骨髓间充质干细胞复合物，术后4，12周进行Micro-CT、组织学与力学性能检测。

结果与结论：①3D打印淫羊藿苷/脱钙骨基质材料具有缓释性能，在28 d时淫羊藿苷释放量达总量的(54.9±7.9)%；②活/死染色显示，接种1 d后两组材料表面的细胞数量较少，随着培养时间的延长，细胞数量明显增多，至7 d时细胞形态良好，并且淫羊藿苷/脱钙骨基质材料表面的细胞更加均匀、数量更多；③MTT检测显示，淫羊藿苷/脱钙骨基质组培养7，10，14 d的细胞增殖快于其余两组(P < 0.05)；④淫羊藿苷/脱钙骨基质组培养7，10，14 d的碱性磷酸酶活性与骨钙素含量均高于其余两组(P < 0.05)；⑤术后12周Micro-CT显示，植入材料两组均可见大量的骨小梁，其中淫羊藿苷/脱钙骨基质组骨小梁数量更多、骨小梁厚度增加、骨小梁分离度更小；⑥术后12周组织学显示，植入材料两组可见大量骨组织形成，其中淫羊藿苷/脱钙骨基质组新生骨量最多；⑦淫羊藿苷/脱钙骨基质组抗压强度高于其余两组(P < 0.05)；⑧结果表明，3D打印淫羊藿苷/脱钙骨基质具有良好的缓释性能、细胞相容性与骨诱导性能。

ORCID: 0000-0002-5272-812X(张虎雄)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨缺损, 淫羊藿苷">, , 脱钙骨基质">, , 骨再生">, , 骨髓间充质干细胞">, , 骨钙素">, , 碱性磷酸酶

Abstract:

BACKGROUND: Icariin can promote the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, and has good osteogenic properties. Decalcified bone matrix material exhibits good bone conduction and bone induction. It can be used in bone repair alone or in combination with other materials.

OBJECTIVE: To investigate the sustained-release performance, cytocompatibility and osteogenesis of 3D-printed icariin/decalcified bone matrix material.

METHODS: Icariin/decalcified bone matrix materials and decalcified bone matrix materials were prepared by 3D printing technology. The in vitro sustained-release performance of the icariin/decalcified bone matrix material was detected. Bone marrow mesenchymal stem cells were inoculated on the surfaces of the two materials respectively. The cells cultured separately were used as the control. At the designated time points, the live/dead staining and MTT assay were performed, and alkaline phosphatase activity and osteocalcin content were determined. Thirty New Zealand rabbit models of femoral condyle defect were prepared and then divided into three groups. In the control group, no implant was used. In the simple decalcified bone matrix group, decalcified bone matrix and allogeneic rabbit bone marrow mesenchymal stem cells composite were implanted. In the icariin/decalcified bone matrix group, icariin/decalcified bone matrix and allogeneic rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were implanted. At 4 and 12 weeks after surgery, micro-CT and histological and mechanical properties evaluation were performed.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) 3D-printed icariin/decalcified bone matrix material exhibited sustained-release performance. At 28 days, the release of icariin was (54.9±7.9)% of total release amount. (2) The live/dead staining revealed that the number of cells on the material surface in simple decalcified bone matrix and icariin/decalcified bone matrix groups were decreased after 1 day of inoculation and significantly increased with the prolongation of culture time. At 7 days, cells grew well, and the cells on the surface of icariin/decalcified bone matrix material were more evenly distributed and increased in number. (3) MTT test showed that cells in the icariin/decalcified bone matrix group proliferated faster after 7, 10, and 14 days of culture than those in the other two groups (P < 0.05). (4) The alkaline phosphatase activity and osteocalcin content in the icariin/decalcified bone matrix group were higher than those in the other two groups after 7, 10, and 14 days of culture (P < 0.05). (5) At 12 weeks after surgery, micro-CT revealed that a large amount of bone trabeculae were observed in both simple decalcified bone matrix and icariin/decalcified bone matrix groups. The number of bone trabeculae was higher, bone trabeculae were thicker, and defect cavity was smaller in the icariin/decalcified bone matrix group than those in the simple decalcified bone matrix group. (6) At 12 weeks after surgery, histological results revealed that a large number of bone tissue was formed in both simple decalcified bone matrix and icariin/decalcified bone matrix groups, but the amount of newly formed bone was higher in the latter group. (7) The compressive strength of bone defects in the icariin/decalcified bone matrix group was higher than that in the other two groups (P < 0.05). (8) These results suggest that 3D-printed icariin/decalcified bone matrix material exhibits good sustained-release performance, cytocompatibility, and osteogenesis.

Key words: bone defectalkaline phosphatase

">, , icariin, decalcified bone matrix">, , bone regeneration">, , bone marrow mesenchymal stem cells">, , osteocalcin">, ,

中图分类号:

张虎雄, 李微, 杨物鹏, 新苏雅拉图. 3D打印淫羊藿苷/脱钙骨基质修复兔股骨髁骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(34): 5461-5466.

Zhang Huxiong, Li Wei, Yang Wupeng, New Suyaratu. 3D-printed icariin/decalcified bone matrix material promotes the repair of femoral condyle defects in rabbits[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(34): 5461-5466.

图/表（结果） 10

2.1 材料结构观察脱钙骨基质材料的大体观见图1A；扫描电镜显示脱钙骨基质材料内部可见大量孔隙，孔隙间相互连通，平均孔径大小为(459.12±88.93) μm，见图1B。

2.2 淫羊藿苷/脱钙骨基质材料的缓释性能缓释曲线显示3D打印淫羊藿苷/脱钙骨基质材料具有缓释性能，经历早期突释后药物释放逐渐平稳，至14 d时淫羊藿苷释放量达总量的(46.3±2.6)%，在28 d时淫羊藿苷释放量达总量的(54.9±7.9)%，见图2。

2.3 活/死染色结果活/死染色显示，细胞接种1 d后两组材料表面的细胞数量较少，细胞形态多为圆形；随着培养时间的延长，两组材料表面的细胞数量明显增多，至7 d时两组材料表面的细胞形态良好，并且淫羊藿苷/脱钙骨基质材料表面的细胞更加均匀、数量更多，见图3。

2.4 MTT检测结果培养1 d时，3组细胞增殖的吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；至培养3 d时，淫羊藿苷/脱钙骨基质组与脱钙骨基质组吸光度值稍高于对照组，但3组间比较差异仍然无显著性意义(P > 0.05)；培养7-14 d时，淫羊藿苷/脱钙骨基质组、脱钙骨基质组吸光度值均显著高于对照组(P < 0.05)，并且淫羊藿苷/脱钙骨基质组对应时间点的吸光度值高于脱钙骨基质组(P < 0.05)，见图4。

2.5 碱性磷酸酶活性检测结果培养1 d时，3组碱性磷酸酶活性均较低，并且3组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；随着培养时间的延长，各组碱性磷酸酶活性均有不同程度的提高，对照组碱性磷酸酶活性仍然较低，两实验组培养7，14 d的碱性磷酸酶活性显著升高，高于对照组(P < 0.05)，并且淫羊藿苷/脱钙骨基质组高于脱钙骨基质组(P < 0.05)；培养21 d时，两实验组碱性磷酸酶活性较之前明显降低，但两组仍然高于对照组(P < 0.05)，并且淫羊藿苷/脱钙骨基质组高于脱钙骨基质组(P < 0.05)，见图5。

2.6 骨钙素检测结果培养1 d时，3组骨钙素质量浓度均处于较低的水平，组间比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；随着培养时间的延长，淫羊藿苷/脱钙骨基质组与脱钙骨基质组骨钙素质量浓度逐渐升高，两组7，14，21 d的骨钙素质量浓度均显著高于对照组(P < 0.05)，并且淫羊藿苷/脱钙骨基质组对应时间点的骨钙素质量浓度均高于脱钙骨基质组(P < 0.05)，见图6。

2.7 动物体内骨缺损修复实验结果

2.7.1 组织学观察结果术后4周时，缺损组缺损区可见明显的凹陷，在缺损底部可见极少量的纤维组织；脱钙骨基质组缺损区部分修复，与周围正常软骨齐平，材料少量降解，缺损底部可见少量软骨样组织，同时组织交界处可见少量炎性细胞浸润；淫羊藿苷/脱钙骨基质组缺损部位与周围正常软骨齐平，组织交界处融合，材料部分降解，组织交界处可见少量的软骨细胞。术后12周时，缺损组缺损部位仍可见较明显的凹陷，可见部分纤维组织填充其中，未见明显的修复；脱钙骨基质组缺损表面不完整，材料几乎完全降解，缺损底部与周围组织交界处可见成片的软骨细胞团，细胞排列不规则；淫羊藿苷/脱钙骨基质组缺损部位与周围软骨基本齐平，并与周围软骨整合，材料基本降解完全，修复区可见大排列规则的软骨组织，见图7。

术后12周图像分析结果显示，缺损组、脱钙骨基质组、淫羊藿苷/脱钙骨基质组新生骨面积分别为(6.02±2.01)%，(20.36±5.13)%，(34.92±5.12)%，3组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.7.2 Micro-CT观察结果缺损组术后4周时缺损部位仅有极其少量的骨小梁形成，三维重建可见明显的空洞，术后12周时并未见明显的变化，三维重建空洞依然非常明显；脱钙骨基质组术后4周时缺损部位可见少量的骨小梁形成，骨小梁细小，三维重建可见明显的空洞，术后12周时可见大量的骨小梁，且骨小梁增粗，与周围正常骨小梁分界模糊，空洞较之前明显减小；淫羊藿苷/脱钙骨基质组术后4周时可见少量新骨生成，骨小梁较细，可见空洞，术后12周时可见大量增粗的骨小梁，与周围正常骨小梁无明显分界，仅可见较小的空洞，见图8。

骨缺损部位计量学统计结果显示，术后4周时，脱钙骨基质组骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度与骨小梁数量均明显高于缺损组(P < 0.05)，并且淫羊藿苷/脱钙骨基质组上述参数均明显高于脱钙骨基质组(P < 0.05)，但是3组间结构模型指数比较差异无显著性意义(P > 0.05)；术后12周时，脱钙骨基质组骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度与骨小梁数量均明显高于缺损组(P < 0.05)，并且淫羊藿苷/脱钙骨基质组上述参数均明显高于脱钙骨基质组(P < 0.05)，3组间结构模型指数比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.7.3 动物体内骨缺损修复力学性能检测结果术后4，12周时，脱钙骨基质组抗压强度高于缺损组(P < 0.05)，淫羊藿苷/脱钙骨基质组高于脱钙骨基质组(P < 0.05)，见表2。

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引言

临床中因骨折、骨不连、先天畸形或医源性损伤导致的骨缺损较常见，可引发骨与关节及其周围软组织发生病理性改变，进而导致机体器质性或功能性障碍。传统的自体骨移植虽具有良好的生物匹配性及修复效果，但存在增加新的创伤、来源不足等问题，使其临床应用受限^[1-2]。同种异体骨虽来源相对广泛、免疫原性较低，但其缺乏生物活性，无骨诱导作用，应用同样受限^[3-4]。近年来快速发展的组织工程学为骨缺损治疗提供了新的思路。

脱钙骨基质主要由93%胶原、5%可溶性蛋白及2%残余矿化基质组成的商业化生物材料，包含不同浓度的骨形态发生蛋白、生长因子及转化生长因子，具备良好的骨传导与骨诱导能力，可以单独或联合其他材料广泛用于骨折、骨不连、骨肿瘤、骨融合、股骨头坏死等治疗中^[5-9]。淫羊藿苷为淫羊藿的有效药理成分，具有抗骨质疏松的作用，同时其可促进成骨细胞的增殖与分化，受到越来越多的关注。研究已证实淫羊藿苷可促进骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化^[10-11]。以往已有较多关于淫羊藿苷促进骨形成的研究，例如刘宁等^[12]利用仿生涂层设计将淫羊藿负载于去蛋白牛骨无机材料中，皮下埋植实验显示该材料具有良好的异位骨诱导能力；贾丙申等^[13]将经淫羊藿苷干预的骨髓间充质干细胞接种于磷酸钙骨水泥材料中，兔股骨缺损模型证实该复合材料可有效促进新骨形成，加快骨修复；张传志等^[14-15]采用原位复合+冷冻干燥技术制备了淫羊藿苷/羟基磷灰石支架，将其与富血小板血浆微球复合构建了淫羊藿苷/富血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料，体外实验显示该材料具有良好的缓释性能，兔桡骨骨缺损实验显示该材料可促进骨缺损的愈合。但是利用3D打印技术将淫羊藿苷负载于修复材料中用于骨缺损的研究报道不多。实验通过3D打印将淫羊藿苷负载于脱钙骨基质材料中，发现该材料具有良好的缓释性能，并进一步分析了该材料的细胞相容性与体内成骨性能。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察动物实验。

1.2 时间及地点实验于2019年5至12月在内蒙古医科大学动物研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物成年雄性新西兰大白兔30只，体质量约3 kg，由内蒙古医科大学动物研究中心提供，实验动物生产许可证：SCXK(蒙)2015-0001，实验动物使用许可证：SYXK(蒙)2015-0001。实验获得内蒙古医科大学动物研究中心动物伦理委员会批准。

1.3.2 实验中的主要试剂与仪器兔骨髓间充质干细胞(货号：RBXMX-01001)购自赛业生物科技有限公司；淫羊藿苷(纯度98%)购自宝鸡市辰光生物科技有限公司；DMEM-LG培养基、胎牛血清购自北京亚米生物科技有限公司；活/死细胞染色试剂盒(Calcein AM，Ethm-1)购自北京华夏远洋科技有限公司；骨钙素放免试剂盒购自上海信帆生物科技有限公司；碱性磷酸酶酶活性检测试剂盒(E1040)购自北京普利莱基因技术有限公司；快速成形3D打印机(CR-10 V2)购自深圳市创想三维科技有限公司；扫描电镜(Axio Observer)购自苏州沃弗本精密机械有限公司；小型动物Micro-CT(LCT200)购自汇佳生物股份(中国)有限公司；万能力学试验机(WDW-1)购自上海松顿仪器制造有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 制备脱钙骨基质取市售的新鲜牛骨，制作成大小适宜的小骨粒，采用改良的Urist 法进行脱脂及脱钙处理^[16]，无水乙醇脱水2 h→乙醚脱脂1 h→风干30 min→蒸馏水清洗3次，5 min/次→0.5 mol/L盐酸脱钙→蒸馏水清洗，直至pH值=7.0→无水乙醇脱水2 h→乙醚脱脂1 h→通风干燥→⁶⁰Coγ射线照射灭菌后4 ℃保存备用。扫描电镜观察材料结构。

1.4.2 3D打印骨修复材料利用计算机辅助系统软件将材料设置为直径4 mm、高10 mm的圆柱体，然后将实验设计的模型以STL格式输入3D打印机中，调整打印路径；将脱钙骨基质材料于60 ℃水浴下溶解于有机溶剂三氯甲烷中，将淫羊藿苷缓慢加入脱钙骨基质材料溶液中并不断搅拌，脱钙骨基质材料与淫羊藿苷的质量比为4∶1，超声波震荡15 min后电磁搅拌10 h；将上述配制好的溶液加入机械挤出沉积快速成型系统内，打印样品。冷冻干燥打印的样品48 h，消毒后备用。同理制作3D打印脱钙骨基质材料。

1.4.3 材料的缓释性能取3个淫羊藿苷/脱钙骨基质材料，称质量后放入含10 mL PBS的离心管内，置于振荡器内120 r/min震荡，于设定的时间点离心获取上清，取出支架、冻干、称质量，补充等量新鲜的PBS继续震荡，采用高效液相色谱法检测上清内药物浓度，绘制药物累积释放曲线。

1.4.4 细胞的培养与传代复苏冻存的兔骨髓间充质干细胞，接种于T25培养中，加入足量的完全培养基后置于37 ℃含体积分数5%二氧化碳培养箱内孵育。24 h后更换新鲜的完全培养基，此后每2 d进行一次换液，观察细胞达到85%融合时进行消化传代。选择生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞进行后续实验。

1.4.5 细胞的接种首先将3D打印淫羊藿苷/脱钙骨基质材料与3D打印脱钙骨基质材料放入24孔板内，每孔各放1块材料，每组材料6复孔。取第3代骨髓间充质干细胞，分别接种于3D打印淫羊藿苷/脱钙骨基质材料与3D打印脱钙骨基质材料表面，接种密度为1×10⁴/孔，每孔接种100 µL，以未加入材料的单独骨髓间充质干细胞为对照；随后各孔加入含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青-链霉素的DMEM-LG培养基，置于37 ℃含体积分数5%二氧化碳培养箱内孵育。

1.4.6 活/死染色观察细胞形态与数量细胞接种1，3，7 d后进行活/死染色，严格按照试剂盒说明书操作，观察两组材料表面的细胞形态与数量。

1.4.7 MTT法检测细胞增殖细胞接种1，3，7，10，14 d后进行MTT检测，每组各取6孔，各加入15 µL MTT溶液，继续培养4 h后弃上清，加入DMSO 150 µL吸取各孔150 µL至新的96孔板内，酶标仪490 nm处检测吸光度值。

1.4.8 碱性磷酸酶活性检测细胞接种1，7，14，21 d时，每组各取8孔，吸取培养基至EP管内，将材料剪碎后与细胞以胰酶消化，同时以超声震碎细胞，2 000 r/min离心5 min后吸取上清液，按照碱性磷酸酶试剂盒说明书操作，检测各孔吸光度值，计算碱性磷酸酶活性。

1.4.9 骨钙素含量检测细胞接种1，7，14，21 d时，每组各取8孔，吸取培养基至EP管内，将材料剪碎后与细胞以胰酶消化，同时以超声震碎细胞，2 000 r/min离心5 min后吸取上清液，采用骨钙素放免试剂盒检测骨钙素浓度。

1.4.10 动物体内实验

骨缺损模型的制作与分组：将30只新西兰大白兔随机编号法分为3组，分别为缺损组、淫羊藿苷/脱钙骨基质组与脱钙骨基质组，每组10只。麻醉实验兔后将其仰卧位固定，术区备皮、消毒，逐层切开皮肤、皮下组织及关节囊后，利用钻头在双侧膝关节股骨髁部位制作直径约4 mm、深度约10 mm的骨缺损，生理盐水冲洗术区，缺损组未植入任何材料，其余两组分别植入对应的材料与兔骨髓间充质干细胞复合体(二者在体外共培养3 d，细胞接种密度为1×10⁴)，之后缝合切口。术后连续肌注青霉素3 d预防感染。术后4周、12周取股骨髁缺损部位标本，每组取5只兔，进行下列检测。

Micro-CT观察：将骨缺损标本置于40 g/L多聚甲醛中固定2 d，随后将其置于扫描盒内，设置电压为70 kV、电流114 µA，整合时间400 ms，分辨率20 µm，进行Micro-CT扫描，分析缺损区骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量、结构模型指数等参数。

组织学观察：将股骨髁缺损标本置入40 g/L多聚甲醛中固定5 d，随后置于EDTA脱钙液中30 d，剃度乙醇脱水，包埋，石蜡切片，切片厚度5 µm，行常规苏木精-伊红染色，显微镜下观察骨整合情况。利用IPP6.0图像分析软件计算新生骨面积。

力学性能检测：将标本修正为圆柱体，置于万能力学试验机的承压板上，对标本施加0.5 mm/min的载荷，检测最大抗压强度。

1.5 主要观察指标 3D打印淫羊藿苷/脱钙骨基质材料的缓释性能、细胞相容性及体内骨诱导性能。

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，所有数据均进行正态分布和方差齐性检验。服从正态分布的数据以x(_)±s表示，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间采用单因素方差分析。

讨论

在脱钙过程中，细胞外基质中可释放出多种生长因子，从而在宿主环境中发挥有效的生物活性，促进干细胞向成骨细胞分化，促进骨愈合，因此脱钙骨基质具有良好的骨传导与骨诱导性能，被广泛应用于骨缺损治疗中^[17-18]。但是脱钙骨基质的力学性能较差，并且有研究对脱钙骨基质的骨诱导能力提出了质疑^[19-20]。可能是因为不同的脱钙骨基质产品的骨形态发生蛋白量存在一定的差异，从而使脱钙骨基质的骨诱导性能存在一定的差异。为提高脱钙骨基质的力学性能与骨诱导性能，实验采用3D打印技术制备了淫羊藿苷/脱钙骨基质材料，结果显示该材料具备缓释性能，进一步对其细胞相容性与体内成骨性能进行了研究。

体外实验显示，兔骨髓间充质干细胞均可在淫羊藿苷/脱钙骨基质材料与脱钙骨基质材料表面生长与增殖，而淫羊藿苷可进一步促进脱钙骨基质材料表面骨髓间充质干细胞的生长与增殖，提示淫羊藿苷/脱钙骨基质材料具有良好的细胞相容性。碱性磷酸酶检测结果显示，脱钙骨基质组与淫羊藿苷/脱钙骨基质组的成骨分化时间过程基本一致，但是淫羊藿苷/脱钙骨基质材料的促进分化作用更强。分析其机制可能为：脱钙骨基质通过自身的骨形态发生蛋白促进了骨髓间充质干细胞的成骨分化，而淫羊藿苷进一步提高和加速了骨髓间充质干细胞的成骨分化，增强了脱钙骨基质的骨诱导性能。骨钙素检测结果显示，淫羊藿苷/脱钙骨基质材料与脱钙骨基质材料均可促进钙盐的沉积，但是淫羊藿苷/脱钙骨基质材料的促进作用更强。体外实验结果说明淫羊藿苷/脱钙骨基质材料具有良好的成骨诱导性能，与以往的研究结果一致^[21-24]。作者推测淫羊藿苷作用于骨髓间充质干细胞后，可能通过增加骨形态发生蛋白的表达促进骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化，而其与脱钙骨基质中的骨形态发生蛋白共同促进成骨。

体内骨缺损修复实验Micro-CT检测显示，缺损组无明显的组织修复，至术后12周时仍有明显缺损，证实实验造模成功；两实验组均有不同程度的骨修复，术后4，12周时该两组的骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度与骨小梁数量均明显高于缺损组，说明脱钙骨基质为骨髓间充质干细胞的增殖与分化提供了良好的三维空间，其具有骨诱导性能。术后4周时3组间的结构模型指数比较并无统计学差异，说明虽然两实验组较缺损组有较多的骨小梁形成，但骨小梁还不成熟，3组间的骨小梁成熟度并无区别；至术后12周时，脱钙骨基质组与淫羊藿苷/脱钙骨基质组的结构模型指数均低于缺损组，说明两组的骨小梁发育已较成熟，并且淫羊藿苷可进一步促进骨小梁的发育成熟。随后的组织学观察验证了Micro-CT检测结果，淫羊藿苷/脱钙骨基质组新生骨面积明显大于其余两组。实验结果显示，淫羊藿苷/脱钙骨基质组术后4周时的抗压强度已经显著高于钙骨基质组，并且至术后12周时抗压强度进一步增强，说明淫羊藿苷可提升脱钙骨基质材料的抗压强度。但是实验仅检测了抗压强度指标，作为负重骨的植骨材料还需检测弹性模量等参数，实验结果有待验证。

综合实验结果得出，3D打印淫羊藿苷/脱钙骨基质具有良好的细胞相容性与成骨诱导性能，但是其与自体骨移植的效果差异还有待进一步的研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

3D打印淫羊藿苷/脱钙骨基质修复兔股骨髁骨缺损

3D-printed icariin/decalcified bone matrix material promotes the repair of femoral condyle defects in rabbits

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